環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其在豬病病原檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其在豬病病原檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

于新友，李天芝

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)是一門(mén)新興的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，因其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)便和成本低等特點(diǎn)，越來(lái)越受到獸醫(yī)相關(guān)工作者的關(guān)注。目前，該方法己被廣泛應(yīng)用各種豬病病原的檢測(cè)。通過(guò)綜述LAMP 技術(shù)在豬傳染病檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展情況，以期為今后豬病的診斷和防控工作提供參考。

LAMP技術(shù)；豬病；病原；檢測(cè)；應(yīng)用

豬傳染病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的威脅時(shí)刻存在，目前養(yǎng)殖場(chǎng)主要是將病料送專(zhuān)業(yè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原分離鑒定或PCR檢測(cè)，一旦出現(xiàn)疫情，由于條件所限，很難實(shí)現(xiàn)對(duì)疫病的快速檢測(cè)。日本學(xué)者Notomi 等[1]開(kāi)發(fā)了一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (loopmediated isothermal amplification，LAMP) 技術(shù)，該技術(shù)不需要模板的熱變性[2]、長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳和紫外觀察等過(guò)程，整個(gè)反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后，結(jié)果可用肉眼直接觀察[3]，在疫病診斷領(lǐng)域顯示了廣闊的應(yīng)用前景，本文就LAMP技術(shù)及其在豬病病原檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展綜述如下。

1 LAMP技術(shù)

1．1 LAMP擴(kuò)增原理

LAMP技術(shù)是針對(duì)靶基因6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特殊引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，在65 ℃左右溫度下，啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，完成對(duì)目標(biāo)DNA的大量擴(kuò)增。在LAMP反應(yīng)中，內(nèi)引物雜交在目標(biāo)DNA區(qū)，啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，導(dǎo)致啞鈴狀DNA產(chǎn)生。這種結(jié)構(gòu)很快以自身為板，進(jìn)行DNA合成延伸，形成莖-環(huán)DNA結(jié)構(gòu)，然后以此結(jié)構(gòu)作為L(zhǎng)AMP循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。由于內(nèi)引物雜交在莖-環(huán)的環(huán)上，引物鏈置換合成的DNA產(chǎn)生一個(gè)有缺口的莖-環(huán)DNA中間媒介，在莖上附有目標(biāo)序列。再通過(guò)外引物，在莖的末端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)果在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。

圖1 LAMP的引物組成及對(duì)應(yīng)區(qū)域

1．2 LAMP引物設(shè)計(jì)

首先在靶基因的3’末端設(shè)定F3c、F2c、F1c三個(gè)區(qū)段，在5’末端設(shè)定B1、B2、B3三個(gè)區(qū)段。針對(duì)這6個(gè)區(qū)段設(shè)計(jì)4條引物，包括一對(duì)內(nèi)部引物和一對(duì)外部引物。上游內(nèi)部引物FIP：在3’末端含有與F2c互補(bǔ)的F2區(qū)段，在5’末端含有與F1c相同序列的區(qū)段下游內(nèi)部引物BIP：在3’末端含有與B2c互補(bǔ)的B2區(qū)段，在5’末端含有與B1c相同序列的區(qū)段。上游外部引物F3：含有與目標(biāo)DNA上的F3序列相同的區(qū)段。下游外部引物B3：含有與目標(biāo)DNA的B3相同序列的區(qū)段，各引物組成及對(duì)應(yīng)區(qū)域如圖1所示。引物的設(shè)計(jì)要注意以下幾個(gè)問(wèn)題：1）擴(kuò)增領(lǐng)域?yàn)镕2-B2區(qū)段間，應(yīng)該在200 bp以?xún)?nèi)；2）包含F(xiàn)2/B2在內(nèi)的環(huán)狀部分的長(zhǎng)度在40～60 bp范圍內(nèi)；3）各區(qū)段的Tm值應(yīng)該在60～65 ℃之間；4）若只是為了鑒定靶基因存在與否，F(xiàn)1-B1的間距可以為零；5）引物應(yīng)避免二次結(jié)構(gòu)發(fā)生；6）各引物的3’端不可含有與其他引物互補(bǔ)的序列。

