石健　張?chǎng)╂肌●T汛　胡雨婷　瑤池

(南通大學(xué)　江蘇南通 226019)

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尼羅紅熒光染色法的優(yōu)化及應(yīng)用*

石健張?chǎng)╂捡T汛胡雨婷瑤池

(南通大學(xué)江蘇南通 226019)

摘要以自主篩選的小球藻為材料對(duì)尼羅紅熒光染色進(jìn)行條件優(yōu)化，并用該方法追蹤微藻在污水中的油脂含量變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，微藻只有經(jīng)過超聲波破碎，染色才會(huì)出現(xiàn)熒光，DMSO的添加會(huì)增強(qiáng)熒光反應(yīng)。最終確定其染色條件為：DMSO與藻液體積比為1∶5，超聲波破碎5 min后染色5 min，NR質(zhì)量濃度1.5 μg/mL。在其應(yīng)用方面發(fā)現(xiàn)，微藻的油脂積累量只有培養(yǎng)基的一半，說明污水不利于微藻油脂的積累；最佳采收時(shí)期為平穩(wěn)期，此時(shí)微藻的產(chǎn)量和油脂含量達(dá)到最高。

關(guān)鍵詞小球藻尼羅紅超聲波污水油脂

0引言

微藻因其生長(zhǎng)快速、產(chǎn)量大、油脂含量高成為生物柴油的熱門候選來源[1]。其中，小球藻具有高耐污、高含油特性，可利用污水飼養(yǎng)節(jié)約生產(chǎn)成本。因其兼具再生能源與污水處理的特點(diǎn)[2]，小球藻在微藻生物柴油的研究中引起了人們的廣泛關(guān)注。雖然已有大量的研究證明小球藻對(duì)污水處理的能力，但其在污水中的油脂積累情況卻研究較少。油脂的產(chǎn)量直接決定微藻生物柴油的生產(chǎn)價(jià)值，監(jiān)測(cè)污水中小球藻的油脂含量對(duì)其工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

尼羅紅(Nile Red,NR)是一種脂溶性的熒光染料，可以準(zhǔn)確地將細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)與其他貯藏物區(qū)分開[3], 因此經(jīng)常被用于檢測(cè)動(dòng)物以及微生物細(xì)胞內(nèi)油脂情況。尼羅紅熒光染色法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏，樣品需求量少且能連續(xù)活體檢驗(yàn)等優(yōu)點(diǎn)[4]，已在多種生物中證明了尼羅紅熒光染色的準(zhǔn)確性。HUANG等人[5]就曾用尼羅紅對(duì)凍干的小球藻藻粉進(jìn)行油脂定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其相關(guān)度高達(dá)0.99。利用尼羅紅熒光染色建立快速簡(jiǎn)便低能耗的微藻脂質(zhì)測(cè)定方法無論是對(duì)優(yōu)良藻種的篩選，培養(yǎng)條件的優(yōu)化或是藻采收時(shí)期的確定都十分有益。

雖然尼羅紅熒光染色法已成功地應(yīng)用在其他藻類中，但在小球藻這種高含油、高耐污的微藻的研究方面還沒有廣泛應(yīng)用，其原因主要在于小球藻較厚的細(xì)胞壁阻礙了尼羅紅與微藻胞內(nèi)油脂的結(jié)合[6]。本實(shí)驗(yàn)中，熒光染色法的條件優(yōu)化將著重對(duì)微壁進(jìn)行研究，以期找到一種能夠應(yīng)用于所有微藻的技術(shù)，可以顯著提高尼羅紅熒光染色法的染色效果。1試驗(yàn)材料和試劑

藻種：采用從南通郊區(qū)篩選得到7號(hào)小球藻為實(shí)驗(yàn)材料。這是一種高耐污微藻，已用索氏提取法測(cè)定其油脂含量在35%左右。污水：本實(shí)驗(yàn)所用污水分別取自某污水處理廠和某養(yǎng)豬場(chǎng)(簡(jiǎn)稱污水與養(yǎng)殖)，具體參數(shù)見表1。采取水樣后，若水質(zhì)較渾濁可用兩層紗布過濾去除固體懸浮物，經(jīng)121 ℃，30 min高壓蒸汽滅菌后備用。

