韓朝永

(江蘇省南京市浦口區(qū)中醫(yī)院，江蘇 南京 211800)

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膝骨關節(jié)炎患者關節(jié)液中miR-140的表達及其臨床意義

韓朝永

(江蘇省南京市浦口區(qū)中醫(yī)院，江蘇 南京 211800)

[摘要]目的探討miR-140在膝骨關節(jié)炎(KOA)患者關節(jié)液中的表達及臨床意義。方法選取60例KOA患者和20名健康對照者作為研究對象。采用實時熒光定量RT-PCR檢測KOA患者和健康對照者關節(jié)液中miR-140表達水平，分析關節(jié)液中miR-140表達水平與KOA的相關性。結果KOA患者關節(jié)液miR-140表達水平明顯低于健康對照者(P<0.05)。進一步研究發(fā)現(xiàn)患者關節(jié)液中miR-140水平與Kellgren-Lawrence 分級有顯著相關性(r=-0.742,P<0.05)。結論關節(jié)液miR-140的表達水平不僅可以作為KOA的早期診斷標志物，也可作為判斷KOA嚴重程度的參考指標。

[關鍵詞]膝骨關節(jié)炎；關節(jié)液；miR-140

膝關節(jié)骨性關節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一種常見于中老年人的慢性關節(jié)疾病，其病理改變主要表現(xiàn)為關節(jié)軟骨的退行性變和繼發(fā)性骨質增生。臨床上多表現(xiàn)為膝關節(jié)腫脹、疼痛、活動受限，嚴重者可導致關節(jié)畸形[1]。據(jù)流行病學統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，60歲以上人群KOA患病率約為60%，75歲以上人群則高達80%，其致殘率可高達50%以上。不僅給個人帶來嚴重的痛苦，也給家庭和社會造成沉重的負擔[2-3]。因此，如何有效地預防和治療KOA已成為重大的公共衛(wèi)生學問題。KOA病因復雜，多種致病因素和因子均會導致KOA的發(fā)生和發(fā)展。microRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類內源性單鏈小分子RNA，通過對靶基因轉錄后水平的調控來發(fā)揮其功能[4]。目前的研究證實miRNA參與調控一系列重要生理病理過程，包括在免疫炎癥反應以及骨關節(jié)炎發(fā)病中也發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。新近的研究發(fā)現(xiàn)，miR-140與關節(jié)炎發(fā)生密切相關[5-6]。本研究通過對膝關節(jié)液中miR-140表達水平的測定，探討其在KOA發(fā)病中的作用，為KOA的診斷和治療提供依據(jù)。

1臨床資料

1.1一般資料選擇2014年1月—2015年6月在我院接受治療的60例KOA患者和20名健康對照者作為研究對象。60例KOA患者中男17例，女43例；年齡53～78(57.74±4.92)歲；病程1～8(3.47±1.52)年。所有患者均符合美國風濕病學會推薦的KOA診斷標準：①膝關節(jié)痛在就診的前1個月內≥14 d；②膝關節(jié)活動時有骨磨擦音；③X射線示膝關節(jié)骨端邊緣有骨刺增生或骨贅形成；④膝關節(jié)骨性腫脹；⑤膝關節(jié)晨僵≤30 min；⑥年齡≥40歲。符合上述條件中的①③或①②④⑤⑥即可診斷為KOA。采用Kellgren-Lawrence(K-L)[7]分級評估KOA臨床病情：其中Ⅱ級20例，Ⅲ級24例，Ⅳ級16例。排除標準：①有感染性關節(jié)炎，膝關節(jié)創(chuàng)傷及手術史，糖尿病患者；②類風濕關節(jié)炎等自身免疫性疾病的患者；③檢查前2周使用過糖皮質激素或非甾體類抗炎藥的患者；④其他反應性關節(jié)炎等關節(jié)疾病的患者。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準，每位受試者均簽署知情同意書。

