正庚烷代替二甲苯在擬南芥花藥石蠟切片中的應(yīng)用

涂磊 張麗瑤

（武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430000）

正庚烷代替二甲苯在擬南芥花藥石蠟切片中的應(yīng)用

涂磊 張麗瑤

（武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430000）

二甲苯是應(yīng)用最廣的一種透明劑，常用于石蠟切片中的脫蠟和透明，但由于其對(duì)人體危害大，廣大科研工作者一直在探尋更加安全的二甲苯代替物。以不同時(shí)期的擬南芥花藥為試材，脫蠟和透明均由正庚烷代替二甲苯完成，其余步驟與常規(guī)石蠟切片相同。結(jié)果顯示，正庚烷透明力強(qiáng)而迅速，既能與乙醇、封藏樹(shù)膠混合，又能溶解石蠟，可作為合適的透明劑和脫蠟劑；組織經(jīng)正庚烷處理后物理性質(zhì)良好，浸蠟充分，切片時(shí)軟硬適中，容易連續(xù)切片，而且厚薄均勻，攤片時(shí)能在42℃水中自然展開(kāi)，平整而無(wú)皺褶；經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，細(xì)胞著色好，核質(zhì)分明，結(jié)構(gòu)清晰，組織形態(tài)保持完好，與二甲苯作透明劑的切片效果無(wú)明顯區(qū)別。因此，正庚烷可以作為一種新的、相對(duì)安全有效的二甲苯替代物，應(yīng)用于植物組織切片中。

正庚烷；二甲苯；石蠟切片；透明劑

制片技術(shù)是生物學(xué)工作者常用的一門實(shí)驗(yàn)技術(shù)，它是從事動(dòng)植物生物技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)、結(jié)構(gòu)植物學(xué)、植物生殖生物學(xué)、植物發(fā)育生物學(xué)等研究的必要技術(shù)基礎(chǔ)，在生物科學(xué)領(lǐng)域占有重要地位。

石蠟切片法是組織學(xué)、發(fā)育生物學(xué)研究最常用的制片技術(shù)之一，廣泛運(yùn)用于臨床病理診斷、教學(xué)和科研工作中。常規(guī)的石蠟切片制作過(guò)程是：取材→固定→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→染色→脫蠟→封片。傳統(tǒng)使用的透明劑和脫蠟劑是二甲苯［1，2］，二甲苯是一種有芳香氣味的刺激性、易揮發(fā)液體，有毒性，主要對(duì)中樞神經(jīng)和植物神經(jīng)有麻痹和黏膜刺激作用，是一種潛在的致癌物質(zhì)。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，過(guò)多接觸二甲苯會(huì)引起神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、肺、皮膚等多個(gè)組織的毒性反應(yīng)［3-7］。二甲苯的細(xì)胞學(xué)毒性主要體現(xiàn)在誘導(dǎo)線粒體解偶聯(lián)和氧化應(yīng)激反應(yīng)［8］。接觸和使用化學(xué)試劑的安全性可以從http://www.proscitech.com/網(wǎng)站上查詢物質(zhì)安全資料表（MSDS）得到。

由于二甲苯對(duì)人體危害大，廣大科研工作者一直致力于尋找更加安全的二甲苯代替物。1978年，Maxwell曾提出可使用三氯乙烷作為透明劑，此后便有越來(lái)越多的技術(shù)人員使用該替代物［9］，但由于三氯乙烷的蒸氣仍然有毒，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須保持良好的通風(fēng)狀態(tài)［10］。此后，多種二甲苯替代物，例如：植物油［11］、葵酸丁酯［12］、異丙醇［13］、異丙醇-礦物油混合物［14］、丙二醇甲酯［15］、辛烷［16，17］、硬脂酸［18］、松節(jié)油［19］、環(huán)保透明劑［20］、Y透明劑［21］、甲基環(huán)己烷［22］等被相繼使用。

