韓書芝，梁會朋，張鳳蕊，平芬

（1.河北省人民醫(yī)院呼吸科，河北石家莊050051；2.河北省胸科醫(yī)院，河北石家莊050048）

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大氣細顆粒物對大鼠白細胞介素17表達的影響及連花清瘟的干預作用

韓書芝1，梁會朋2，張鳳蕊1，平芬1

（1.河北省人民醫(yī)院呼吸科，河北石家莊050051；2.河北省胸科醫(yī)院，河北石家莊050048）

摘要：目的探討大氣細顆粒物（PM2.5）急性暴露對大鼠肺部損傷的作用，及高、中、低劑量連花清瘟對其的保護作用。方法48只Wistar大鼠，隨機分為4個實驗組（PM2.5染塵組及高、中、低劑量連花清瘟干預組）和2個對照組（空白對照組及生理鹽水對照組）。由石家莊市環(huán)境監(jiān)測中心提供空氣細顆粒物，制備PM2.5懸液，采用氣管內滴注法。空白對照組無任何干預措施；生理鹽水對照組給予氣管滴注生理鹽水（1 ml/kg）；染塵組給予一次性氣管內滴入PM2.5懸液（7.5 mg/kg）；3組干預組首先分別連續(xù)灌胃給予低（生藥2 g/kg）、中（生藥4 g/kg）、高（生藥8 g/kg）劑量的連花清瘟溶液4 d，第4天灌胃給藥后分別經氣管滴入PM2.5懸液（7.5 mg/kg）。應用酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法測定各實驗組動物血清白細胞介素17（IL-17）及肺表面活性蛋白A （SP-A）水平，并在光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)變化。結果空白對照組和生理鹽水對照組間血清IL-17及SP-A差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），染塵組血清IL-17及SP-A水平較生理鹽水對照組及空白對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高、中、低劑量干預組較染塵組血清IL-17及SP-A水平均有不同程度降低，中高劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論PM2.5急性暴露可以導致大鼠肺部損傷，連花清瘟對肺部損傷有保護作用。

關鍵詞：環(huán)境細顆粒物（PM2.5）；肺損傷；白細胞介素17；肺表面活性蛋白A；連花清瘟

大量流行病學研究表明，大氣細顆粒物（PM2.5）與呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病及癌癥等的入院率、發(fā)病率、死亡率密切相關［1］。PM2.5對健康的不利影響首先表現在呼吸系統(tǒng)，它會增加呼吸道感染、肺結核、肺癌等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率［2］。PM2.5通過損傷呼吸道黏膜上皮細胞，部分沉積在肺泡內或肺間質內，激活肺內的免疫細胞，引起氣道炎癥反應，造成呼吸系統(tǒng)疾?。?］。中藥復方制劑連花清瘟膠囊具有清瘟解毒，宣肺泄熱的功效，已被廣泛地應用于多種流感病毒感染引起的呼吸系統(tǒng)疾?。?］。本研究采集本地區(qū)大氣細顆粒物，制備PM2.5懸液，觀察PM2.5暴露及連花清瘟干預后大鼠血清中白細胞介素17（interleukin，IL-17）及表面活性蛋白A（surfactant protein，SP-A）的變化，探討PM2.5對大鼠肺的損傷作用及連花清瘟的保護作用。

1　材料與方法

1.1PM2.5懸液配制

PM2.5由石家莊市環(huán)境監(jiān)測中心提供，采用TEOM1405D雙通道顆粒物監(jiān)測儀收集大氣細顆粒物，洗脫濾膜顆粒物，冷凍干燥，使用前以滅菌注射用水配制成濃度為7.5 mg/ml PM2.5懸液，超聲震蕩混勻。連花清瘟溶液為連花清瘟干膏粉41.73 g、20.87 g及10.43 g分別加入羥甲基纖維素鈉溶液，配制成80%、40%和20%的高、中、低劑量連花清瘟溶液。

1.2實驗動物分組及給藥方法

48只雄性Wistar大鼠（河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供），體重180～200 g，隨機分為4個實驗組（PM2.5染塵組及高、中、低劑量連花清瘟干預組）和2個對照組（空白對照組及生理鹽水對照組），每組8只。實驗動物在丙戊酸鈉腹腔注射麻醉下氣管注入PM2.5懸液染塵。空白對照組不予任何干預措施，生理鹽水對照組給予氣管內注入生理鹽水（1 ml/kg）1次。染塵組給予氣管內注入PM2.5懸液1 ml/kg （7.5 mg/kg）1次。連花清瘟干預組給予連花清瘟溶液10 ml/kg（相當于給予高、中、低劑量連花清瘟8g/kg、4 g/kg及2 g/kg）灌胃，共給藥4 d，第4天灌胃后給予PM2.5懸液染塵，劑量及次數同染塵組。