1.2關節(jié)液的收集與保存受試者取平臥位，膝關節(jié)局部消毒麻醉后，取髕上外側入路行膝關節(jié)腔穿刺，抽取關節(jié)液約2 mL，室溫下靜置1 h。然后3 000 r/min離心20 min去除細胞和關節(jié)組織殘存碎片，取上清置于新1.5 mL微量離心管，-80 ℃冰箱保存待后續(xù)檢測。

1.3miR-140檢測①總RNA的提取：Trizol法提取關節(jié)液總RNA。變性瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測法檢測RNA質量和濃度。②miRNA逆轉錄：制備20 μL RT混合反應液：Total RNA 0.3 μg，dNTP (2.5 mM each)2 μL，RT特異引物(1 μM)0.5 μL，MMLV反轉錄酶(10 IU/μL)2 μL，RNA酶抑制劑(40 IU/μL) 0.3 μL，10×RT Buffer 2 μL。RT反應條件：16 ℃，30 min；42 ℃，40 min；85 ℃，5 min；反應結束后，冰上冷卻5 min，-80 ℃保存。③Realtime PCR反應：采用8 μL的反應體系：dNTP(2.5 mM each)1.0 μL，10×PCR緩沖液1.0 μL，MgCl2溶液0.6 μL，Taq聚合酶0.5 IU，Sybergreen I至終濃度0.25×，10 μM的PCR特異引物F 0.4 μL，10 μM的PCR特異引物R 0.4 μL，2×ROX Reference Dye 0.2 μL。反應條件如下：95 ℃，3 min；40個PCR循環(huán)(95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；70 ℃，30 s)，實驗重復3次。以U6 snRNA作為內參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進行分析。miR-140上游引物5’-GCCTCAGTGGTTTTACCCTA-3’,下游引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT -3’。

2結果

2.1KOA患者與健康人關節(jié)液miR-140表達比較RT-PCR結果顯示：健康對照者關節(jié)液miR-140相對表達水平為1.04±0.29，KOA患者關節(jié)液miR-140表達水平為0.51±0.24，KOA患者明顯低于健康對照者(P<0.05)，見圖1。

圖1　不同分組患者關節(jié)液miR-140水平

2.2不同嚴重程度KOA患者關節(jié)液miR-140表達比較不同K-L分級患者中，Ⅱ級患者關節(jié)液miR-140相對表達水平為0.69±0.30，Ⅲ級患者關節(jié)液miR-140表達為0.51±0.24，Ⅳ級患者關節(jié)液miR-140表達為0.36±0.21；K-LⅣ級患者關節(jié)液miR-140表達明顯高于Ⅱ級和Ⅲ級患者(P<0.05)，見圖1。

2.3KOA患者關節(jié)液miR-140表達與K-L分級的相關性Spearman秩相關分析結果顯示：miR-140在關節(jié)液中的表達水平與KOA的K-L分級呈顯著負相關性(r=-0.742,P<0.05)，見圖2。

圖2　關節(jié)液miR-140水平與KL分級的相關性散點圖

3討論

KOA的發(fā)病機制十分復雜，目前尚未完全闡明，可能為關節(jié)生物力學性質的改變、關節(jié)創(chuàng)傷、機體免疫反應、細胞因子、性激素水平等因素綜合作用所致[8]。隨著對miRNA研究的不斷深入，目前已有大量文獻報道m(xù)iRNA與KOA的發(fā)生、發(fā)展存在密切關系。Iliopoulos等[9]對比檢測發(fā)現(xiàn)，KOA患者和正常健康者軟骨組織間存在16個差異表達的miRNAs，提示這些miRNAs可以用來區(qū)分KOA細胞和正常的軟骨細胞。目前的研究已經(jīng)證實，KOA的發(fā)病與軟骨細胞和基質中異?；罨难装Y遞質和基質降解酶密切相關。Yamasaki等[10]研究發(fā)現(xiàn)，隨著骨關節(jié)炎軟骨退行性病變的加重，軟骨中miR-146a的表達量逐漸減少，而基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)則呈平行上升趨勢。特別是經(jīng)IL-1β體外刺激可以導致軟骨細胞miR-146a表達明顯升高。提示miR-146a可能通過調控IL-1β和MMP-13來參與調控KOA的發(fā)病。由于miRNA與靶基因的mRNA的3’-UTR不完全互補結合，因此miRNA具有調控多個靶基因的能力。因此miRNA在KOA發(fā)病機制中起的重要作用也逐步受到學者們的認可和重視。

