哈志瑞，馬文有，沈春娟，沈　泉，馬吉銀（.寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏銀川750000；.法國(guó)諾華賽分離技術(shù)上海有限公司，上海00000）

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L-色氨酸色譜分離樹脂的篩選

哈志瑞1，馬文有1，沈春娟2，沈泉2，馬吉銀1
（1.寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏銀川750000；2.法國(guó)諾華賽分離技術(shù)上海有限公司，上海200000）

摘要：通過L-色氨酸料液的成分分析，選定YP-001、YP-002、YP-003、YP-004四種樹脂對(duì)色氨酸微濾清液進(jìn)行色譜分離。樹脂篩選結(jié)果顯示：樹脂YP-004對(duì)料液中色氨酸、無機(jī)鹽、糖的分離度最大，分離效果最為顯著。收集液分析結(jié)果表明：色譜處理后色氨酸占干基比重的90%以上，比處理前提高了近1倍左右。

關(guān)鍵詞：L-色氨酸；色譜分離樹脂；篩選

L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，廣泛存在于天然蛋白質(zhì)中，是人和各種動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的必需氨基酸之一［1］，對(duì)人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝起著重要的作用，被稱為第二必需氨基酸。L-色氨酸除在營(yíng)養(yǎng)代謝中起重要作用外，還廣泛用于醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)。和其他生物工程產(chǎn)品一樣，L-色氨酸工業(yè)生產(chǎn)也常常會(huì)受到生產(chǎn)成本的制約，而在生產(chǎn)成本的構(gòu)成中，分離純化等下游工程的成本占相當(dāng)?shù)谋壤?］。目前國(guó)內(nèi)規(guī)?；a(chǎn)L-色氨酸的企業(yè)主要采用三膜法+離交工藝提取色氨酸［3-7］，有的廠家仍使用傳統(tǒng)的活性炭脫色工藝，此提取工藝最大的問題是產(chǎn)品收率低、廢水排放量大、各項(xiàng)單耗高、設(shè)備一次性投資大，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)L-色氨酸的生產(chǎn)成本高、利潤(rùn)低。因此，采取有效措施提高L-色氨酸的收率是目前亟待解決的問題。

色譜分離技術(shù)通過混合物中各組分在色譜分離柱兩相間不斷進(jìn)行著的分配過程實(shí)現(xiàn)分離，是目前最有效的混合物分離、分析方法［8］。眾所周知，色譜分離技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室分析，隨著色譜技術(shù)的不斷進(jìn)步和行業(yè)發(fā)展，使得大規(guī)模的色譜分離技術(shù)被廣泛應(yīng)用于石油化工、淀粉糖等產(chǎn)品的分離純化。通過不斷探索和工藝革新，色譜工藝已經(jīng)具備節(jié)省樹脂用量、節(jié)省再生劑和洗滌水用量、工藝靈活性高、操作簡(jiǎn)單、投資費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，正被更多的行業(yè)所關(guān)注［9］。

在不同產(chǎn)品的色譜分離工藝中，如何找到適合目標(biāo)產(chǎn)物的分離樹脂非常關(guān)鍵。根據(jù)傳統(tǒng)離子交換工藝分離提取氨基酸工藝過程中樹脂的篩選經(jīng)驗(yàn)［10～16］，找到適合色氨酸的色譜分離樹脂，使色氨酸與雜質(zhì)達(dá)到最大的分離度，并且保證色氨酸高純度和高收率是我們研究的重點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)與法國(guó)諾華賽分離技術(shù)有限公司合作，從YP-001（利用各種組分在色譜柱中的遷移速率不同來實(shí)現(xiàn)分離的層析色譜）、YP-002（利用固定相的結(jié)合專一性來分離分子的層析色譜）、YP-003（利用溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同而分離的分配色譜）及YP-004（依據(jù)料液中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的離子交換色譜）等四種功能性色譜樹脂入手，通過單柱色譜分離實(shí)驗(yàn)探索色譜分離工藝在L-色氨酸分離純化中的可行性，期望尋求到適合色氨酸高效分離的色譜樹脂。進(jìn)而應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中，達(dá)到縮短L-色氨酸分離純化工藝路線，提高產(chǎn)品純度及結(jié)晶收率，降低L-色氨酸提取成本的最終目的。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

