葡萄糖氧化酶和細(xì)胞色素C對(duì)鹽生杜氏藻細(xì)胞密度及β—胡蘿卜素積累的影響

劉偉 王婷 馮佳 呂俊平 劉琪 謝樹蓮

摘要：為了解外源物質(zhì)對(duì)鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）生長(zhǎng)和β-胡蘿卜素積累的影響，本試驗(yàn)以分離自運(yùn)城鹽湖的一株鹽生杜氏藻（D.salina YCOI.）為材料，在培養(yǎng)基中添加外源葡萄糖氧化酶和細(xì)胞色素C，研究其對(duì)鹽生杜氏藻細(xì)胞密度和p一胡蘿卜素含量的影響。結(jié)果表明，葡萄糖氧化酶濃度9mg/L、細(xì)胞色素C濃度lμmol/L時(shí)，鹽生杜氏藻細(xì)胞密度和β-胡蘿卜素含量同時(shí)最大，因此，為兩種外源物質(zhì)的最優(yōu)添加濃度。

關(guān)鍵詞：鹽生杜氏藻；葡萄糖氧化酶；細(xì)胞色素C；細(xì)胞密度；β-胡蘿卜素

中圖分類號(hào)：S555⁺.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）01-0040-04

β-胡蘿卜素（β-Carotene）呈橙黃色，分子式為C40 H56，廣泛存在于植物及真菌中，被認(rèn)為是一種重要的抗癌物質(zhì)，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、防治心血管疾病、抗輻射和光敏損傷以及轉(zhuǎn)化為維生素A等作用，對(duì)放療產(chǎn)生的副作用有一定的減緩功效。β-胡蘿卜素還被世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)認(rèn)定為A類營(yíng)養(yǎng)色素，在全世界50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)作為食品添加劑和著色劑使用。

鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）是一種單細(xì)胞嗜鹽藻類，也是一種重要的經(jīng)濟(jì)藻類。它是生產(chǎn)β-胡蘿卜素的天然資源，其合成和積累的β-胡蘿卜素可高達(dá)干重的14%，具有良好的市場(chǎng)前景。鹽生杜氏藻的培養(yǎng)及β-胡蘿卜素的積累機(jī)理在20世紀(jì)90年代前后就有報(bào)道。之后，鹽生杜氏藻培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)及影響因素、二步培養(yǎng)法等陸續(xù)報(bào)道。我國(guó)也有關(guān)于鹽生杜氏藻培養(yǎng)方面的研究報(bào)道。章麗等從鹽生杜氏藻中克隆了影響β-胡蘿卜素積累的關(guān)鍵酶β-胡蘿卜素羥化酶基因，并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)分析，研究其對(duì)β-胡蘿卜素合成的調(diào)控作用。

有報(bào)道稱添加外源葡萄糖氧化酶和細(xì)胞色素C可促進(jìn)β-胡蘿卜素的積累，但其對(duì)鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素合成的影響尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)以分離自山西運(yùn)城鹽湖的一株鹽生杜氏藻為材料，通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度的葡萄糖氧化酶和細(xì)胞色素C，研究其對(duì)細(xì)胞密度和β-胡蘿卜素合成的影響，以期為優(yōu)化培養(yǎng)條件、最大限度獲取β-胡蘿卜素提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

試驗(yàn)所用鹽生杜氏藻藻種（Dunaliella salinaYC01.）分離自山西省運(yùn)城鹽湖。

培養(yǎng)基為Dunaliella培養(yǎng)基，pH 7.5，光照強(qiáng)度20000 lx，溫度（25±1）℃，光周期16h：8h，每日搖動(dòng)數(shù)次。

試驗(yàn)所用試劑均為分析純。試驗(yàn)所用儀器主要有光照培養(yǎng)箱（SPX-250B-G，上海博訊）；紫外可見分光光度計(jì)（752PC，上海光譜）；生物顯微鏡（SK200，麥克奧迪）；全自動(dòng)制冰機(jī)（IMS-30，常熟雪科）；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（SCIENTZ-IID，寧波新芝）；高速冷凍離心機(jī)（HC-2518R，中科中佳）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖氧化酶濃度優(yōu)化初步優(yōu)化：設(shè)置7個(gè)葡萄糖氧化酶濃度梯度，分別為0、2、5、8、12、16、20mg/L。每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)14d后測(cè)定細(xì)胞密度和β-胡蘿卜素含量。

精細(xì)優(yōu)化：以初步優(yōu)化結(jié)果為依據(jù)，加入由初步優(yōu)化得到的最佳葡萄糖氧化酶濃度范圍，設(shè)置5個(gè)濃度梯度，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)14d后測(cè)定細(xì)胞密度和β-胡蘿卜素的含量。

1.2.2 細(xì)胞色素C濃度篩選 根據(jù)上一步試驗(yàn)結(jié)果，加入葡萄糖氧化酶最佳濃度，再加入細(xì)胞色素C，設(shè)置4個(gè)濃度梯度，分別為0、1、2、3卜Lmol/L。每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)14d后測(cè)定細(xì)胞密度和β-胡蘿卜素的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別采用PASW Statistics 18.O、Oringin 8.0以及Photoshop CS5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖氧化酶濃度的初步優(yōu)化

