徐曉美 王瑞 吳廷全 何曉明 林毓娥

摘 要 以黃瓜感病品種‘B80為材料并通過RT-qPCR技術(shù)，針對黃瓜全基因組54個CsWRKYs基因，在瓜類疫霉菌侵染后對其進(jìn)行表達(dá)分析，并在水楊酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）處理下對受瓜類疫霉菌誘導(dǎo)（或抑制）基因進(jìn)行表達(dá)檢測，分析其可能參與的抗病相關(guān)信號通路。研究結(jié)果表明：15個CsWRKYs基因（CsWRKY3、11、13、21、22、23、26、31、34、41、44、46、48、52和56）受瓜類疫霉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，僅CsWRKY6受瓜類疫霉菌抑制下調(diào)表達(dá)。在SA和MeJA處理下，7個CsWRKYs基因（CsWRKY26、34、41、46、48、52和56）受SA誘導(dǎo)，CsWRKY44同時受SA和MeJA誘導(dǎo)，CsWRKY6受MeJA抑制下調(diào)表達(dá)，推測 7個基因（CsWRKY26、34、41、46、48、52和56）可能通過SA介導(dǎo)的信號通路調(diào)控植物對病原菌的響應(yīng)；CsWRKY6可能通過JA介導(dǎo)的信號通路調(diào)控植物防御反應(yīng)過程；CsWRKY44則可能同時參與SA和JA介導(dǎo)的抗病相關(guān)信號通路。

關(guān)鍵詞 黃瓜；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；疫病；表達(dá)分析

中圖分類號 S642.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Screening of CsWRKYs Involved in Phytophthora Blight

Resistance in Cucumber（Cucumis sativus）

XU Xiaomei1，2， WANG Rui1，2， WU Tingquan1，2， HE Xiaoming1，2， LIN Yu′e1 *

1 Vegetable Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640， China

2 Guangdong Key Lab for New Technology Research of Vegetables， Guangzhou， Guangdong 510640， China

Abstract By RT-qPCR technology， the expression patterns of 54 CsWRKYs in Phytophthora melonis（P. melonis）-susceptible cucumber cultivar‘B80were analyzed after inoculation with P. melonis and then P. melonis-induced（suppressed）CsWRKYs were analyzed under the treatment of salicylic acid（SA）and methyl jasmonate（MeJA）to investigate their signaling pathways. The results in this study showed that fifteen CsWRKYs（CsWRKY3， 11， 13， 21， 22， 23， 26， 31， 34， 41， 44， 46， 48， 52 and 56）were strongly induced and only CsWRKY6 suppressed by P. melonis. Among them， seven CsWRKYs（CsWRKY26， 34， 41， 46， 48， 52 and 56）were SA-inducible and up-regulated while CsWRKY6 was down-regulated after treatment of MeJA. CsWRKY44 was commonly up-regulated by both SA and MeJA. Based on the results above， we predicted CsWRKY26， 34， 41， 46， 48， 52 and 56 might be involved in Phytophthora blight resistance in cucumber by SA and（or）JA signaling pathway（s）.

Key words Cucumber（Cucumis sativus）； WRKY transcription factor； Phytophthora blight； Expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.02.026