正庚烷是一種脂肪族烴化合物，無(wú)色易揮發(fā)液體，不溶于水，溶于醇，可混溶于乙醚、氯仿，熔點(diǎn)-90.5℃，沸點(diǎn)98.5℃，易燃，為汽油的組成成分之一，主要用作測(cè)定辛烷值的標(biāo)準(zhǔn)物［23］。此前，已有研究者將正庚烷作為二甲苯的替代物，用于動(dòng)物組織切片的透明和脫蠟過(guò)程，并取得良好效果［24］。但正庚烷是否同樣適用于植物組織切片，尚無(wú)人研究。本實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)一直致力于被子植物受精與胚胎發(fā)生的研究，組織切片是本實(shí)驗(yàn)室研究的必要基礎(chǔ)技術(shù)。本研究以擬南芥不同發(fā)育時(shí)期的花藥切片為例，探究正庚烷替代二甲苯用于植物組織切片的可能性，擬為植物研究工作者提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 野生型擬南芥（COL）溫室種植（22℃，16 h光照/8 h黑暗）長(zhǎng)至開(kāi)花期，取新鮮花序進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑 FAA固定液（福爾馬林5 mL，乙酸5 mL，50%乙醇90 mL），現(xiàn)配現(xiàn)用；無(wú)水乙醇，配成不同濃度備用；正庚烷（國(guó)藥）；石蠟（Sigma）；多聚賴氨酸：粉末購(gòu)自Sigma公司，稱取20 mg多聚賴氨酸粉末溶于20 mL去離子水中，配成10×母液，-20℃保存；甲苯胺藍(lán)染色液：粉末購(gòu)自Sigma公司，稱取1 g甲苯胺藍(lán)粉末，溶于100 mL 70%乙醇中，4℃保存，使用時(shí)以雙蒸水100倍稀釋；加拿大樹(shù)膠（Sigma）。

1.1.3 主要儀器 石蠟切片機(jī)（AO），恒溫加熱儀（瑞華），磨刀機(jī)（Leica SP9000），光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS IX71）。

1.2 方法

1.2.1 處理載玻片 用1%-2%鹽酸乙醇（95%醫(yī)用乙醇100 mL中加入濃鹽酸1-2 mL）浸泡過(guò)夜→流水沖洗（放在塑料籃中）→取出后放入95%（醫(yī)用）乙醇中備用。使用前擦干載玻片，均勻涂抹多聚賴氨酸水溶液，置于60℃烘箱烘1-2 h干燥。

1.2.2 固定 取新鮮的擬南芥花序，放入20 mL小瓶中，加滿FAA固定液，抽真空輔助固定20-30 min，更換固定液后，4℃冰箱放置過(guò)夜。

1.2.3 脫水 50%乙醇→70%乙醇→85%乙醇→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇逐級(jí)脫水，材料在無(wú)水乙醇中脫水30 min，其他各級(jí)分別脫水1 h，最后一級(jí)脫水需更換2次無(wú)水乙醇。

1.2.4 透明 1/2無(wú)水乙醇＋1/2正庚烷→純正庚烷→純正庚烷逐級(jí)浸泡材料，每級(jí)放置1.5 h。

1.2.5 浸蠟 提前融石蠟，棄上一級(jí)正庚烷，配置體積比為1∶1的正庚烷/純石蠟混合液，于58℃恒溫臺(tái)浸泡材料過(guò)夜，之后使用純石蠟替換上一級(jí)溶液，每隔12 h換一次純石蠟溶液，共替換6次。

1.2.6 包埋 將充分浸蠟的材料倒入已疊整齊的紙盒中，石蠟?zāi)糖皵[正材料方向，待石蠟?zāi)毯蠓湃?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 切片 切片前磨刀→分割、修整蠟塊呈梯形→固定蠟塊→固定切片刀，調(diào)節(jié)刀的角度到15°→調(diào)節(jié)切片厚度使其為10 μm→調(diào)節(jié)刀口與蠟塊的距離、蠟塊的位置→切片。

1.2.8 展片、粘片 將蠟帶置于多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片上，加蒸餾水展平蠟帶后于42℃展片臺(tái)上烤干。