1．3 LAMP技術(shù)特點(diǎn)

LAMP技術(shù)特點(diǎn)具有以下特點(diǎn)：1）操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、成本低，擴(kuò)增反應(yīng)在等溫下持續(xù)進(jìn)行，只需在恒溫水浴鍋中幾十分鐘即可完成，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性，適合在基層養(yǎng)殖場(chǎng)的推廣應(yīng)用；2）擴(kuò)增的效率高，沒(méi)有PCR反應(yīng)中溫模板的退火、復(fù)性過(guò)程，在15～60 min內(nèi)可擴(kuò)增109～1010倍，能滿(mǎn)足臨床病料樣本快速檢測(cè)的需要；3）特異性高，由于是針對(duì)靶序列6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)的4種特異性引物，6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，故其特異性極高。針對(duì)6個(gè)區(qū)段使用4種不同的引物，可特異性擴(kuò)增靶基因序列；4）靈敏度高，檢測(cè)的敏感性是常規(guī)PCR的10倍，擴(kuò)增模板可達(dá)10拷貝或更少；5）僅使用一種鏈置換型BstDNA聚合酶，因BstDNA聚合酶是一種不耐熱的DNA聚合酶，因此必須在模板預(yù)變性以后再加樣；6）擴(kuò)增產(chǎn)物是在同一條DNA鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成大小不一的結(jié)構(gòu)；7）當(dāng)模板是RNA時(shí)，僅需加入逆轉(zhuǎn)錄酶即可與DNA一樣進(jìn)行擴(kuò)增。

1．4 反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)

LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)方法主要有5種：1）以2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有典型的梯狀條帶泳判定結(jié)果；2）以擴(kuò)增產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀的產(chǎn)生用肉眼直接判斷擴(kuò)增反應(yīng)是否進(jìn)行；3）反應(yīng)體系中加入溴化乙錠、SYBR Green Ⅰ等染料，通過(guò)觀察擴(kuò)增結(jié)果是否產(chǎn)生相應(yīng)顏色來(lái)判定是否有目的片段擴(kuò)增；4）通過(guò)恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片實(shí)時(shí)觀察反應(yīng)結(jié)果；5）運(yùn)用實(shí)時(shí)濁度儀監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)果。

2 在豬細(xì)菌病檢測(cè)中的應(yīng)用

2．1 豬霍亂沙門(mén)氏菌檢測(cè)

豬霍亂沙門(mén)氏菌是引起豬沙門(mén)氏菌病的主要血清型，主要感染斷奶期仔豬，引發(fā)仔豬副傷寒，臨床上以急性敗血癥、慢性壞死性腸炎、頑固性下痢等為特征，當(dāng)并發(fā)或繼發(fā)感染其他疾病或治療不及時(shí)時(shí)，死亡率較高，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重困擾著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。時(shí)建立等[4]根據(jù)豬霍亂沙門(mén)氏菌lacZ基因設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)優(yōu)化各種反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)豬霍亂沙門(mén)氏菌的LAMP快速檢測(cè)方法，該法特異性好，靈敏度高，將細(xì)菌DNA稀釋到10-8仍可檢出，是PCR方法的1 000倍。

2．2 豬鏈球菌血清2型檢測(cè)

豬鏈球菌2型(SS2)是一種重要的人獸共患病病原菌，它能引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、肺炎和突然死亡，各年齡段豬均可感染豬鏈球菌病，但以3～12周齡豬，尤其斷奶仔豬最易感[5]，該病已成為嚴(yán)重影響各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一種重要疫病[6]。張九州等[7]根據(jù)GenBank登錄的豬鏈球菌2型特異的莢膜多糖(cps2 H)基因序列作為檢測(cè)靶標(biāo)，在其序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)LAMP引物，利用參考菌株S735基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，優(yōu)化了LAMP的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，并進(jìn)行了敏感性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，該法對(duì)SS2進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物顯色呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，電泳出現(xiàn)階梯狀條帶，最低檢測(cè)量為0.186fg/μL模板DNA，比常規(guī)PCR高1 000倍，且與其他常見(jiàn)的細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng)。