黃瓜是一種重要的蔬菜作物，華南地區(qū)受高溫高濕氣候條件的影響，黃瓜疫病病害嚴(yán)重，但由于高抗疫病材料匱乏，黃瓜抗疫病育種進(jìn)展緩慢，國內(nèi)外有關(guān)黃瓜疫病抗性遺傳的研究也少有報道，謝大森等[1]認(rèn)為開展以生物技術(shù)為主要手段的抗性轉(zhuǎn)育研究是當(dāng)前瓜類疫病抗性育種中的重點。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子起源于早期真核生物并在高等植物中廣泛存在，是植物中最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一[2]，因含有保守的WRKY結(jié)構(gòu)域而得名，該結(jié)構(gòu)域由約60個氨基酸組成，靠近氨基（N）末端的7個保守氨基酸殘基WRKYGQK是該結(jié)構(gòu)域的核心序列[3]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是個龐大的基因家族。目前，水稻中已鑒定了至少有109個WRKY成員[4]，擬南芥74個[5]，玉米136個[6]，大豆133個[7]，大白菜145個[8]。最早鑒定的WRKY轉(zhuǎn)錄因子SPF1存在于甘薯中，其生物學(xué)功能是調(diào)控糖信號途徑的建立[9]。隨后大量研究表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物對生物和非生物脅迫防御反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用，同時也參與植物花粉發(fā)育[10]、種子成熟和萌發(fā)[11]、植株葉片衰老[12]等生理過程。在植物應(yīng)對生物脅迫反應(yīng)中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因主要參與了植物從基礎(chǔ)免疫到獲得抗性的多種抗病反應(yīng)過程，通過調(diào)控多通路多層次的抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響植物對病原物的生理反應(yīng)，在植物與病毒、細(xì)菌、真菌、線蟲以及昆蟲的相互作用過程中發(fā)揮重要作用[13]。Dong等[14]對72個擬南芥WRKY基因的表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中有49個基因受含無毒基因的病原菌或SA的誘導(dǎo)。在水稻中，45個被檢測的WRKY基因中有15個受稻瘟菌誘導(dǎo)后顯著表達(dá)上調(diào)，并且其中12個同時受白葉枯病菌不同程度誘導(dǎo)表達(dá)，信號通路檢測發(fā)現(xiàn)，OsWRKY45和OsWRKY62受SA誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)；OsWRKY10、OsWRKY82和OsWRKY85受JA誘導(dǎo)上調(diào)；OsWRKY30和OsWRKY83同時響應(yīng)SA和JA上調(diào)表達(dá)[15]。除擬南芥和水稻等模式植物外，隨后的研究發(fā)現(xiàn)在棉花[16]、油菜[17]、大麥[18]等大宗作物和辣椒[19-20]、大白菜[8]等蔬菜作物中均有發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)病原菌誘導(dǎo)反應(yīng)。

隨著黃瓜基因組測序的完成，Ling等[21]對黃瓜基因組進(jìn)行搜尋后找到55個CsWRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，并對55個基因在冷、旱和高鹽脅迫下進(jìn)行表達(dá)分析。目前，國內(nèi)外尚未見WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與黃瓜抗病反應(yīng)的報道，本研究利用RT-qPCR技術(shù)，旨在對黃瓜CsWRKYs基因在瓜類疫霉菌處理下進(jìn)行表達(dá)分析，篩選出抗病相關(guān)CsWRKYs基因并分析其可能參與的抗病相關(guān)信號通路，為研究CsWRKYs參與黃瓜疫病防御反應(yīng)的分子功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物材料為華北型黃瓜品種‘B80（感病材料），該材料為本實驗室經(jīng)多年選育獲得的高代自交系。供試瓜類疫霉菌株為HNG5，為本實驗室從廣東省廣州市白云實驗基地黃瓜病株上分離并純化獲得。

1.2 方法

1.2.1 植物培養(yǎng)和接菌處理 植物材料種植：供試材料‘B80均在育苗杯中育苗，種植10杯，每杯播種5～6顆種子，置于人工氣候箱（RTOP-1000Y）培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：28 ℃ 10 h光照和24 ℃ 14 h黑暗交替，濕度為85%。10 d苗期的黃瓜幼苗將用于接菌處理。

瓜類疫霉菌培養(yǎng)及誘孢：將分離保存的HNG5疫霉菌切一小塊放于V8固體培養(yǎng)基（200 mL V8 果蔬汁，3.0 g CaCO3，20 g瓊脂，800 mL無菌水，調(diào)pH值至6.3）并置于25 ℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)4 d，后將菌斑切成0.5 cm見方的小塊，置于滅菌的三角瓶或組培瓶中（10個小塊/瓶），加V8液體培養(yǎng)基至液面稍低于菌斑的高度，并每隔12 h換一次滅菌水，換水3 d即可誘孢：將培養(yǎng)瓶放于4 ℃冰箱15 min，后室溫放30 min，即有大量孢子產(chǎn)生。用血球計數(shù)板計數(shù)游動孢子數(shù)量，調(diào)節(jié)至游動孢子濃度為5×103個/mL用于灌根接種黃瓜幼苗。