1.2.9 染色 將玻片放入染缸，再將甲苯胺藍(lán)染液加入染缸至淹沒(méi)玻片，染色10 min，再用雙蒸水清洗玻片，42℃烘箱中烘干。

1.2.10 脫蠟及封片 正庚烷浸泡玻片2次，每次10 min，取出玻片滴加加拿大樹(shù)膠，蓋上蓋玻片封片。

2 結(jié)果

2.1 正庚烷代替二甲苯作透明劑

材料經(jīng)固定及各級(jí)乙醇脫水后，再用正庚烷逐步透明。結(jié)果（圖1，圖2）顯示，處理后的組織呈半透明狀態(tài)，且能保持平整，無(wú)收縮、變形現(xiàn)象；浸蠟后切片，容易連續(xù)切片而且厚薄均勻，攤片時(shí)能在42℃水中自然展開(kāi)，平整而無(wú)皺褶，說(shuō)明以正庚烷作透明劑，不僅能與脫水劑充分混合，又能被石蠟完全取代，透明效果好，是一種合適的透明劑。

2.2 正庚烷代替二甲苯作脫蠟劑

展片、烘片、染色以后，用正庚烷浸泡玻片2次，每次10 min。結(jié)果（圖3）顯示，僅剩下植物組織仍保持在原位，用于支撐組織和細(xì)胞的石蠟已被完全溶解，組織、細(xì)胞更加透明清晰，便于觀察；用正庚烷溶去組織內(nèi)外的石蠟只需要20 min，脫蠟快而干凈，表明正庚烷是一種合適的脫蠟劑。

圖1 正庚烷透明擬南芥花序

圖2 正庚烷透明擬南芥不同時(shí)期的花

圖3 正庚烷脫蠟效果

2.3 光學(xué)顯微鏡下花藥形態(tài)的觀察

脫蠟后的組織經(jīng)封藏劑封藏后，便可以長(zhǎng)期保存，顯微鏡下觀察切片，結(jié)果（圖4）顯示，甲苯胺藍(lán)染色顏色鮮亮，細(xì)胞著色好，核質(zhì)分明，結(jié)構(gòu)清晰，組織形態(tài)保持完好，能達(dá)到以二甲苯作透明劑的石蠟切片效果。

3 討論

在組織制片實(shí)驗(yàn)中，透明和脫蠟是兩個(gè)十分重要的步驟，透明是脫水與浸蠟、脫水與封藏之間的橋梁，而切片后需要用脫蠟劑溶去組織和細(xì)胞內(nèi)外的石蠟，才能使細(xì)胞、組織更加透明清晰，便于觀察。傳統(tǒng)使用的透明和脫蠟試劑是二甲苯，二甲苯是含苯環(huán)的芳香族化合物，毒性高，雖然已有各種二甲苯替代物被開(kāi)發(fā)使用，但是卻未普及：或因效果不穩(wěn)定，或因價(jià)格較高［25］，因此，新的、更加安全有效的二甲苯替代物亟待研發(fā)。

圖4 發(fā)育前期（A）及后期（B）的擬南芥花藥

二甲苯具有慢性毒性，經(jīng)?；蚍磸?fù)侵入人體后會(huì)引起神經(jīng)衰弱、植物神經(jīng)紊亂或皮膚黏膜刺激等癥狀，具體如頭痛、頭暈、乏力、睡眠障礙、血壓降低、輕度貧血、皮炎等表現(xiàn)［26］。對(duì)妊娠期婦女還會(huì)導(dǎo)致妊娠貧血、妊娠高血壓綜合征、自然流產(chǎn)等癥狀，對(duì)月經(jīng)機(jī)能、生殖機(jī)能和子代發(fā)育有一定的影響和損害［27］。另有文獻(xiàn)報(bào)道，苯類化合物在一定程度上會(huì)引發(fā)牙周組織疾?。?8］。而正庚烷只是對(duì)直接接觸的皮膚有輕度刺激性，并具有麻醉作用。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)職業(yè)性接觸毒物危害程度分級(jí)，將二甲苯定為III級(jí)（中度危害），溶劑汽油（正庚烷為其組成成分之一）為IV級(jí)（輕度危害）［29］。