表1　污水參數(shù)

試劑有BG-11培養(yǎng)基，PBS緩沖液 (pH=7.2),二甲基亞砜 (DMSO), 質(zhì)量濃度為100 μg/mL的尼羅紅 (丙酮配制)等。儀器有離心機(jī)，RF-5301型熒光分光光度計(jì)、可見分光光度計(jì)、冷凍干燥機(jī)、搖床(定制帶光照)、超聲波清洗儀等。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1NR熒光染色

取進(jìn)入平穩(wěn)期的藻液，以4 000 r/min的速度離心分離10 min棄去上層培養(yǎng)液，隨后用PBS重復(fù)清洗3次后懸浮OD750至0.8，NR染色5 min測(cè)樣，測(cè)樣時(shí)Ex=480 nm，掃描500～650 nm之間熒光，并在550～600 nm之間尋峰，其峰值代表油脂相對(duì)含量。

2.2污水中微藻生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

每?jī)商鞙y(cè)定藻液OD750，因污水具有濁度，測(cè)樣時(shí)，先以4 000 r/min的速度離心分離10 min，用蒸餾水清洗3次后，再用蒸餾水懸浮至同體積測(cè)樣。

2.3污水中微藻油脂的測(cè)定

取自污水處理廠的工業(yè)污水可直接培養(yǎng)微藻(下文簡(jiǎn)稱污水)，而養(yǎng)殖污水由于濃度過高，不能直接用于微藻的培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)中使用稀釋5倍后的養(yǎng)殖污水進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(簡(jiǎn)稱養(yǎng)殖)，稀釋采用蒸餾水稀釋。試驗(yàn)每隔4 d取樣，利用優(yōu)化后的NR熒光染色法測(cè)定樣品油脂的熒光強(qiáng)度。

3結(jié)果與討論

3.1尼羅紅(NR)熒光染色法的優(yōu)化

3.1.1不同添加物對(duì)熒光掃描結(jié)果的影響

試驗(yàn)分別測(cè)定尼羅紅(NR),二甲基亞砜(DMSO)及二者同時(shí)添加對(duì)微藻油脂熒光掃描結(jié)果的影響，并用藻液作為對(duì)比(CK) ，結(jié)果見圖1，DMSO和藻液的體積比為1∶5，1 mL藻液中尼羅紅的添加量為15 μL。

從圖1可知，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm時(shí)，微藻的油脂峰位于550～600 nm之間，圖1中4條曲線沒有出現(xiàn)油脂峰，說明沒有油脂被檢出。本實(shí)驗(yàn)使用的7號(hào)藻油脂含量在35%左右，無油脂熒光峰說明染色方法有誤，微藻油脂未被成功染色。其原因可能與小球藻的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)。已有研究表明由于綠藻綱的一些小球藻具有較厚的細(xì)胞壁，阻擋NR與胞內(nèi)油脂結(jié)合，因而無熒光產(chǎn)生。還有實(shí)驗(yàn)證明DMSO的添加可顯著提高染色效果[7]，可圖中結(jié)果表明DMSO的加入也未能使NR成功與胞內(nèi)油脂結(jié)合。為了得到7號(hào)藻油脂的熒光峰，需要對(duì)微藻的細(xì)胞壁進(jìn)行處理，增加它的通透性。

圖1　微藻的熒光掃描圖譜

3.1.2細(xì)胞壁的處理?xiàng)l件優(yōu)化

發(fā)現(xiàn)DMSO對(duì)7號(hào)藻無效后，又分別采用不同的有機(jī)溶劑處理微藻。甲醇作為一種極性溶劑，可與細(xì)胞膜的極性脂結(jié)合從而破壞細(xì)胞膜的通透性，而石油醚、乙醇也經(jīng)常被用在微藻的油脂提取中，它們能與細(xì)胞壁作用促進(jìn)油脂的提取，因此在實(shí)驗(yàn)中選擇這3種試劑進(jìn)行細(xì)胞壁的處理，有機(jī)試劑與藻液的體積比為1∶5，1 mL藻液中NR為15 μL，見圖2。