接種處理：接種前12 h將待接種幼苗澆透水，用量筒量取50 mL孢子懸浮液，小心灌入育苗杯內(nèi)，同時以蒸餾水處理作對照，分別在處理后0、24、48和72 h 取幼苗根莖部固定于液氮中，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SA和MeJA處理 供試植株‘B80培養(yǎng)同上，在二葉一心幼苗期分別以5 mmol/L的SA和100 μmol/L的MeJA溶液（均溶解于10%的乙醇溶液中）噴灑幼苗葉片，以噴灑10%濃度的乙醇溶液為對照，分別在噴灑后0、12和24 h取植株根部以上部分固定于液氮中，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 取-80 ℃冰箱中保存的單株樣品，利用RNAiso Plus（Takara）提取其總mRNA，對mRNA樣品進(jìn)行DNaseⅠ處理（37 ℃，30 min）后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用NanoDrop 2000測定其濃度，確定mRNA質(zhì)量合格后用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按照熒光定量PCR（RT-qPCR）專用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser，Takara）操作說明合成第1鏈cDNA，稀釋10倍后用作RT-qPCR反應(yīng)模板。

1.2.4 引物設(shè)計和RT-qPCR基因表達(dá)分析 根據(jù)Ling等[21]提供的黃瓜WRKY基因注釋號在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫（http：//cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp）查找基因序列，按照RT-qPCR引物設(shè)計要求，利用引物設(shè)計軟件Primer Premier 6.0設(shè)計引物并交由上海生工合成，引物經(jīng)過檢測合格后用于后續(xù)RT-qPCR反應(yīng)。

RT-qPCR的操作均參照熒光定量試劑盒說明書（SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ，Takara）進(jìn)行，略有改動。反應(yīng)體系10 μL：SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）5 μL，上游和下游引物各1 μL，cDNA模板2.5 μL，無菌水0.5 μL，每個樣品設(shè)3次重復(fù)。反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。內(nèi)參基因為Cs-UBQ，RT-qPCR反應(yīng)均在BIO-RAD CFX96（Bio-Rad，USA）熒光定量PCR儀上進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

RT-qPCR數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2007進(jìn)行整理分析，ct值>33.0時認(rèn)為數(shù)據(jù)不可靠，不予進(jìn)行后續(xù)計算和分析，基因相對表達(dá)量的計算方法采用2-△Ct法[22]。接菌處理下基因上調(diào)（下調(diào)）表達(dá)倍數(shù)計算方法：Ft=（Pt-P0）/P0-（Wt-W0）/W0。Ft表示接菌處理后某時間點基因上調(diào)或下調(diào)表達(dá)倍數(shù)，即分別指24、48和72 h的3個時間點；Pt表示接菌處理后某時間點基因相對表達(dá)量；P0表示接菌處理后0 h基因相對表達(dá)量；Wt表示對照處理，即水處理后某時間點基因相對表達(dá)量；W0表示對照處理后0 h基因相對表達(dá)量，本研究中P0=W0。∣Ft∣≥2時，該基因被認(rèn)為受瓜類疫霉誘導(dǎo)（抑制）。SA（MeJA）處理下基因上調(diào)（下調(diào)）表達(dá)倍數(shù)計算方法同前，時間點為處理后12和24 h，時間較短，因此，∣Ft∣≥1時，該基因被認(rèn)為受該外源激素誘導(dǎo)（抑制）。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-qPCR引物設(shè)計及篩選

本研究針對黃瓜全基因組55個CsWRKYs進(jìn)行引物設(shè)計合成，每對引物均通過RT-qPCR反應(yīng)檢測引物特異性、擴增效率和是否存在引物二聚體，經(jīng)過多次設(shè)計、篩選后，除CsWRKY55以外，其它54個CsWRKYs均篩選到適用于RT-qPCR的引物（表1）。