1.3標本采集

丙戊酸鈉腹腔注射麻醉下腹主動脈采集動脈血5 ml后放血處死大鼠（空白對照組直接處死，生理鹽水對照組氣管注入生理鹽水后24 h處死，各實驗組均染塵24 h后處死）。所取動脈血1 500 r/min離心15 min，分離血清，-80℃冰箱保存。

1.4指標檢測

采用酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法測定（試劑盒購自美國BG公司）血清中IL-17和SP-A水平，操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1大鼠肺組織病理

2個對照組病理切片未見異常表現（見圖1、2）；染塵組（見圖3）光鏡下可見肺泡間隔增厚，肺泡腔縮小，炎癥細胞滲出，小支氣管壁增厚，管腔內杯狀細胞增生，周圍炎癥細胞浸潤，肺間質纖維組織增生，間質水腫，毛細血管充血，小血管管壁增厚，周圍可見嗜酸性粒細胞浸潤。各干預組（見圖4～6）可見隨連花清瘟劑量增加，肺泡腔內炎癥細胞滲出逐漸減輕。

2.2對照組、染塵組及連花清瘟組血清IL-17和SP-A水平的變化

空白對照組及生理鹽水對照組大鼠血清IL-17 和SP-A水平差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），染塵組大鼠血清IL-17和SP-A水平均顯著高于空白對照組及生理鹽水對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；中、高見劑量連花清瘟干預組血清IL-17 和SP-A水平均低于染塵組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；低劑量連花清瘟干預組血清IL-17和SP-A水平低于染塵組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見附表。

圖1　生理鹽水對照組（×200）

圖2　空白對照組（×200）

圖3　PM2.5染塵組（×200）

圖4　低劑量連花清瘟干預組（×200）

圖5　中劑量連花清瘟干預組（×200）

圖6　高劑量連花清瘟干預組（×200）

附表　對照組、染塵組及連花清瘟干預組血清IL-17 和SPA水平的比較（n=8，±s）

附表　對照組、染塵組及連花清瘟干預組血清IL-17 和SPA水平的比較（n=8，±s）

分組SP-A/（mg/L）空白對照組　3.36±0.92生理鹽水對照組　3.75±1.07 IL-17/（pg/ml）98.99±12.26 96.56±10.82 PM2.5染塵組　12.49±2.53 163.51±13.26低劑量連花清瘟組　158.37±15.92　11.17±1.13中劑量連花清瘟組　132.96±15.01　8.56±1.55高劑量連花清瘟組　108.65±11.23　5.07±1.51 F值　33.62　38.31 P值　0.000　0.000

3　討論

大氣污染物經呼吸道吸收可直接作用于呼吸系統(tǒng)，因大氣污染物含有害氣體、化學物質及金屬等，對機體的影響可因含有的物質不同而不同，其中顆粒物PM2.5對人體的損害較大，它不但自身有危害性，還可以吸附多種有害氣體和病原微生物［5］。PM2.5可隨空氣進入小氣道和肺泡并持續(xù)作用，當其到達肺泡時，被氣道纖毛系統(tǒng)清除或者被巨噬細胞吞噬［6］。PM2.5被AM吞噬過程中可通過與之相關的編碼轉錄因子和炎癥相關因子基因轉錄水平的增高誘導大量促炎癥因子釋放，破壞細胞因子網絡平衡，從而調節(jié)和啟動肺局部炎癥反應，誘導肺部炎癥損傷。另一方面，PM2.5對肺部機械屏障作用的破壞使其清除異物作用下降，進一步誘導更嚴重的炎癥反應［7］。

連花清瘟主要成分為連翹、金銀花、麻黃、杏仁、石膏、板藍根、綿馬貫眾、魚腥草、廣藿香、大黃、紅景天、薄荷腦、甘草，從中藥成分來看符合中醫(yī)治療炎癥疾病的特點，它除了具有明確的抗病毒作用，對急性肺部感染效果顯著，還具有一定的免疫調節(jié)作用［8］。流行病學調查及臨床試驗證實其提高細胞免疫功能，抑制病毒感染后的肺部炎性損害［7］。研究發(fā)現處方中麻黃、甘草能抑制大鼠肺組織腫瘤壞死因子（tumor necrosis factorα，TNF-α），白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）含量升高，具有較強抗炎癥作用；大黃游離蒽醌也可抑制TNF-α等炎癥介質的釋放，減輕機體炎癥反應［9-10］。夏敬文等［11］研究也發(fā)現連花清瘟可顯著降低慢性阻塞性肺病大鼠模型血清、肺組織勻漿及肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α含量，提示連花清瘟對氣道炎癥有抑制作用。