2．3 副豬嗜血桿菌檢測(cè)

副豬嗜血桿菌(Hps)可引起豬的副豬嗜血桿菌病，該病以纖維素性漿膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征。近幾年來(lái)，世界各地均有發(fā)生副豬嗜血桿菌病的報(bào)道，并且發(fā)病率呈上升的趨勢(shì)，已經(jīng)成為一個(gè)全球性的重要豬病[8]。隨著我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，該病發(fā)生呈加速流行趨勢(shì)并成為多病原呼吸道疾病綜合征中的重要一員，危害日漸嚴(yán)重，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。車(chē)勇良等[9]建立了Hps可視化LAMP檢測(cè)方法，在55 ℃水浴1h即可對(duì)Hps核酸進(jìn)行高效擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR Green Ⅰ即可通過(guò)肉眼觀察對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。該方法具有很強(qiáng)的特異性，其對(duì)DNA核酸的最低檢測(cè)限為40fg，是常規(guī)PCR檢測(cè)最低限的100倍，顯示出較高的敏感性。

2．4 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌檢測(cè)

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(APP)作為豬傳染性胸膜肺炎的病原菌，可引起嚴(yán)重的傳染性呼吸道疾病，該病具有高發(fā)病率和致死率，廣泛分布于中國(guó)、美國(guó)、日本等全世界所有養(yǎng)豬的國(guó)家，主要感染生長(zhǎng)肥育豬，可引起發(fā)燒、腹瀉以及嚴(yán)重的呼吸窘迫。劉亞娟等[10]根據(jù)APP ApxIVA基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)6條-LAMP引物，建立了APP的 LAMP方法。結(jié)果顯示，該法在64 ℃下反應(yīng)15 min DNA即可出現(xiàn)擴(kuò)增，擴(kuò)增后2～3 min內(nèi)即可判定結(jié)果，最低檢測(cè)限為0.307 ng/L，具有良好的重復(fù)性及穩(wěn)定性，與其他病原菌無(wú)交叉反應(yīng)，同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果可實(shí)現(xiàn)肉眼可視化觀察。

2．5 豬多殺性巴氏桿菌檢測(cè)

豬多殺性巴氏桿菌(Pm)為豬呼吸道綜合征的主要病原之一，可原發(fā)或繼發(fā)豬呼吸道綜合征，降低飼料利用率，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。孫建華等[11]根據(jù)豬多殺性巴氏桿菌Plp B基因序列為靶基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立了豬Pm特異性的LAMP快速檢測(cè)方法。經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化，確定反應(yīng)條件為63 ℃、20 min。檢測(cè)結(jié)果顯示，建立的LAMP檢測(cè)方法具有良好的特異性，靈敏度為25 cfu/mL，與大腸桿菌、Hps、APP、沙門(mén)氏菌無(wú)任何交叉反應(yīng)。

2．6 金黃色葡萄球菌檢測(cè)

金黃色葡萄球菌感染可造成豬的急性、亞急性或慢性乳腺炎，壞死性葡萄球菌皮炎及乳房的膿皰病。蔡克周等[12]以金黃色葡萄球菌(CMCC10201)的femA基因作為靶序列，設(shè)計(jì)LAMP和PCR引物，通過(guò)凝膠電泳，判斷檢測(cè)結(jié)果。對(duì)8株常見(jiàn)致病菌進(jìn)行LAMP特異性實(shí)驗(yàn)，表明對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)具有很高的特異性，LAMP檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靈敏度為8.7 CFU/ mL，直接檢測(cè)豬血中金黃色葡萄球菌的檢出限為8.7×102CFU/mL，PCR法的檢出限為8.7×103CFU/mL。

3 在豬病毒病檢測(cè)中的應(yīng)用

3．1 豬瘟病毒檢測(cè)