2.2 瓜類疫霉處理下CsWRKYs基因表達(dá)分析

本研究對黃瓜全基因組54個CsWRKYs基因在瓜類疫霉處理后0、24、48和72 h進(jìn)行表達(dá)分析。內(nèi)參基因CsUBQ在瓜類疫霉處理后0、24、48和72 h樣品中的ct值范圍分別為19.37～21.42、19.97～22.55、18.71～21.39和18.40～22.70，在此條件下，待檢測CsWRKYs的ct值>33.0，則該CsRKYs基因被認(rèn)為表達(dá)量極低，數(shù)據(jù)不可靠，不參與后續(xù)分析。

CsWRKYs基因表達(dá)分析結(jié)果表明：黃瓜CsWRKYs基因表達(dá)水平普遍較低，在被檢測樣品中均低于內(nèi)參基因CsUBQ的表達(dá)水平，其中8個CsWRKYs基因（CsWRKY9、20、28、30、35、36、38和39）表達(dá)水平極低，在個別樣品中檢測到ct>33.0，不予進(jìn)行后續(xù)分析。剩余46個CsWRKYs基因數(shù)據(jù)處理分析結(jié)果顯示如圖1：有15個CsWRKYs基因（CsWRKY3、11、13、21、22、23、26、31、34、41、44、46、48、52和56）受瓜類疫霉菌誘導(dǎo)，表現(xiàn)出現(xiàn)2倍以上的上調(diào)表達(dá)，受誘導(dǎo)最強基因為CsWRKY44，上調(diào)表達(dá)量高達(dá)361倍。另外，CsWRKY13、26 、41和56受疫霉菌誘導(dǎo)也較強，基因上調(diào)表達(dá)量均在10倍以上。在15個受誘導(dǎo)表達(dá)基因中，11個基因（CsWRKY11、13、22、26、34、41、44、46、48、52和56）在接菌處理后72 h表達(dá)量達(dá)到最高；3個基因（CsWRKY21、23和31）在接菌處理后48 h表達(dá)量達(dá)到最高；只有1個基因（CsWRKY3）在接菌處理后24 h表達(dá)量達(dá)到最高。46個基因中只有CsWRKY6受瓜類疫霉菌抑制，在接菌處理后72 h基因下調(diào)表達(dá)量達(dá)3.2倍。

2.3 SA和MeJA處理下CsWRKYs基因表達(dá)分析

在接種瓜類疫霉處理后發(fā)現(xiàn)，被檢測的46個CsWRKYs基因中有16個受瓜類疫霉誘導(dǎo)表達(dá)，同時發(fā)現(xiàn)有1個CsWRKYs基因表達(dá)受到抑制，推測這16個CsWRKYs基因有可能參與黃瓜抗疫病反應(yīng)。為檢測其抗病相關(guān)信號通路，本研究在外源激素SA處理下分別對這16個基因進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果如圖2-A所示：16個基因中除CsWRKY6表達(dá)下調(diào)外，其它15個基因的表達(dá)量均有不同程度上調(diào)，且12個基因（CsWRKY3、11、13、CsWRKY21、22、23、26、31、34、41、44和46）均在SA處理后12 h表達(dá)量達(dá)到最高，隨后有下降趨勢，另外3個基因（CsWRKY48、52和56）在SA處理后表達(dá)逐漸上調(diào)，在24 h達(dá)到最高。15個表達(dá)上調(diào)基因中有8個CsWRKYs基因（CsWRKY26、34、41、44、46、48、52和56）上調(diào)表達(dá)量達(dá)1倍以上，其中CsWRKY44上調(diào)表達(dá)量最高，達(dá)9倍有余，這8個基因被認(rèn)為極有可能與黃瓜抗疫病相關(guān)，并參與SA介導(dǎo)的抗病相關(guān)信號通路。本研究同時在外源激素MeJA處理下分別對這16個基因進(jìn)行表達(dá)分析，如圖2-B所示：在MeJA處理下，16個基因中只有CsWRKY6的下調(diào)表達(dá)量和CsWRKY44的上調(diào)表達(dá)量達(dá)1倍以上，部分基因（如CsWRKY3、13和21等）的表達(dá)量呈現(xiàn)小幅上調(diào)或下調(diào)，還有另一部分基因（如CsWRKY11、22和23）的表達(dá)量幾乎不變。綜上研究結(jié)果推測：16個受瓜類疫霉菌誘導(dǎo)（抑制）的基因中，9個基因（CsWRKY6、26、34、41、46、44、48、52和56）極有可能與黃瓜抗疫病相關(guān)，其中，7個基因（CsWRKY26、34、41、46、48、52和56）有可能通過SA介導(dǎo)的抗病相關(guān)信號通路調(diào)控植物對病原菌的響應(yīng)；CsWRKY6可能通過JA介導(dǎo)的信號通路調(diào)控植物防御反應(yīng)過程；CsWRKY44則可能同時參與SA和JA介導(dǎo)的抗病相關(guān)信號通路。