從圖1可以看出，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，當(dāng)葡萄糖氧化酶濃度較低時(shí)（≤8mg/L），鹽生杜氏藻細(xì)胞密度隨著葡萄糖氧化酶濃度的升高而升高，但是當(dāng)葡萄糖氧化酶濃度較高時(shí)（≥8mg/L），鹽生杜氏藻細(xì)胞密度隨著葡萄糖氧化酶濃度的升高而下降，細(xì)胞密度最高范圍出現(xiàn)在葡萄糖氧化酶濃度8-12mg/L之間。

從圖2可以看出，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，葡萄糖氧化酶對(duì)鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素含量的影響與細(xì)胞密度變化趨勢(shì)一致。當(dāng)葡萄糖氧化酶濃度較低時(shí)（≤8mg/L），鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素含量隨著葡萄糖氧化酶濃度的升高而升高，但是當(dāng)葡萄糖氧化酶濃度較高時(shí)（≥8mg/L），鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素含量隨著葡萄糖氧化酶濃度的升高而下降，β-胡蘿卜素含量最高范圍也出現(xiàn)在葡萄糖氧化酶濃度8～12mg/L之間。

2.2 葡萄糖氧化酶濃度的精細(xì)優(yōu)化

精細(xì)優(yōu)化是以初步優(yōu)化的結(jié)果為依據(jù)，設(shè)置5個(gè)濃度梯度，分別為8、9、10、II、12mg/L。

從圖3可知，在設(shè)置的葡萄糖氧化酶濃度梯度范圍內(nèi)，鹽生杜氏藻的細(xì)胞密度雖有一些波動(dòng)，但無顯著性差異。

從圖4可以看出，在設(shè)置的葡萄糖氧化酶濃度梯度范圍內(nèi)，鹽生杜氏藻的β-胡蘿卜素含量有一定差異，當(dāng)濃度為9mg/L時(shí)，β-胡蘿卜素含量最高，且相對(duì)其它處理有顯著性差異。

綜合鹽生杜氏藻細(xì)胞密度和β-胡蘿卜素含量的研究結(jié)果，葡萄糖氧化酶的最優(yōu)濃度為9mg/L。

2.3 細(xì)胞色素C對(duì)鹽生杜氏藻細(xì)胞密度和β-胡蘿卜素含量的影響

從圖5可以看出，與對(duì)照相比，添加外源細(xì)胞色素C可使鹽生杜氏藻細(xì)胞密度增加，且呈顯著性差異；但各處理間，鹽生杜氏藻細(xì)胞密度無顯著性差異。

從圖6可以看出，細(xì)胞色素C對(duì)鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素的含量有影響。當(dāng)細(xì)胞色素C濃度為1μmol/L時(shí)，β-胡蘿卜素含量顯著高于其它處理。

綜合上述，適宜鹽生杜氏藻生長(zhǎng)和β-胡蘿卜素積累的最佳細(xì)胞色素C濃度為1μmol/L。

3 討論與結(jié)論

在β-胡蘿卜素合成代謝途徑中，β-胡蘿卜素羥化酶是體系的關(guān)鍵酶，它能以β-胡蘿卜素為底物，催化生成玉米黃質(zhì)。β-胡蘿卜素羥化酶是一種非血紅素雙鐵單加氧酶，其作用機(jī)制為通過獲得光合電子傳遞鏈中鐵氧還蛋白傳遞的電子，在含鐵的酶活性中心利用活化的分子氧去打斷該酶的相關(guān)化學(xué)鍵而起作用。β-胡蘿卜素羥化酶的活化嚴(yán)格依賴分子氧的存在并以鐵氧還蛋白為電子供體，因此尋找該酶的活性抑制劑，調(diào)控相關(guān)過程，對(duì)促進(jìn)鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素的積累非常重要。

研究表明，葡萄糖能夠誘導(dǎo)藻類和植物體β-胡蘿卜素羥化酶基因的表達(dá)，因而不利于β-胡蘿卜素的積累。有氧條件下，葡萄糖氧化酶專一性地催化β-D-葡萄糖等底物的降解，進(jìn)而下調(diào)β-胡蘿卜素羥化酶基因的表達(dá)。同時(shí)，該催化反應(yīng)發(fā)生時(shí)消耗分子氧使體系中的活性氧分子甚至是氧原子減少，進(jìn)而抑制β-胡蘿卜素羥化酶的活性。因此，葡萄糖氧化酶的存在有利于β-胡蘿卜素的積累。

細(xì)胞色素C屬于線粒體內(nèi)膜呼吸鏈上的傳遞蛋白，從細(xì)胞色素C還原酶接受電子傳遞給細(xì)胞色素C氧化酶。外源細(xì)胞色素C能夠?qū)⒐夂献饔眠^程中由鐵氧還蛋白傳遞給β-胡蘿卜素羥化酶的電子轉(zhuǎn)移，使其得不到電子而失去相應(yīng)的活性，因而可以對(duì)相關(guān)底物起到保護(hù)作用。

本試驗(yàn)即通過轉(zhuǎn)移電子和適度去除培養(yǎng)體系中的活性分子氧進(jìn)而抑制β-胡蘿卜素羥化酶的活性，以達(dá)到增加β-胡蘿卜素積累的目的。從試驗(yàn)結(jié)果看，當(dāng)葡萄糖氧化酶濃度為9mg/L、細(xì)胞色素C濃度為lμmol/L時(shí)，鹽生杜氏藻的生長(zhǎng)和β-胡蘿卜素積累效果最佳，為該藻的大量培養(yǎng)提供一定參考。