圖2　加入有機(jī)試劑的掃描圖譜

從圖2可知，所有曲線在550～600 nm之間都無峰值出現(xiàn)，說明這些有機(jī)試劑對(duì)7號(hào)藻全部無效，這可能與7號(hào)藻的高耐污能力有關(guān)：一個(gè)堅(jiān)固、致密的細(xì)胞壁可以阻擋掉大部分有害物質(zhì)，使其能夠在各種污水中保持活性并處理污水，但其堅(jiān)固的細(xì)胞壁對(duì)有機(jī)試劑也有很強(qiáng)的抵御能力，不會(huì)輕易被破壞結(jié)構(gòu)。將有機(jī)試劑法排除后，借鑒微藻油脂的提取方法，進(jìn)行直接破壁的探究。 超聲波破壁法是一種適合大多數(shù)藻細(xì)胞的破壁方法，因此采用超聲波破壁法對(duì)7號(hào)藻進(jìn)行預(yù)處理，1 mL藻液中NR為15 μL，有機(jī)試劑與藻液的體積比為1∶5，見圖3。

圖3　超聲波與有機(jī)試劑相結(jié)合的熒光掃描圖譜

在嘗試超聲波破碎細(xì)胞發(fā)現(xiàn)在550～600 nm之間出現(xiàn)熒光峰后，與有機(jī)試劑相結(jié)合進(jìn)行染色。從圖3看出，7號(hào)藻經(jīng)過超聲波在550～600 nm之間出現(xiàn)明顯的油脂峰，而甲醇和DMSO的加入增強(qiáng)了油脂的熒光反應(yīng)，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)超聲波破碎與DMSO結(jié)合的效果最好，說明DMSO可以增強(qiáng)染色效果。

分析圖1和圖3的熒光曲線，可知DMSO的主要作用在于促進(jìn)NR和微藻油脂的結(jié)合，增強(qiáng)它們的熒光反應(yīng)而非促進(jìn)NR對(duì)于微藻細(xì)胞的滲透。有研究證明DMSO可增加生物膜的通透性，其原因在于DMSO可與生物膜的脂質(zhì)作用[8]，引起脂質(zhì)雙分子層厚度的減小甚至融合[9]，從而促進(jìn)溶質(zhì)分子透過細(xì)胞膜。由此可見，DMSO對(duì)于由纖維素和果膠組成的小球藻細(xì)胞壁沒有明顯作用。DMSO同時(shí)具有疏水基和親水基，可與水和有機(jī)溶劑互溶，該特性使其成為高效溶劑。當(dāng)微藻經(jīng)超聲波破碎，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，油脂外露時(shí)，DMSO可以增加微藻油脂與NR的接觸，進(jìn)而增強(qiáng)了它們的熒光反應(yīng)效果。

3.1.3尼羅紅的最佳濃度

在確定了微藻的破壁方法后，對(duì)NR染色時(shí)的濃度進(jìn)行了探究，具體結(jié)果見圖4，曲線對(duì)應(yīng)的1 mL藻液中尼羅紅質(zhì)量分別為5,10,15，20,25，30 mg。

圖4　不同尼羅紅濃度的熒光掃描圖譜

從圖4可知，藻液中不同濃度的NR對(duì)微藻的熒光強(qiáng)度有一定的影響，比較幾條曲線后發(fā)現(xiàn)15 μL/mL藻液的染色效果最好，可在OD750為0.8左右的小球藻的染色中使用。

3.2小球藻在污水中的油脂含量變化

在掃描微藻的油脂峰時(shí)發(fā)現(xiàn)其熒光峰無固定位置，都在550～600 nm之間移動(dòng)，見圖5。這是因?yàn)槲⒃逵椭嵌喾N脂肪的混合物，不同的污水，不同的生長(zhǎng)階段都會(huì)對(duì)微藻油脂的組成產(chǎn)生影響，如圖5中同種微藻在同種培養(yǎng)基中其生長(zhǎng)天數(shù)不同，油脂的熒光峰的位置也發(fā)生變化。為了更加準(zhǔn)確評(píng)價(jià)微藻油脂的含量，本實(shí)驗(yàn)不固定測(cè)定某一波長(zhǎng)的熒光值，而是在550～600 nm之間尋找峰值，扣除空白樣后以此表征油脂含量。