正庚烷是短鏈脂肪烴化合物，相比于芳香烴二甲苯，正庚烷與石蠟結(jié)構(gòu)更為相似，溶解石蠟也更加迅速。常規(guī)二甲苯脫蠟時(shí)間為每次20 min，正庚烷脫蠟時(shí)間為每次10 min，脫蠟快而干凈。以正庚烷為透明劑，透明效果好，處理后的材料呈半透明狀，后續(xù)浸蠟充分，容易連續(xù)切片，不脫片，攤片時(shí)能在42℃水中自然展開(kāi)，平整而無(wú)皺褶。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)正庚烷處理后的組織染色效果好，甲苯胺藍(lán)染色10 min即可，顏色鮮亮，核質(zhì)分明，結(jié)構(gòu)清晰，解決了植物油等二甲苯替代物染色不佳的問(wèn)題。

在實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用正庚烷需要注意的是：正庚烷易燃，其蒸氣與空氣可形成爆炸性混合物，應(yīng)遠(yuǎn)離火種，密封、避光保存；有一定的揮發(fā)性，用完及時(shí)蓋嚴(yán)。為了脫水徹底并使材料減少收縮，透明時(shí)可逐步從純乙醇過(guò)渡到正庚烷，即1/2無(wú)水乙醇＋1/2正庚烷→純正庚烷→純正庚烷（正庚烷應(yīng)更換2次，以除盡乙醇）。

正庚烷作為一種新的、相對(duì)安全有效的二甲苯替代物，有望在植物組織切片中普及使用。擬南芥是植物研究的模式植物之一，花藥是植物生殖生物學(xué)的重要研究對(duì)象。本研究成功地將正庚烷應(yīng)用于擬南芥花藥石蠟切片實(shí)驗(yàn)，下一步應(yīng)選取更多種類的植物材料及更多樣化的組織開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，以期將正庚烷普遍應(yīng)用于植物制片技術(shù)，消除二甲苯對(duì)制片人員的危害，改善工作環(huán)境。

4 結(jié)論

本研究對(duì)擬南芥不同時(shí)期的花藥進(jìn)行石蠟切片，通過(guò)使用正庚烷作為透明劑和脫蠟劑，消除了傳統(tǒng)透明試劑二甲苯對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的危害。用正庚烷處理材料，透明效果好，浸蠟充分，容易連續(xù)切片，脫蠟快速且干凈，染色佳，組織結(jié)構(gòu)保持完整。因此，正庚烷可以作為一種新的、相對(duì)安全有效的二甲苯代替物，應(yīng)用于植物組織切片中。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Replacing Xylene with n-heptane for Paraffin Section of Arabidopsis thaliana Anther

TU Lei ZHANG Li-yao
（College of Life Sciences，Wuhan University，Wuhan 430000）

Xylene is widely used as clearing agent for dewaxing and clearing in paraffin section. However，due to its severe harm to human health，researchers have been seeking adequate substitutes. In this study，Arabidopsis thaliana anthers in various periods were processed with n-heptane replacing xylene as a novel clearing and deparaffinizing agent in paraffin section，and the rest of steps were the same as the conventional paraffin section. The results showed that n-heptane with strong and rapid transparency was able to be mixed with ethanol and gum and dissolve paraffin，thus could be utilized as clearing and dewaxing agent. The tissues processed with n-heptane was in fine physicchemical property and saturated with paraffin；due to the proper hardness of the section，continuously slicing was easy and slice thickness was uniform，moreover，the section was expanded naturally in the water of 42℃ and was flat and no folds. In addition，the cells stained with toluidine blue were in fine quality of staining，and had a clear definition of the nucleus and the cytoplasm，as well as the morphology and structure of the cells were maintained well，meaning that there were no significant differences from the section with xylene as clearing agent. In conclusion，n-heptane is a novel，safe and efficient substitute replacing xylene in the histological techniques for plants.

n-heptane；xylene；paraffin section；clearing agent

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.018

2015-09-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31070284）

涂磊，女，碩士研究生，研究方向：發(fā)育生物學(xué)；E-mail：1013773409@qq.com

張麗瑤，女，副教授，研究方向：被子植物生殖生物學(xué)；E-mail：lyzhang26@whu.edu.cn