吳石金，戴安迪（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

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L-瓜氨酸生產(chǎn)菌株的篩選及鑒定

吳石金，戴安迪
（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

摘要：通過(guò)選擇性培養(yǎng)基初篩（利用精氨酸雙水解酶篩選培養(yǎng)基）和復(fù)篩（高效液相色譜法測(cè)定L-瓜氨酸質(zhì)量濃度），從杭州市勾莊地區(qū)西瓜大棚的土壤中篩選獲得45株產(chǎn)L-瓜氨酸菌株。其中一株細(xì)菌（菌株編號(hào)11）轉(zhuǎn)化L-精氨酸生產(chǎn)L-瓜氨酸的能力最強(qiáng)，產(chǎn)生的L-瓜氨酸濃度最高，0.344 g濕菌，在60 mL轉(zhuǎn)化體系中轉(zhuǎn)化一天，可將20 g/L的底物L(fēng)-精氨酸轉(zhuǎn)化為9.31 g/L的L-瓜氨酸。對(duì)11號(hào)菌株分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定，初步鑒定該菌株為糞腸球菌（Enterococcus faecalis）。

關(guān)鍵詞：L-瓜氨酸；糞腸球菌；篩選鑒定

L-瓜氨酸（L-citrulline）是人體尿素循環(huán)中的一種代謝中間產(chǎn)物，有利尿作用，臨床上常與L-精氨酸、L-鳥(niǎo)氨酸等共同用于治療高氨血癥［1］。近年來(lái)，眾多國(guó)內(nèi)外研究表明L-瓜氨酸還具有很多其他重要的生理功能，如清除有害的自由基、抗氧化、穩(wěn)定血壓、指示異體排斥效應(yīng)［2-3］，瓜氨酸還可松弛血管，增強(qiáng)男性性功能，以及治療性功能障礙［4］。

目前，生產(chǎn)L-瓜氨酸的方法主要有生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法、提取法和酶法。發(fā)酵法生產(chǎn)L-瓜氨酸的缺點(diǎn)是產(chǎn)率低［5］；化學(xué)法生產(chǎn)的產(chǎn)品中含有L-瓜氨酸的旋光對(duì)映體D-瓜氨酸［6］；提取法的生產(chǎn)工藝相對(duì)困難，產(chǎn)品很難純化，因此成本比較高；酶法的優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)條件溫和，產(chǎn)品中無(wú)D型旋光對(duì)映體產(chǎn)生［11］。酶法生產(chǎn)L-瓜氨酸是一種效率高、成本低的生產(chǎn)方法，將在瓜氨酸生產(chǎn)中起到重要作用［7-9］。已有報(bào)道利用銅綠假單胞菌［10］、惡臭假單胞菌［11］、乳酸乳球菌［12］等提取精氨酸脫亞胺酶，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-瓜氨酸，但瓜氨酸產(chǎn)量低，工藝也尚不成熟。轉(zhuǎn)化能較強(qiáng)的菌株將在未來(lái)瓜氨酸生產(chǎn)中扮演重要角色。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

土壤樣品：杭州市勾莊地區(qū)西瓜大棚土壤表層5～10 cm的沃土以及大棚旁邊溝渠中的水樣適量。西瓜根系纖弱，耐干不耐濕，所以培育的土壤多為旱地，瓜氨酸具有一定的耐旱作用，能產(chǎn)生瓜氨酸菌株能在旱地較好的生存，故選取西瓜大棚土壤作為取樣來(lái)源。

1.1.2主要試劑

L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma試劑公司；L-精氨酸購(gòu)于上海藍(lán)季生物公司；乙腈（色譜純，美國(guó)天地有限公司）；2，4-二硝基氟苯購(gòu)于豪普斯生物試劑公司；其余試劑均為分析純。

1.1.3培養(yǎng)基與試劑

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.4，115℃滅菌30 min。

篩選培養(yǎng)基：蛋白胨1 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO40.3 g/L，L-精氨酸10 g/L，酚紅0.01 g/L，pH 6.7，固體培養(yǎng)基另加瓊脂20 g/L，115℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 3 g/L，KH2PO42 g/L，pH 7.2，115℃滅菌30 min。

發(fā)酵基本培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/ L，NaCl 10 g/L，L-精氨酸2 g/L，pH 7.2，115℃滅菌30 min。

轉(zhuǎn)化液成分：pH 6.0的底物精氨酸質(zhì)量濃度為20 g/L，0.4 mol/L的NaAc-HAc緩沖液，115℃滅菌30 min。

衍生劑試劑：Na2CO3-NaHCO3緩沖液的配制，準(zhǔn)確稱(chēng)取Na2CO3和NaHCO3，制成0.5 mol/L Na2CO3和0.5 mol/L NaHCO3溶液，用Na2CO3調(diào)NaHCO3的pH值為9.0，即制得Na2CO3-NaHCO3緩沖液。