圖5　7號(hào)藻在不同生長(zhǎng)階段的熒光曲線

將NR熒光染色法優(yōu)化并確定了測(cè)定相對(duì)油脂的方法后，利用其對(duì)微藻在BG-11、污水、20%養(yǎng)殖廢水中的油脂含量的變化進(jìn)行了測(cè)定。油脂變化曲線和微藻生長(zhǎng)曲線顯示在圖6中。

圖6　微藻在不同污水中的油脂積累

觀察圖6中油脂的含量變化，發(fā)現(xiàn)微藻在前期和中期的油脂含量變化基本一致，都為前4天下降，4～8天上升。前4天微藻處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在該階段由于環(huán)境適宜、營(yíng)養(yǎng)充分，微藻大量繁殖，其營(yíng)養(yǎng)都供給細(xì)胞自身的構(gòu)建，沒有轉(zhuǎn)化為油脂貯存，甚至之前積累的油脂也被消耗，因而微藻油脂含量最低；經(jīng)過一段時(shí)間的生長(zhǎng)，微藻的生長(zhǎng)環(huán)境惡化，其生長(zhǎng)停止，開始積累油脂，所以在4～8天藻油上升。觀察生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)在BG-11中的微藻在8天后仍處于平穩(wěn)期，油脂含量有所上升，而污水和養(yǎng)殖沒有明顯的平穩(wěn)期，直接進(jìn)入衰亡期，此階段油脂下降。這說明微藻生長(zhǎng)中，平穩(wěn)期的延長(zhǎng)有利于油脂的積累。

比較圖6中的生長(zhǎng)曲線和油脂積累情況，發(fā)現(xiàn)在最大產(chǎn)量上養(yǎng)殖與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基不相上下；而在油脂積累上，2種污水明顯不如BG-11，這是因?yàn)槲⒃逵椭姆e累主要發(fā)生在平穩(wěn)期，而污水中的平穩(wěn)期時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。

4結(jié)語

(1)超聲波破碎法可有效破除微藻細(xì)胞壁的阻礙，增強(qiáng)NR的染色效果，尤其是對(duì)于厚壁的小球藻，其與DMSO相結(jié)合的染色效果更好。

(2)DMSO在尼羅紅熒光染色法中的主要作用是增強(qiáng)染色效果而非增加微藻細(xì)胞壁的通透性。

(3)利用NR追蹤微藻在培養(yǎng)過程中油脂含量的變化，發(fā)現(xiàn)平穩(wěn)期的延長(zhǎng)有利于微藻油脂的積累。

(4)微藻在污水中的油脂含量不到培養(yǎng)基的一半說明污水不適合微藻積累油脂。

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The Optimization and Application of Nile Red Fluorescent Determination

SHI JianZHANG WenjieFENG XunHU YutingYAO Chi

(NantongUniversityNantong,Jiangsu226019)

AbstractThe chlorella is screened as material to optimize Nile red fluorescent measure, and it is used to trance the variation on microalgae oil in sewage. The experiment finds out that the dye won’t work until microalgae is broken by ultrasonic, and the addition of DMSO will enhance fluorescence reaction. The optimization result is determined: VDMSO∶Vsewage=1∶5，5 min broke cell by ultrasonic and dye 5min,NR 1.5 μg/mL. As to the application, microalgae oil accumulation is only half compared to medium, indicating that sewage is not conducive to microalgae oil accumulation, and the best harvesting time is stationary phase, when the yield and oil content reaches the highest of micro algae.

Key WordschlorellaNile redultrasonicsewageoil

(收稿日期：2015-03-13)

作者簡(jiǎn)介石健，女，1972年生，教授，主要研究方向?yàn)樗廴究刂萍夹g(shù)。

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(21177067)，江蘇省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(BK2010034)，江蘇省基礎(chǔ)研究基金(BK2011009)，南通市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(HS2012001)，南通市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(CP12011001)，江蘇省青藍(lán)工程計(jì)劃項(xiàng)目。