王銳麗

摘 要：該研究將含嗜熱乙醇菌β-葡萄糖苷酶A（Te-BglA）基因的重組質(zhì)粒pET-20b-Te-BglA導(dǎo)入大腸桿菌JM109（DE3）中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和Ni2+親和層析純化，將其用于酶解大豆異黃酮，以染料木素的產(chǎn)量為檢測指標(biāo)，通過正交試驗優(yōu)化Te-BglA水解大豆異黃酮的條件。優(yōu)化結(jié)果顯示：最佳的水解條件為加酶量70U，溫度80℃，水解時間60min，pH值7.4，在此條件下水解100g大豆粉可得到染料木素58.1mg。

關(guān)鍵詞：β-葡萄糖苷酶；染料木素；大豆異黃酮糖苷；正交試驗

中圖分類號 TS201 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）18-0026-03

Hydrolysis of Soybean Isoflavone by β- Glucosidases A from Thermoanaerobacter etholicus

Wang Ruili

（Department of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Xinyang Agriculture and Forestry University，Xinyang 464000，China）

Abstract：To obtain a high stability and efficiency enzyme in the biotransformation of isoflavone glycosides，β-glucosidase A from Thermoanaerobacter ethanolicus（Te-BglA）was over-expressed in Escherichia coli JM109（DE3），and purified by immobilized metal affinity chromatography. The hydrolysis conditions of soybean isoflavone by Te-BglA were by orthogonal test，Results were as follows：enzyme dose 70U，temperature 80℃，time 60min and pH 7.4. Under the optimal condition，the yield of genistein in the hydrolysis of 100g soybean powder was 58.1mg.

Key words：β-glucosidase；Genistein；Soybean isoflavone glucosides；Orthogonal test

大豆異黃酮因具有緩解更年期綜合征、抗腫瘤、延緩衰老、抗輻射等功效而成為了國內(nèi)外的研究熱點[1-3]，目前研究發(fā)現(xiàn)的12種大豆異黃酮主要有游離型苷元和結(jié)合型糖苷兩種類型，而被人體腸道吸收的是它的苷元形式，糖苷形式必須轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的苷元才能真正發(fā)揮藥效。大豆異黃酮糖苷水解酶（β-葡萄糖苷酶）水解或相關(guān)微生物發(fā)酵因條件溫和而成為一種理想的轉(zhuǎn)化途徑[4-6]，目前雖有很多來源細(xì)菌或真菌轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷β-葡萄糖苷酶的報道，但有關(guān)耐熱性高效水解糖苷的β-葡萄糖苷酶的報道卻很少。耐熱性酶在生物轉(zhuǎn)化過程中具有減少污染、加快反應(yīng)速度、提高底物溶解度及易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢[7]。本研究利用基因工程方法實現(xiàn)嗜熱性β-葡萄糖苷酶A（Te-BglA）在大腸桿菌中的重組表達(dá)和純化，通過正交試驗對其酶解大豆粉中大豆異黃酮糖苷作用進(jìn)行研究，以確定最佳酶解條件，以期為實際生產(chǎn)中提高苷元的產(chǎn)量提供一定的工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株和質(zhì)粒：嗜熱厭氧乙醇菌JW200（Thermoanaerobacter ethanolicus JW200），由美國佐治亞大學(xué)微生物系Wiegel博士分離并贈送。重組質(zhì)粒pET-20b-Te-BglA由前期研究構(gòu)建保存。主要試劑：對硝基苯酚-β-葡萄糖苷（pNPG）、染料木素（Genistein，縮寫G）、染料木苷（Gensitin，Gin）和大豆黃苷（Daidzin，Din）購自Sigma公司；丙二?；玖夏拒眨?-malonyl-gensitin，M-Gin）、大豆黃素（Daidzein，D）、丙二酰基大豆黃苷（6-malonyl-daidzin，M-Din）購自WAKO公司。

1.2 方法

1.2.1 重組酶的表達(dá)和純化 將重組質(zhì)粒pET-20b-Te-BglA電轉(zhuǎn)化于E.coli JM109（DE3），挑取單菌落接入含Amp抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)過夜。然后以1.5%接種量接入到含Amp抗性750mL LB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.8左右加入IPTG至濃度0.05mM，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5h后，離心，收集細(xì)胞。用Rapid Affinity Purification Kit中的結(jié)合緩沖液（Binding Buffer）懸浮細(xì)胞，經(jīng)高壓破碎，離心20min，取上清液于70℃下熱處理20min，離心得粗酶液。粗酶液再經(jīng)Ni2+親和層析純化，快速提取法按Novagen的產(chǎn)品說明進(jìn)行，以每1mL收集酶活的峰值部分，以SDS-PAGE凝膠電泳檢測純度。