miR-140為軟骨細胞中特異性高表達的miRNA，不僅參與調控人類軟骨形成和發(fā)育，同時在維持軟骨細胞平衡方面起著重要作用[11]。動物研究發(fā)現(xiàn)，敲除miR-140可導致的小鼠軟骨內成骨的生長缺陷，關節(jié)軟骨細胞發(fā)生凋亡[12]。尤為重要的是小鼠出現(xiàn)了與骨性關節(jié)炎的病理改變，而轉基因過表達miR-140則可以抵制抗原誘導的關節(jié)炎的出現(xiàn)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，其可能機制在于miR-140能直接抑制Adamts-5這一導致骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨基質降解的重要水解酶的表達。而骨關節(jié)炎病程中由于某種因素導致miR-140表達失調引起Adamts-5正常調控機制的失衡，從而導致骨關節(jié)炎的發(fā)生。

隨著高靈敏性基因芯片和PCR技術的使用，目前在人體液(如血液、關節(jié)液、腹腔液、精液等)中能夠檢測到穩(wěn)定表達的miRNAs，且其表達譜和表達水平的異常改變與多種疾病病變情況密切相關。目前已經(jīng)證實KOA患者關節(jié)液中相關細胞因子和蛋白酶表達水平會發(fā)生改變，且這種改變與軟骨損傷程度和疾病的嚴重程度有關[13]。本研究采用RT-PCR檢測KOA患者關節(jié)液中miR-140表達改變情況。結果顯示：KOA患者關節(jié)液中miR-140表達水平明顯低于健康人，提示關節(jié)液miR-140的低表達不僅可以作為早期診斷KOA的生化指標，且miR-140的缺失可能是導致KOA發(fā)生發(fā)展的重要因素，這與相關報道是一致的[14]。由于關節(jié)液由關節(jié)面滑膜分泌產生，因此，根據(jù)以往文獻報道認為關節(jié)液中的miR-140主要來源于關節(jié)軟骨和滑膜組織的分泌和滲透[15]。由于KOA患者關節(jié)軟骨和滑膜組織的miR-140表達明顯降低，因而導致關節(jié)液中miR-140表達水平也相應降低。進一步采用Kellgren-Lawrence對60例KOA患者嚴重程度進行分級，結果顯示：隨著骨關節(jié)炎疾病的進展，KOA患者關節(jié)液中miR-140表達也依次降低。即KOA患者關節(jié)液中miR-140表達水平與骨關節(jié)炎嚴重程度呈負相關。這表明關節(jié)液中miR-140表達水平還可以作為評價膝骨關節(jié)炎影像和病變嚴重進展的生化指標。

總之，本次研究結果結合國內外相關報道，證明miR-140與KOA的發(fā)生發(fā)展密切相關。深入研究miR-140不僅有助于進一步闡明KOA的發(fā)病機制，關節(jié)液miR-140的表達也可以為KOA的診斷和病情評估提供重要參考依據(jù)。此外，通過將miR-140作為KOA干預治療的靶點，從基因組學和轉錄調控機制上為KOA的治療提供一種新的手段。

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[收稿日期]2015-12-31

[中圖分類號]R593.21

[文獻標識碼]B

[文章編號]1008-8849(2016)13-1422-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.13.018