豬瘟是黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒(CSFV)引起的一種豬急性、熱性、高度接觸性傳染病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，其發(fā)病率和死亡率均高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害十分嚴(yán)重[13]。張改平等[14]比較分析了CSFV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株、疫苗株、不同基因亞型的野毒株的全基因組序列差異，設(shè)計(jì)一套分別針對(duì)豬瘟強(qiáng)毒與弱毒NS5B基因的LAMP引物，建立特異性的豬瘟強(qiáng)毒株與疫苗株的LAMP檢測(cè)方法。該方法特異性好，比RT-PCR靈敏度高出1 000倍，且重復(fù)性穩(wěn)定性良好，為快速準(zhǔn)確地鑒別CSFV野毒感染和疫苗接種提供了有效的方法。鄭新添等[15]針對(duì)CSFV的NS3基因設(shè)計(jì)LAMP引物，建立了快速檢測(cè)CSFV的LAMP方法，并對(duì)LAMP反應(yīng)體系、反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，評(píng)定其特異性和敏感性。結(jié)果表明：該方法可在65 ℃、50 min內(nèi)快速擴(kuò)增CSFV，擴(kuò)增結(jié)果可通過(guò)可視的顏色判斷，LAMP反應(yīng)對(duì)豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等無(wú)交叉反應(yīng)，其檢測(cè)CSFV的最低濃度為13.6 fg/μL，對(duì)臨床樣品的檢出率高于RT-PCR技術(shù)。

3．2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的一種接觸性傳染病，各日齡豬均可感染，臨床上主要表現(xiàn)為母豬繁殖障礙和仔豬呼吸癥狀。PRRSV具有高度傳染性，既能垂直傳播又能水平傳播，在世界各國(guó)蔓延，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，引起了各國(guó)政府的高度重視。蒲靜等[16]針對(duì)PRRSV美洲型ORF6基因的6個(gè)區(qū)域，利用2對(duì)引物建立檢測(cè)PRRSV的RTLAMP快速檢測(cè)方法，該方法具有高靈敏度，高特異性的優(yōu)點(diǎn)，在2 h左右即可得出結(jié)果，其靈敏度與PRRSV熒光RT-PCR檢測(cè)方法相近，高于普通RT-PCR檢測(cè)方法。將滅活的PRRSV美洲型培養(yǎng)物作10倍系列稀釋?zhuān)Y(jié)果顯示建立的熒光RT-PCR的檢測(cè)極限可達(dá)10-7，RT-PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)極限為10-5，RT-LAMP檢測(cè)方法達(dá)到10-8。羅忠永等[17]根據(jù)PRRSVM蛋白基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的LAMP引物，建立了PRRSV的快速檢測(cè)方法，結(jié)果表明，該法能在64.5 ℃、60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸片段的大量擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)直接觀察反應(yīng)副產(chǎn)物(焦磷酸鎂)進(jìn)行判讀，該檢測(cè)系統(tǒng)具有很高的特異性，與CSFV、豬乙型腦炎病毒等均無(wú)交叉反應(yīng)，通過(guò)PRRSV不同毒株疫苗、模擬樣品和臨床樣品確定，該檢測(cè)系統(tǒng)具有很好的穩(wěn)定性，通過(guò)質(zhì)粒確定該檢測(cè)系統(tǒng)可以檢測(cè)到10拷貝/μL的病毒核酸模板。

3．3 豬偽狂犬病病毒檢測(cè)

豬偽狂犬病病毒(PRV)主要引起母豬繁殖障礙、流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎、死胎和產(chǎn)弱仔，初生仔豬表現(xiàn)為腹瀉及神經(jīng)癥狀，感染率和死亡率可達(dá)100%，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。張莉等[18]針對(duì)PRVgE基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)并合成了4條引物，建立了PRV的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，并進(jìn)行了特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，該方法可特異性地檢測(cè)PRV強(qiáng)毒株，不能檢測(cè)PRRSV、豬細(xì)小病毒、CSFV、豬流感病毒和PRVgE基因缺失疫苗株，該方法的最低檢測(cè)量可達(dá)100個(gè)拷貝質(zhì)粒DNA，比常規(guī)PCR方法的敏感性高10倍。王樹(shù)芬等[19]設(shè)計(jì)并合成3對(duì)LAMP引物，以羅丹明B衍生物作指示劑(該指示劑在反應(yīng)前加到反應(yīng)緩沖液里)，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了可視化LAMP快速檢測(cè)PRV的方法，該法在63 ℃恒溫反應(yīng)40 min可得到肉眼可視結(jié)果，顏色變成藍(lán)色判定為陽(yáng)性，仍然保持紫色判定為陰性。