2，4-二硝基氟苯乙腈液的配制：準(zhǔn)確量取2，4-二硝基氟苯，制得體積分?jǐn)?shù)為1.5%的2，4-二硝基氟苯乙腈溶液。

K2HPO4-KH2PO4緩沖液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取K2HPO4和KH2PO4，制成0.1 mol/L的K2HPO4和KH2PO4溶液，互調(diào)pH值至7.0，即制得K2HPO4-KH2PO4緩沖液。

流動(dòng)相A的配制：含1%N，N-二甲基甲酰胺（體積分?jǐn)?shù)）的0.05 mol/L NaAc和HAc緩沖溶液。分別準(zhǔn)確配制0.05 mol/L的NaAc和HAc溶液，用HAc調(diào)NaAc溶液的pH值至6.4，然后加入溶液體積1%的N，N-二甲基甲酰胺，用0.45 μm水相膜過(guò)濾。流動(dòng)相B的配制：V（乙腈）：V（水）=3：1，用0.45 μm有機(jī)膜過(guò)濾。

1.2儀器與設(shè)備

雙層全溫恒溫培養(yǎng)搖床；D-3752型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)ThermoFisher；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠；YXQ-LS-S型全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠；GE-100型DNA水平電泳儀；Mastercycler型聚合酶反應(yīng)儀，德國(guó)Eppendorf；Gel Dac XR+型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD；光學(xué)顯微鏡，日本尼康；分光光度計(jì)，美普達(dá)儀器公司；恒溫水浴鍋，萬(wàn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品的處理

將從菌源地采樣得來(lái)的樣品分別溶于無(wú)菌生理鹽水中，置于30℃搖床1 h混勻。

1.3.2初篩［13-14］

取上述土壤懸濁液溶于無(wú)菌水中，梯度稀釋?zhuān)?0-4、10-5、10-63種稀釋度，取0.2 mL涂布于固體篩選平板上，倒置放入30℃恒溫培養(yǎng)箱，充分培養(yǎng)。若菌落能產(chǎn)生精氨酸脫亞胺酶，脫去精氨酸的亞氨基，同時(shí)生成瓜氨酸和氨，氨成堿性，會(huì)使培養(yǎng)基中添加的酚紅指示劑變成紅色，形成紅色的變色圈。

每日定時(shí)觀察上述平板上菌株的生長(zhǎng)情況，若發(fā)現(xiàn)周?chē)屑t色變色圈菌落，立即挑取菌落在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線(xiàn)純化，經(jīng)過(guò)菌落形態(tài)特征觀察和鏡檢，初步認(rèn)定為純種，各自用甘油凍存保藏，并編號(hào)。將上述保藏菌株接于液體篩選培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)基轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色者為陽(yáng)性，以不加精氨酸的液體篩選培養(yǎng)基作為對(duì)照。保留所有陽(yáng)性菌株，編號(hào)保藏。

1.3.3復(fù)篩［15］

通過(guò)初篩得到的菌株分別接種到液體種子培養(yǎng)中，37℃，180 r/min培養(yǎng)12 h獲得均勻的種子，然后以2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量分別接到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的菌液6 000 r/min離心10 min，用滅菌生理鹽水洗滌菌體1～2次，轉(zhuǎn)入0.4 mol/L醋酸緩沖液中（底物精氨酸質(zhì)量濃度為20 g/L，pH 6），反復(fù)吹打均勻，裝液量60 mL，置于37℃，180 r/min搖床中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。高效液相色譜法測(cè)定轉(zhuǎn)化液中瓜氨酸質(zhì)量濃度。

瓜氨酸衍生化方法：轉(zhuǎn)化液10 000 r/min離心5 min，取1 mL放入10 mL的棕色容量瓶中（衍生物見(jiàn)光易分解），加入配制好的Na2CO3-NaHCO3緩沖液1 mL，再加入1 mL的2，4-二硝基氟苯乙腈溶液后搖勻，60℃水浴加熱1 h后，用K2HPO4-KH2PO4緩沖液定容。衍生化后的樣品10 000 r/min離心5 min，取0.6 mL入棕色液相瓶中待用。