3 討論與結(jié)論

Ling等[21]研究證實，在黃瓜中有23個CsWRKYs基因?qū)洹⒑岛透啕}至少一種脅迫有響應(yīng)，表現(xiàn)為脅迫處理后基因表達(dá)量呈顯著差異，且該研究表明，在應(yīng)對非生物脅迫時，黃瓜和擬南芥中同源WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的反應(yīng)存在相關(guān)性。本研究篩選出15個受瓜類疫霉誘導(dǎo)和1個受瓜類疫霉抑制的CsWRKYs基因，其中7個基因（CsWRKY21、26、31、34、41、46和48）在擬南芥中均存在其同源基因[21]。已有的研究報道中，CsWRKY34的同源基因，即AtWRKY70，是RPP4介導(dǎo)抗性和對霜霉病菌基礎(chǔ)性抗性的重要成員，在霜霉病菌誘導(dǎo)的抗性防御途徑中調(diào)控活性氧中間體的產(chǎn)生和SA的積累[23]。CsWRKY46的同源基因AtWRKY8，受馬鈴薯晚疫病菌誘導(dǎo)，同時通過SA途徑負(fù)調(diào)控對丁香假單胞菌的基礎(chǔ)抗性并通過JA途徑正調(diào)控對灰葡萄孢菌的抗性[24]。本研究推測，在應(yīng)對生物脅迫反應(yīng)中，黃瓜和擬南芥中同源WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因也可能存在功能相關(guān)性。

WRKY是最重要的受病原體和SA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子基因，在調(diào)節(jié)水楊酸依賴基因的表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用。Dong等[14]對72個擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)其中有49個基因受含無毒基因的病原菌或SA誘導(dǎo)。本研究中，54個被檢測的黃瓜CsWRKYs基因中有15個基因受瓜類疫霉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，其中8個基因同時受SA誘導(dǎo)，該結(jié)果與前人的認(rèn)識較為一致。

SA和JA是2種常見的介導(dǎo)植物抗病反應(yīng)的信號分子，前人研究表明，SA和JA介導(dǎo)的植物抗病反應(yīng)途徑并非相互獨立，通常認(rèn)為，兩者是相互拮抗的[25]。擬南芥中，AtWRKY62基因受SA誘導(dǎo)，同時在抑制JA反應(yīng)中發(fā)揮作用，Atwrky62突變體中JA響應(yīng)基因表達(dá)增強，而AtWRKY62過量表達(dá)時JA響應(yīng)基因的表達(dá)量降低[26]。水稻中，過量表達(dá)OsWRKY13能提高水稻對白葉枯病菌和稻瘟病菌的抗性，該過程是通過激活SA的生物合成和SA響應(yīng)基因同時抑制JA信號途徑來調(diào)控[27-28]。除此以外，兩者之間的協(xié)同作用也有報道。在水稻中，OsWRKY30和OsWRKY83均受SA和JA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[15，29]。本研究中，CsWRKY44同時受SA和MeJA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，暗示CsWRKY44可能同時參與SA和JA介導(dǎo)的防御反應(yīng)信號通路，處于2條通路的節(jié)點上。然而，防御反應(yīng)調(diào)控是一個復(fù)雜過程，CsWRKY44是否真正協(xié)同調(diào)控SA和JA介導(dǎo)的信號通路還有待進(jìn)一步研究。

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