3．4 豬圓環(huán)病毒2型檢測(cè)

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原，此外，PCV2還與豬呼吸道綜合征、豬皮炎與腎炎綜合征和繁殖障礙以及腸炎等疾病有關(guān)，是一種免疫抑制性疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。楊澤曉等[20]建立了快速檢測(cè)PCV2的LAMP方法，在64 ℃、45 min條件下可擴(kuò)增出大于1 345 bp的特異性梯狀DNA條帶，檢測(cè)限度可達(dá)10 拷貝/μL，用它對(duì)PCV1、PPV、PRV、PRRSV和CSFV的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，但結(jié)果均為陰性。用建立的LAMP方法進(jìn)行的樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，6株受檢PCV2毒株的檢出率為100%，60份臨床檢樣PCV2的陽(yáng)性率為20%(12/60），與PCR方法平行檢測(cè)的結(jié)果相一致。胡瑞麗等[21]根據(jù)PCV2的ORF2基因設(shè)計(jì)出3對(duì)特異性引物，擴(kuò)增PCV2基因的最佳溫度和時(shí)間優(yōu)化到59 ℃孵育55 min。用該方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，LAMP檢測(cè)對(duì)PCV2的檢測(cè)限為10拷貝/μL，而常規(guī)PCR檢測(cè)法的檢測(cè)限為1 000拷貝/μL，表明LAMP檢測(cè)法靈敏度高。該檢測(cè)法不會(huì)與豬圓環(huán)病毒Ⅰ型、PRRSV、豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。

3．5 PPV檢測(cè)

豬細(xì)小病毒(PPV)可引起母豬發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、產(chǎn)畸形胎、胎兒木乃伊化和不孕等，初產(chǎn)母豬受到的危害最為嚴(yán)重。劉業(yè)兵等[22]據(jù)GenBank公布的PPV序列，在其保守序列區(qū)域設(shè)計(jì)了多套LAMP引物，建立了對(duì)PPV LAMP檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，該法在63 ℃恒溫下作用45 min，PPV病毒DNA獲得了高效率的特異性擴(kuò)增，其檢出限量為0.23TCID50，敏感性高，在反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR Green I以肉眼判斷結(jié)果，與Real Time Turbidimeter LA-320儀監(jiān)測(cè)結(jié)果一致。陳星瑤等[23]建立了快速檢測(cè)PPV的LAMP方法，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，擴(kuò)增的溫度60 ℃、62 ℃、64 ℃和66 ℃均可以，最佳擴(kuò)增時(shí)間為45 min，最低可檢測(cè)10拷貝的PPV核酸模板量，特異性良好，對(duì)SS2、豬水泡病病毒、PRV、CSFV、豬流感病毒、O型口蹄疫病毒、PRRSV和水?dāng)U增結(jié)果均為陰性，不需要電泳檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果，只需向產(chǎn)物管內(nèi)加SYBR Green Ⅰ熒光染料，肉眼觀察，陽(yáng)性反應(yīng)管顏色立刻變?yōu)辄S綠色，且模板濃度不同顏色有深淺變化，結(jié)果容易判定，適于臨床推廣。

3．6 豬乙型腦炎病毒檢測(cè)