高效液相色譜法檢測(cè)條件設(shè)置：使用Agilent XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm）。流動(dòng)相A為含1%（體積分?jǐn)?shù)）N，N-二甲基甲酰胺的0.05 mol/ L NaAc和HAc緩沖溶液，流動(dòng)相B為乙腈-水，進(jìn)樣量5 μL。實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫，流動(dòng)相A和B的體積比為：初始A與B的體積比為3：1，10 min 后A與B的體積比為2：3，13 min時(shí)A與B的體積比增至1：19，17 min時(shí)A與B的體積比還原為3：1，20 min洗脫結(jié)束。流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量5μL，二極管陣列（DAD）檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：精確稱(chēng)取瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自Sigma公司）10 mg，用去離子水溶解并定容至5 mL，質(zhì)量濃度為2 g/L。衍生化定容，按照上述液相檢測(cè)方法，分別進(jìn)樣2、4、6、8、10 μL，平行進(jìn)樣5次，記錄瓜氨酸的峰面積。以瓜氨酸的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.4菌株鑒定［16-17］

1）細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征及生化鑒定

將菌株接種到牛肉膏蛋白胨平板和液體培養(yǎng)物中，培養(yǎng)24 h后分別作革蘭染色，光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀察其形態(tài)，并對(duì)11號(hào)菌株進(jìn)行生化鑒定。

2）分子生物學(xué)鑒定

采用16S rDNA序列分析法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。用OMEGA公司的基因組提取試劑盒（E.Z.N. A.TM Bacterial DNA Kit）快速提取菌株基因組DNA。以基因組DNA為模板，以通用引物F27和R1492為引物進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增。

通用引物序列具體如下所示：

F27：5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

R1492：5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：96℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)。72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物交由GENEWIZ公司測(cè)序，進(jìn)行16S rDNA基因序列比對(duì)。

2　結(jié)果與分析

2.1瓜氨酸HPLC檢測(cè)圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

分別進(jìn)樣衍生劑和瓜氨酸衍生后產(chǎn)物，由液相圖譜圖1（a）可知衍生劑的出峰時(shí)間大約為5.768 min，由圖1（b）可知瓜氨酸衍生物的出峰時(shí)間內(nèi)大概為5.159 min左右。

以瓜氨酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸系數(shù)R2=0.997，線(xiàn)性關(guān)系良好。圖1（c）為瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

圖1　瓜氨酸HPLC檢測(cè)圖譜及瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2初篩

將土壤樣品溶于無(wú)菌水梯度稀釋后涂布于固體篩選培養(yǎng)基上，倒置于30℃培養(yǎng)箱中充分培養(yǎng)，挑選出菌落周?chē)a(chǎn)生紅色變色圈的菌株，劃線(xiàn)純化，經(jīng)過(guò)菌落形態(tài)特征觀察和鏡檢，初步認(rèn)定為純種的菌株有168株。將上述菌株接于液體篩選培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)基轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色者為陽(yáng)性，以不加精氨酸的液體篩選培養(yǎng)基作為對(duì)照，排除本身代謝產(chǎn)物呈堿性的菌株，共有45株呈陽(yáng)性，為初篩對(duì)象。

2.3復(fù)篩

將初篩出來(lái)的45株接入50 mL種子液中，活化后按照1.3.3中的方法進(jìn)行復(fù)篩，轉(zhuǎn)化液離心取上清，衍生化后HPLC測(cè)定瓜氨酸質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　不同菌株瓜氨酸質(zhì)量濃度檢測(cè)結(jié)果比較

菌株　　瓜氨酸質(zhì)量濃度/（g·L-1）　菌株　　瓜氨酸質(zhì)量濃度/（g·L-1）29　2.81　38　1.49 30　1.57　39　0.54 31　0.45　40　0.36 32　0.31　41　0.21 33　5.20　42　3.58 34　0.02　43　0.35 35　3.91　44　6.08 36　1.34　45　0.26 37　4.54

由表1可知，經(jīng)HPLC檢測(cè)，11號(hào)菌株轉(zhuǎn)化液中瓜氨酸質(zhì)量濃度最大，遠(yuǎn)高于其他菌株。因此選擇11號(hào)菌作為目的菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。11號(hào)菌轉(zhuǎn)化液HPLC檢測(cè)圖譜見(jiàn)圖2（5.190 min為瓜氨酸衍生物出峰，5.717 min為精氨酸衍生物出峰，5.891 min為剩余衍生劑出峰）。

圖2　11號(hào)菌轉(zhuǎn)化液HPLC檢測(cè)圖譜

2.4菌株鑒定

2.4.1形態(tài)及生化鑒定

菌體在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中形態(tài)：菌落呈圓形，邊緣整齊，凸起，菌落呈白色半透明見(jiàn)圖3（a）。革蘭氏染色后菌體球狀呈陽(yáng)性見(jiàn)圖3 （b），陰性桿菌為實(shí)驗(yàn)室保藏的氣單胞菌。透射電鏡（負(fù)染）下見(jiàn)圖3（c），菌體呈球狀，未見(jiàn)鞭毛。根據(jù)16S rDNA的比對(duì)結(jié)果確定菌株所在的屬，配合《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》研究菌株的生化特征，菌株生化特征見(jiàn)表2。