2.5 cm×40 cm中壓特制層析柱（上海五相儀器儀表有限公司），BSZ-30自動(dòng)部分收集器（上海青浦滬西儀器廠），Agilent LC-1260 HPLC（安捷倫科技有限公司），Atago PAL-3糖度儀（ATAGO（愛拓）中國(guó)分公司），754紫外可見分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司），pH 6.00顯色液，1%色氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），YP-001樹脂（江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司），YP-002樹脂（漂萊特中國(guó)有限公司），YP-003、YP-004（陶氏化學(xué)公司）等。

1.2方法

1.2.1色氨酸發(fā)酵液的制備

色氨酸發(fā)酵液通過三級(jí)發(fā)酵獲得，其工藝流程如下：凍管→斜面→一級(jí)搖瓶→二級(jí)種子罐→發(fā)酵罐發(fā)酵→色氨酸發(fā)酵液。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉20 g/L。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉7.5 g/L，KH2PO41.5 g/L，（NH4）2SO44 g/L，MgSO4·7H2O 3.15 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 75.6 mg/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母浸粉1 g/L，KH2PO41.5 g/L，（NH4）2SO44 g/L，MgSO4·7H2O 3.15 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 75.6 mg/L。

發(fā)酵條件為：35℃，250～550 r/min，通風(fēng)比為1～1.5 vvm，二級(jí)種子罐培養(yǎng)14 h左右，發(fā)酵罐培養(yǎng)32 h。

1.2.2色氨酸發(fā)酵液預(yù)處理

將色氨酸發(fā)酵液用截留分子量為150 kD的陶瓷膜進(jìn)行除菌處理，陶瓷膜清液再經(jīng)0.2 μm膜過濾并脫氣處理后可進(jìn)入色譜系統(tǒng)。

1.2.3色氨酸色譜分離樹脂篩選

將樹脂裝入單柱中，定量注入10 mL色氨酸預(yù)處理液。然后用2 g/L的氨水作為洗脫劑，按0.625 mL/min的流速將樹脂柱中的料液洗脫出來；按10 mL/管的收集量依次收集樹脂柱的出料，直到洗脫結(jié)束為止。試驗(yàn)結(jié)束后，將收集到的樣品，按編號(hào)依次檢測(cè)電導(dǎo)率、還原糖、色氨酸濃度等參數(shù)。

1.2.4色氨酸濃度測(cè)定方法

HPLC法：高效液相色譜分離工作條件Agilent C18（3.5 μm，150 mm×4.6 mm）為分離柱，檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm；柱溫為：39℃；流動(dòng)相：V（0.03%KH2PO4溶液）：V（甲醇）= 90：10；流動(dòng)相流速：1 mL/min。

1.2.5還原糖濃度測(cè)定方法

利用Atago PAL-3糖度儀測(cè)定發(fā)酵液中的還原糖濃度。

1.2.6電導(dǎo)率測(cè)定方法

使用雷磁DDSJ-308A電導(dǎo)率儀進(jìn)行電導(dǎo)率測(cè)定。

2　結(jié)果與分析

2.1進(jìn)料數(shù)據(jù)分析

對(duì)色氨酸陶瓷膜清液進(jìn)行指標(biāo)分析，其中色氨酸濃度測(cè)定基于HPLC分析后的外標(biāo)法所得。結(jié)果如圖1，表1所示。

圖1　進(jìn)料L-色氨酸HPLC圖譜

表1　進(jìn)料L-色氨酸數(shù)據(jù)分析

通過進(jìn)料分析，可以看出色氨酸陶瓷膜清液中其他雜質(zhì)含量達(dá)60%，嚴(yán)重影響色氨酸的一次結(jié)晶率。這些雜質(zhì)中糖、無機(jī)鹽占較大比例。因此選用合適的色譜樹脂將清液中的色氨酸與糖、無機(jī)鹽等雜質(zhì)分離開來，對(duì)提高產(chǎn)品收率將起到關(guān)鍵作用。