乙型腦炎是由乙型腦炎病毒(JEV)引起的一種人畜共患的自然疫源性傳染病，JEV主要通過(guò)蚊蟲(chóng)叮咬傳播，豬是其主要傳染來(lái)源和擴(kuò)散宿主，可導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱仔，公豬睪丸炎，育肥豬持續(xù)高熱，新生仔豬呈神經(jīng)癥狀等，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盧冰霞等[24]根據(jù)豬JEV E基因序列的保守區(qū)6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)了4條特異性LAMP引物，以JEV陽(yáng)性樣品RNA為模板進(jìn)行一步法擴(kuò)增，并對(duì)反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示該方法具有較高的靈敏度，其檢測(cè)極限為0.5 pg，特異性試驗(yàn)表明其具有較高的特異性，對(duì)其他病毒性病原體均無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)。與RT-Nested-PCR相比，2種方法檢出率的符合率為90.9%。反應(yīng)結(jié)束后可以通過(guò)添加化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行可視化觀察，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。周玉鵬等[25]根據(jù)Gen Bank中登錄的基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV毒株基因序列，分別設(shè)計(jì)了1套基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特異性RT-LAMP引物，并以此引物分別建立了基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特異性RTLAMP方法。結(jié)果顯示，基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特異性RT-LAMP方法均能在1 h內(nèi)完成對(duì)相應(yīng)基因型JEV的RNA擴(kuò)增，并與CSFV、PRRSV、PCV2、PPV和PRV無(wú)交叉反應(yīng)。靈敏性試驗(yàn)結(jié)果顯示，基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV特異性RT-LAMP方法均能擴(kuò)增出24拷貝的JEV RNA。

3．7 豬流行性腹瀉病毒檢測(cè)

豬流行性腹瀉病毒 (PEDV)可感染豬而導(dǎo)致豬流行性腹瀉，該病的主要特征是豬嘔吐、脫水和水樣腹瀉，是一種高度接觸性腸道傳染病，多發(fā)生于冬、春季節(jié)，但夏季也可發(fā)病。該病最初于發(fā)生在英國(guó)，隨后世界各地均有相關(guān)報(bào)道，我國(guó)于1976年最初報(bào)道該病。各日齡的豬均可感染PEDV發(fā)病，其中哺乳仔豬受到的危害最嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。Gou等[26]建立了PEDV的LAMP檢測(cè)方法，該方法在62℃水浴條件下，40 min即可完成反應(yīng)，結(jié)果顯示，該法最低可檢測(cè)10 pg的RNA量，該法特異性好，對(duì)常見(jiàn)豬病毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，且不與其他常見(jiàn)豬病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng)。湯小真等[27]針對(duì)PEDV的NP基因設(shè)計(jì)1套LAMP引物，在反應(yīng)體系中添加鈣黃綠素/氯化錳指示劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的反應(yīng)后添加SYBR GreenⅠ染料，建立了基于鈣黃綠素的可視化LAMP檢測(cè)PEDV的方法。該方法能在65℃、1 h內(nèi)特異性擴(kuò)增PEDV，與CSFV、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒及大腸桿菌等均無(wú)交叉反應(yīng)，檢測(cè)下限為3.73 pg/μL，其結(jié)果可用肉眼判斷，快捷方便。

3．8 豬傳染性胃腸炎病毒檢測(cè)

傳染性胃腸炎病毒(TGEV)可引起豬傳染性胃腸炎，該病是一種以嘔吐、水樣腹瀉、脫水為主要特征高度傳染性疾病，秋始、冬春為該病高發(fā)期。目前我國(guó)大部分地區(qū)都有該病發(fā)生流行，各種不同品種和月齡的豬都能感染TGEV發(fā)病，2周齡受到的危害最為嚴(yán)重，一旦感染后，其死亡率可高達(dá)100%。5周齡以上的豬感染后雖然死亡率不高，但生長(zhǎng)緩慢，飼料利用率低，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。高睿澤等[28]建立針對(duì)豬TGEV N基因RT-LAMP快速檢測(cè)方法，并對(duì)該檢測(cè)方法的特異性與靈敏性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。該方法在63 ℃恒溫下作用50 min，使豬TGEV的 N基因獲得了高效率特異性擴(kuò)增，與PEDV等其他豬易感病毒無(wú)交叉反應(yīng)，具有很好的特異性，同時(shí)該方法具有極高的靈敏性，可檢測(cè)到131.4 fg/ μL的目標(biāo)病毒RNA，比普通PCR的靈敏度高3個(gè)數(shù)量級(jí)，反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR GreenⅠ在紫外燈下觀察顏色變化，結(jié)果顯示陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)綠色熒光。

3．9 豬流感病毒檢測(cè)