表2　菌株11生理生化試驗(yàn)

2.4.2分子生物學(xué)鑒定

16S rDNA區(qū)域序列同源性分析是一種常用的細(xì)菌分子鑒定方法。菌株的16S rDNA片段擴(kuò)增后測(cè)序得到一個(gè)長(zhǎng)為1 447 bp的序列，16S rDNA以及Marker的瓊脂糖電泳見(jiàn)圖4（泳道M 為Marker，泳道1為PCR產(chǎn)物）。將所得有效序列在NCBI中進(jìn)行BLAST同源序列搜索，根據(jù)搜索結(jié)果，選取相似性較高的菌種的相關(guān)序列進(jìn)行分析。利用MEGA5軟件中的Neighbor-Joining法對(duì)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，以漫游菌屬（Vagococcus Collins NCBI登錄號(hào)為NR_118902.1）為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap values為100（圖5）。分析結(jié)果表明，菌株11與糞腸球菌遺傳距離最近，同源性高達(dá)99%，因此初步鑒定11為糞腸球菌（Enterococcus faecalis）。

圖3　菌株11形態(tài)觀察

圖4　菌株11 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳凝膠成像圖

圖5　菌株11系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3　討　論

瓜氨酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，有著非常廣泛的應(yīng)用前景。11號(hào)菌株在較為簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝條件下就具有較強(qiáng)的精氨酸生產(chǎn)能力，為酶法生產(chǎn)瓜氨酸工業(yè)化的研究夯實(shí)基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)11號(hào)菌株的形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定，認(rèn)定該菌株為糞腸球菌（Enterococcus faecalis）。初步研究表明，菌株11可將20 g/L的精氨酸轉(zhuǎn)化為9.31 g/L的瓜氨酸，轉(zhuǎn)化率為46.28%。國(guó)內(nèi)對(duì)于糞腸球菌酶法生產(chǎn)瓜氨酸的報(bào)道較多，如王瑩等［18］研究了糞腸球菌SK23.001產(chǎn)瓜氨酸的發(fā)酵條件，優(yōu)化后以蔗糖為碳源，大豆蛋白胨和NH4Cl為氮源，接種為3%，裝液量為50 mL/250 mL，起始pH 6.0，溫度37℃，100 g/L精氨酸轉(zhuǎn)化反應(yīng)6 h，瓜氨酸產(chǎn)量可達(dá)83.06 g/L。李成付等［19］對(duì)復(fù)合誘變后的糞腸球菌NJ402進(jìn)行了精氨酸脫亞胺酶酶學(xué)性質(zhì)研究，經(jīng)SephadexG-75凝膠柱層析純化后，其比酶活為8.151 U/mg。張鵬等［20］用海藻酸鈉對(duì)糞鏈球菌Streptococcus faecalis CGMCC1866進(jìn)行固定化，每升反應(yīng)液能產(chǎn)生瓜氨酸112～165 g/L。本文篩得的11號(hào)菌株并未表現(xiàn)出如此之高的瓜氨酸產(chǎn)量，可能是由于碳氮源等發(fā)酵條件，底物濃度等轉(zhuǎn)化條件不適宜，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢，瓜氨酸產(chǎn)量偏低。若后續(xù)能對(duì)其進(jìn)行復(fù)合誘變，酶定向改造，探索其發(fā)酵、轉(zhuǎn)化等因素的最優(yōu)條件，提高瓜氨酸產(chǎn)量，可能在酶法生產(chǎn)瓜氨酸領(lǐng)域有更廣闊的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Screening and identification of L-citrulline producing strains

WU Shijin，DAI Andi
（College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Abstract：Forty-five L-citrulline producing strains were preliminarily screened from Hangzhou watermelon greenhouse soil using arginine dihydrolase selective medium and their productivities were determined by HPLC. The strain of NO.11 had the highest ability to convert L-arginine to L-citrulline. 20 g/L L-arginine was converted into 9.31 g/L L-citrulline in 60 mL reaction mixture in one day with 0.344 g wet cells. The strain was identified as Enterococcus faecalis by morphology observation，physiological and biochemical characterization and molecular biological identification. Keywords：L-citrulline；Enterococcus faecalis；screening

作者簡(jiǎn)介：吳石金（1971—），男，江西贛州人，教授，博士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與應(yīng)用分子生物學(xué)，E-mail：wujan28@zjut. edu.cn.

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（GB14021050070）

收稿日期：2015-12-04

中圖分類(lèi)號(hào)：Q93

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-2214（2016）02-0088-06