2.2各色譜樹脂對(duì)L-色氨酸的分離效果

針對(duì)色氨酸的料液分析，選用YP-001、YP-002、YP-003、YP-004四種有利于分離糖、鹽的不同類型的色譜樹脂對(duì)色氨酸微濾清液進(jìn)行單柱分離試驗(yàn)，結(jié)果參見圖2～5。由圖2～5可以看出：在單柱色譜分離條件下，各色譜樹脂對(duì)色氨酸清液中的主要雜質(zhì)分離效果差異明顯。YP-001分離效果最差，雜質(zhì)和色氨酸不能得到有效分離，YP-002和YP-003可以將色氨酸和雜質(zhì)進(jìn)行部分分離，但會(huì)影響其收率。YP-004對(duì)色氨酸的分離效果最好，分離度最大。在連續(xù)的收集液中，無機(jī)鹽和糖主要集中在0.3～0.5 BV時(shí)流出樹脂柱，色氨酸集中到0.6～0.8 BV時(shí)流出樹脂柱，完全可以實(shí)現(xiàn)雜質(zhì)和色氨酸的有效分離。

圖2　YP-001對(duì)色氨酸的分離效果

圖3　YP-002對(duì)色氨酸的分離效果

圖4　YP-003對(duì)色氨酸的分離效果

圖5　YP-004對(duì)色氨酸的分離效果

2.3 YP-004色譜分離收集液分析

對(duì)YP-004色譜分離樹脂進(jìn)行連續(xù)5批次的色譜分離驗(yàn)證，其分離效果與圖5顯示的分離結(jié)果相一致（圖6所示），可以看出其對(duì)色氨酸與其他雜質(zhì)的分離度較大，重復(fù)性較好。對(duì)分離過程中0.6～0.8 BV時(shí)的收集液進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。由表2可知：使用色譜樹脂YP-004對(duì)色氨酸微濾清液進(jìn)行色譜分離，收集液中糖和鹽得到了有效去除，色氨酸占干基比重近90%，比處理前提高了1倍。

圖6　YP-004色譜樹脂重復(fù)性驗(yàn)證

表2　YP-004色譜分離收集液分析

3　結(jié)論

通過對(duì)色氨酸陶瓷膜清液的檢測(cè)分析和色譜樹脂的篩選試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)色氨酸體系下無機(jī)鹽和糖是影響色氨酸純度的主要雜質(zhì)，色譜樹脂YP-004可以對(duì)其實(shí)現(xiàn)較好的分離，色譜收集液中色氨酸占干基比重比處理前提高了近1倍左右。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Screening of chromatographic resin for L-tryptophan separation

HA Zhirui1；MA Wenyou1；SHEN Chunjuan2；SHEN Quan2；MA Jiyin1
（1. Ningxia Eppen Biotech Co.，Ltd.，Yinchuan 750000，China；2. Novasep Separation Technology Co.，Ltd.，Shanghai 200000，China）

Abstract：Based on the analysis of the components of L -tryptophan fermentation broth after micro-filtrate，four resins named YP-001，YP-002，YP-003 and YP-004 were selected for L-tryptophan separation. The results showed that YP-004 possessed the best separation performance for L-tryptophan，inorganic salt and sugar. The purity of tryptophan reached more than 90%after chromatographic separation，which was nearly 1 fold higher than that before chromatography.

Keywords：L-tryptophan；chromatographic separation resin；screening

作者簡(jiǎn)介：哈志瑞（1982—），男，寧夏銀川人，工程師，碩士，研究方向?yàn)樯锘?，E-mail：hazhirui8201@163.com.通信作者：馬吉銀高級(jí)工程師，E-mail：majiyin@eppen.com.cn.

基金項(xiàng)目：國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目（2014DFA31280）

收稿日期：2016-03-11

中圖分類號(hào)：TQ92

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-2214（2016）02-0106-04