1.2.2 酶的活性測定 β-葡萄糖苷酶活性由從底物pNPG釋放對硝基苯酚（pNP）的量確定，采用分光光度法[7]。一個酶活力單位（U）定義：在一定反應(yīng)條件下，1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol pNP的酶量。大豆異黃酮水解酶活性是從底物Genistin、M-Gin釋放出Genstein的量，從底物Daidzin、M-Din釋放出Daidzein的量來確定，采用HPLC法[8]分析。條件：Agilent HC-C18，UV detector 260nm；30℃；流動相：A，0.1%的磷酸水溶液，B，乙腈，45min內(nèi)，A由85%降至65%；流速：0.8mL/min[9]。一個酶活單位（U）定義為在該條件下，1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol的苷元類物質(zhì)（Genstein、Daidzein）所需要的酶量，以峰面積對標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 大豆粉的酶解實驗 稱取0.1g脫脂大豆粉，以料液比1∶10溶于pH7.0，250mM的磷酸緩沖液中，加酶量為50U/g（對照為不加酶），然后于80℃分別酶解90min，在冰浴條件下終止反應(yīng)，離心，收集上清，冷凍干燥。經(jīng)干燥后的上清干粉與沉淀分別用1mL 80%甲醇重懸，30℃提取2h，離心20min，取上清，經(jīng)過濾后取20μL進(jìn)行HPLC分析。異黃酮苷元產(chǎn)量用100g脫脂大豆粉產(chǎn)生的多少毫克（mg）數(shù)表示。

1.2.4 正交試驗設(shè)計 根據(jù)對重組酶Te-BglA酶學(xué)性質(zhì)研究的結(jié)果，設(shè)計了四因素四水平的正交試驗，考察各因素對酶水解的影響。其因素和水平的設(shè)計見表1，每組重復(fù)3次，以水解后染料木素的產(chǎn)量為檢測標(biāo)準(zhǔn)，確定其最佳水解條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組酶的表達(dá)和純化 將重組質(zhì)粒pET-20b-Te-BglA轉(zhuǎn)化E.coli JM109（DE3），挑取單菌落于液體LB培養(yǎng)基中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，收集細(xì)菌經(jīng)高壓破碎，上清液經(jīng)熱處理和Ni2+親和層析兩步純化操作，所得重組酶經(jīng)SDS-PAGE檢測達(dá)到電泳均一（圖1）。

圖1 SDS-PAGE電泳檢測重組酶Te-BglA的純化

2.2 正交設(shè)計結(jié)果及分析 根據(jù)對加酶量、水解溫度、水解時間及pH值進(jìn)行四因素四水平正交設(shè)計，選用L16（45）正交表，并加一空列，作為試驗誤差以衡量試驗的可靠性。其試驗方案及結(jié)果如表2，結(jié)果極差分析如表3，方差分析如表4。由表3和表4可知，影響重組酶Te-BglA水解大豆異黃酮效率的主次因素依次為A（加酶量）>C（時間）>B（溫度）>D（pH值）。其中A加酶量對染料木素產(chǎn)量的影響最顯著，其次是水解時間。由極差分析表3可知，最佳水解條件的組合為A4B3C2D4，即加酶量70U，溫度80℃，水解時間60min，pH值7.4。

2.3 驗證試驗 以組合A4B3C2D4為水解條件時，3次重復(fù)驗證試驗所得100g大豆粉中染料木素的產(chǎn)量為58.1mg，大于正交試驗方案的最大值55.3mg，因此可以證明，A4B3C2D4即加酶量70U，溫度80℃，水解時間60min，pH值7.4是嗜熱性β-葡萄糖苷酶A水解大豆異黃酮的最佳條件。

3 結(jié)論

本研究將含嗜熱乙醇菌β-葡萄糖苷酶A（Te-BglA）基因的重組質(zhì)粒pET-20b-Te-BglA導(dǎo)入大腸桿菌JM109（DE3）中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和Ni2+親和層析純化，將其用于酶解大豆異黃酮糖苷。糖苷形式的大豆異黃酮不具有最佳的生理活性狀態(tài)，須在大豆異黃酮糖苷酶的作用下轉(zhuǎn)化成苷元形式才能被吸收而發(fā)揮藥效[10，11]。為獲得更多的苷元產(chǎn)物，以染料木素為檢測目標(biāo)，本研究通過優(yōu)化酶解的條件，以提高β-葡萄糖苷酶A水解效率，通過正交試驗最終確定最佳的水解條件為加酶量70U，溫度80℃，水解時間60min，pH值7.4，在此條件下染料木素的產(chǎn)量達(dá)到58.1mg。

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