豬流感病毒(SIV) 可引起豬流感，該病一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病，有明顯的季節(jié)性，深秋、早春和冬季多發(fā)，各種年齡、性別和品種的豬均易感，臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)病急、呼吸困難、咳嗽、流淚、鼻液增多、衰竭、低死亡率等。目前，已經(jīng)分離到多種血清型，在我國(guó)豬群中流行較廣的主要是H1N1、H1N2和H3N2。蘇霞等[29]從GenBank中獲得H1N1 SIV血凝素、神經(jīng)氨酸酶基因序列，應(yīng)用DNAStar軟件MegAlign程序分析其序列，利用Primer ExplorerV4軟件在序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)LAMP引物，即外引物和內(nèi)引物，同時(shí)以H1N1 SIV的cDNA作為陽(yáng)性模板，對(duì)試驗(yàn)中的幾個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。建立H1N1 SIV LAMP快速檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該法對(duì)H1N1 SIV的靈敏度達(dá)到4～6個(gè)拷貝，其引物對(duì)于H9亞型禽流感病毒、CSFV和PCV2均無(wú)非特異性擴(kuò)增，表現(xiàn)出良好的特異性。張莉等[30]針對(duì)SIV NP基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)并合成6條引物，建立了SIV的LAMP檢測(cè)方法，并進(jìn)行了特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，該方法可特異性檢測(cè)H1N1、H1N2、H3N2、類(lèi)禽H1N1亞型SIV及甲型H1N1流感病毒，但不能檢測(cè)PRRSV、PRV、CSFV、PPV、PCV2、JEV，該方法的最低檢測(cè)量為100拷貝/μL質(zhì)粒DNA。

3．10 其他病毒

LAMP技術(shù)還用于口蹄疫病毒[31]、非洲豬瘟病毒[32]、豬腦心肌炎病毒[33]和豬巨細(xì)胞病毒[34]、豬細(xì)環(huán)病毒[35]、水皰性口炎病毒[36]等多種病毒的檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果都表明LAMP是一種簡(jiǎn)便、快速、高靈敏和高特異的核酸擴(kuò)增方法。

4 在豬支原體肺炎檢測(cè)中的應(yīng)用

豬肺炎支原體（Mhp）可引起豬支原體肺炎，該病是一種慢性呼吸道傳染病，臨床上以咳嗽、氣喘和肺部典型的“蝦肉”樣變?yōu)樘卣?，具有接觸傳染性高、死亡率低和誘發(fā)性強(qiáng)的特點(diǎn)。Mhp是重要的豬支原體病原之一，可導(dǎo)致豬地方性肺炎。不同年齡、性別、品種的豬群均可感染，以咳嗽和氣喘為主要癥狀。李鵬[37]等根據(jù)GenBank中登錄的Mhp的核苷酸序列，設(shè)計(jì)4條特異性引物，用外引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì)內(nèi)外引物濃度、dNTP＋和MgSO4濃度及Bst DNA聚合酶用量等進(jìn)行優(yōu)化，建立MhpLAMP檢測(cè)方法，應(yīng)用該方法檢測(cè)Pm、APP、肺炎雙球菌、支氣管敗血波氏桿菌、Hps和鏈球菌均呈陰性，當(dāng)Mhp的拷貝數(shù)高于3時(shí)，均可檢測(cè)到該病原體。