IL-17是近年來人們發(fā)現的一種新的細胞因子，主要由Th17細胞產生。IL-17是一種促炎癥細胞因子，也是炎癥反應的早期啟動子，因其在誘導炎癥方面具有強大的作用而備受重視。IL-17與其受體結合，主要通過NF-κB-DNA途徑和有絲分裂原激活激酶途徑發(fā)揮其生物學作用［12］。IL-17能誘導IL-8、IL-6、TNF-α等多種細胞因子和炎癥介質的產生，導致機體產生強烈的炎癥反應。而IL-8、IL-6、TNF-α在吸煙導致肺損傷的發(fā)病機制中具有重要作用［13］。IL-17還可通過促進C-X-C趨化因子誘導中性粒細胞活化和募集，促進氣道炎癥反應，參與肺損傷［14-15］。本研究結果提示PM2.5染塵組IL-17明顯高于空白對照組和生理鹽水對照組，中、高劑量連花清瘟干預組IL-17明顯低于染塵組，提示PM2. 5通過誘導炎癥反應導致肺損傷，連花清瘟通過抑制炎癥反應減輕PM2.5導致的肺損傷。

肺表面活性物質是覆蓋于肺泡表面，分為有4種特定表面活性蛋白A、B、C和D，SP-A、SP-D為水溶性蛋白，主要調節(jié)肺免疫功能。SP-A可通過損傷的肺泡-毛細血管膜屏障進入血液循環(huán)而成為肺損傷的血清標志物。血清中SP-A的量和肺損傷程度密切相關。SP-A是先天免疫系統(tǒng)的一部分，可通過與抗原遞呈細胞和T淋巴細胞相互作用來調節(jié)先天免疫系統(tǒng)；也可直接作用于B淋巴細胞或間接通過刺激免疫細胞產生細胞因子作用于B淋巴細胞，使其激活并產生免疫球蛋白；通過抑制某些細胞因子和炎癥介質的合成與釋放，從而抑制炎癥反應，可與特異性變應原結合，在氣道炎癥中起重要的免疫調節(jié)作用［16］。本研究結果提示PM2.5染塵組SP-A明顯高于空白對照組和生理鹽水對照組，中、高劑量連花清瘟干預組SP-A明顯低于染塵組，提示PM2.5通過損害肺的免疫功能導致肺損傷，連花清瘟通過調節(jié)免疫功能拮抗PM2.5導致的肺損傷。

綜上所述，本實驗證實PM2.5急性暴露可導致大鼠免疫功能受損及肺部炎癥，中、高劑量連花清瘟可保護免疫功能，抑制炎癥反應，其具體調節(jié)機制有待進一步研究。

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（張蕾編輯）

論著

Effect of surrounding fine particulate matter（PM2.5）on IL-17 expression in rats and antagonistic effects of Lianhuaqingwen

Shu-zhi Han1，Hui-peng Liang2，Feng-rui Zhang1，Fen Ping1
（1. Department of Respiratory Diseases，Hebei General Hospital，Shijiazhuang，Hebei 050051，China；2. Hebei Hospital of Thoracic Diseases，Shijiazhuang，Hebei 050048，China）

Abstract：Objectives To explore the lung injury of rats due to acute exposure to PM2.5，and to discuss the antagonistic role of Lianhuaqingwen to the injury. Methods Forty-eight healthy adult Wistar rats were randomly assigned into four experimental groups（PM2.5 group，low-dose Lianhuaqingwen group，medium-dose Lianhuaqingwen group and high-dose Lianhuaqingwen group）and two control groups（control group and saline control group）. The PM2.5 suspension was prepared with fine particulates provided by Shijiazhuang Environmental Monitoring Center. The rat models were developed by exposure to PM2.5 through intratracheal drip. The saline control group was instilled with saline（1 ml /kg）once；the PM2.5 group was instilled with suspension of PM2.5 via trachea（7.5 mg/kg）；the three intervention groups were given diet supplemented with different doses of Lianhuaqingwen（2 g/kg，4 g/kg and 8 g/kg respectively）for 4 days before drip with suspension of PM2.5. Interleukin 17（IL-17）and surfactant protein A（SP-A）in the serum were measured using ELASA. Pathological changes of the lungs were observed at the same time. Results The serum levels of IL-17 and SP-A were not significantly different between the saline control group and the control group（P＞0.05）. The levels of IL-17 and SP-A in the PM2.5 group were markedly higher than those in the saline control group and the control group（P＜0.05）. The level of IL-17 was significant differentbook=17,ebook=22between the high-dose Lianhuaqingwen group and the PM2.5 group（P＜0.05），and the level of IL-17 in each intervention group was markedly changed compared with that in the PM2.5 group（P＜0.05）. Conclusions The acute exposure to PM2.5 can induce injury to rat's lungs. Lianhuaqingwen could produce antagonistic effects to inflammatory injury to rat's lung tissues.

Keywords：fine particulate matter（PM2.5）；inflammatory injury；interleukin 17；surfactant protein A；Lianhuaqingwen

中圖分類號：R-332

文獻標識碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.004

文章編號：1005-8982（2016）10-0016-04

收稿日期：2015-12-04