5 在豬寄生蟲(chóng)病檢測(cè)中的應(yīng)用

剛地弓形蟲(chóng)可引起豬弓形蟲(chóng)病，弓形蟲(chóng)通過(guò)口、眼、鼻、呼吸道、腸道及皮膚等途徑侵入豬體，以高熱、呼吸及神經(jīng)癥狀及繁殖障礙為特征。王玉嬌等[38]建立了豬弓形蟲(chóng)病LAMP檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，該法在樣本DNA稀釋3×105倍后仍可檢出，該方法擴(kuò)增不出新孢子蟲(chóng)、瑟氏泰勒蟲(chóng)及豬附紅細(xì)胞體等病原體DNA，表明建立的LAMP方法具有靈敏、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)，適合于豬弓形蟲(chóng)病的檢測(cè)。豬附紅細(xì)胞體病是由豬附紅細(xì)胞體寄生于豬紅細(xì)胞表面或游離在血漿中引起豬的以貧血、黃疸、發(fā)熱等為主要臨床特征的豬附紅細(xì)胞體病，該病也是一種人畜共患病。李月梅等[39]建立了豬附紅細(xì)胞體的LAMP檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，用10倍系列稀釋的DNA樣品對(duì)該檢測(cè)方法的靈敏度進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果表明：利用LAMP技術(shù)成功檢測(cè)到豬附紅細(xì)胞體基因區(qū)，該法最低可檢測(cè)5×105倍稀釋的DNA量，并且特異性強(qiáng)，對(duì)新孢子蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、瑟氏泰勒蟲(chóng)病原體檢測(cè)均為陰性。

6 小結(jié)

LAMP技術(shù)作為一種快速基因擴(kuò)增技術(shù)，自發(fā)明以來(lái)，在國(guó)內(nèi)外疾病、衛(wèi)生、食品及環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域都取得了重大成就，近年來(lái)受到了越來(lái)越多的關(guān)注，LAMP是整個(gè)過(guò)程均在恒溫條件下進(jìn)行，不需要昂貴儀器設(shè)備，而易在基層部門(mén)普及的檢測(cè)技術(shù)，避免了常規(guī)PCR對(duì)于溫度循環(huán)的特殊要求所帶來(lái)的各種不便，可快速、準(zhǔn)確地做出傳染性病病原學(xué)診斷，從而及時(shí)有效控制疫情，使養(yǎng)殖場(chǎng)損失降到最低。但LAMP檢測(cè)技術(shù)同樣存在一些不足，一是LAMP對(duì)于引物設(shè)計(jì)要求很高，需要設(shè)計(jì)的引物數(shù)目多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。二是檢測(cè)靈敏度太高，易因空氣中的氣溶膠污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。三是在LAMP擴(kuò)增結(jié)果判定方面也存在一定的問(wèn)題，當(dāng)以瓊脂糖凝膠電泳法判定結(jié)果時(shí)，結(jié)果為梯形條帶，不易鑒別非特異性擴(kuò)增。當(dāng)焦磷酸鎂白色沉淀和體系中添加染料法判定結(jié)果時(shí)，可能存在因結(jié)果顏色不明顯而造成肉眼觀察不便捷及誤判，另外，當(dāng)有非特異擴(kuò)增時(shí)，染料也可結(jié)合，影響結(jié)果判定。當(dāng)采用微流控芯片和實(shí)時(shí)濁度儀法判定結(jié)果時(shí)，則需要購(gòu)置昂貴的分析儀器。隨著研究的不斷深入，研究人員還將其與原位雜交、免疫捕獲、核酸雜交等技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合，開(kāi)發(fā)了很多有效的檢測(cè)方法，尤其是將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增與橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)結(jié)合，發(fā)展起來(lái)的新的將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)與橫向流動(dòng)試紙條(LFD)聯(lián)合應(yīng)用，建立一種新的病原快速檢測(cè)技術(shù)，即LAMP-LFD技術(shù)。使得LAMP現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果的觀察更加方便、直觀和準(zhǔn)確。并解決了擴(kuò)增產(chǎn)物形成氣溶膠污染環(huán)境，導(dǎo)致樣品間交叉污染的問(wèn)題，開(kāi)啟了基因檢測(cè)技術(shù)步入了基層養(yǎng)殖場(chǎng)的應(yīng)用新時(shí)代，極具推廣前景。目前已經(jīng)有科研人員在CSFV的檢測(cè)方面[40]進(jìn)行了一些探索，并取得了一定的成績(jī)，筆者認(rèn)為L(zhǎng)AMP-LFD技術(shù)是未來(lái)LAMP檢測(cè)技術(shù)將來(lái)的發(fā)展的方向，在一些基層實(shí)驗(yàn)室和流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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2016-06-01）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-06-022-15)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2013CQ006)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2014CQ010)

于新友(1983-)，男，漢族，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病診斷技術(shù)研究.