武智勇，劉思岐，齊炳堯，宋廣萍，王春麗，陳志寶（黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院，大慶163319）

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沃尼妙林對脂多糖誘導的RAW264.7細胞TLR4和CD14表達的影響

武智勇，劉思岐，齊炳堯，宋廣萍，王春麗，陳志寶
（黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院，大慶163319）

摘要：探討沃尼妙林對脂多糖誘導的RAW264.7細胞TLR4和CD14表達的影響。通過Real-Time PCR和Western Blot檢測細胞TLR4和CD14的表達情況，發(fā)現(xiàn)脂多糖刺激RAW264.7細胞后，可導致TLR4和CD14表達的增高；不同濃度的沃尼妙林預處理能夠抑制脂多糖誘導的TLR4和CD14的表達，并且呈劑量依賴性。結(jié)果表明，沃尼妙林具有抗炎作用，可以明顯改善LPS誘導的急性肺損傷。

關(guān)鍵詞：沃尼妙林；脂多糖類；巨噬細胞；TLR4；CD14

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細菌外壁上的主要成分，可與細胞表面及血漿中的受體相結(jié)合[1-2]。CD14是最早被發(fā)現(xiàn)與LPS結(jié)合最重要、親和力最高的受體[3]。這種受體與LPS結(jié)合后，形成CD14-LPS-LBP的三聯(lián)復合體，進而活化TLR4的信號傳導[4]。TLR4在機體抗感染的免疫炎癥反應中扮演著重要角色，是LPS信號向細胞內(nèi)傳導的“門戶蛋白”，由于CD14是通過糖基磷脂酰肌醇錨固在細胞膜上，缺乏跨膜結(jié)構(gòu)，需要通過TLR4將LPS的信號從細胞外傳遞到細胞內(nèi)[5]。兩者協(xié)同作用激活炎性細胞，合成和釋放多種細胞因子，引起全身炎癥反應綜合征，多器官功能衰竭，甚至死亡[6-7]。

沃尼妙林是新一代廣譜的截短側(cè)耳素類半合成抗生素，對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、厭氧菌、支原體以及螺旋體均有效[8]。據(jù)報道，沃尼妙林對腸道疾病、急性多關(guān)節(jié)炎、地方性肺炎等有較好的治療效果[9]。同時，沃尼妙林通過降低單核細胞、巨噬細胞等分泌和釋放TNF-α，IL-6等炎性相關(guān)因子，可以有效保護LPS誘導的急性肺損傷[10]。但是，很少有通過研究沃尼妙林與LPS、TLR4、CD14的關(guān)系，來探索其抑制致炎癥細胞因子的分泌，從而改善LPS誘導急性肺損傷的報道[11-13]。實驗從分子水平和蛋白水平研究沃尼妙林對LPS上游信號轉(zhuǎn)導載體TLR4和CD14表達的影響，進而探索沃尼妙林有效保護LPS誘導的急性肺損傷的作用機制。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

沃尼妙林（Sigma，美國）；脂多糖（Sigma，美國）；DMEM/高糖培養(yǎng)基（Hyclone，美國）；胎牛血清（Gibco，美國）；BCA蛋白定量試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo，美國）；Trizol（Invitrogen，美國）；引物（TLR4、CD14、GAPDH）（捷瑞，上海）；抗體TLR4、CD14（Abcam，英國）；抗體GAPDH （CST，美國）；羊抗兔HRP標記二抗、羊抗鼠HRP標記二抗（碧云天，上海）。

1.2實驗分組

按以下分組進行實驗：

（1）LPS誘導RAW264.7細胞TLR4和CD14的mRNA和蛋白表達的時間效應。

實驗分為空白對照組和LPS組，其中LPS終濃度為1 μg·mL-1，并且分別在3、6、12、24、48 h終止培養(yǎng)，提取細胞總RNA和蛋白質(zhì)[14-15]。

（2）沃尼妙林對LPS誘導RAW 264.7細胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白表達的影響。

實驗分為4組：①空白對照組；②LPS組：LPS終濃度為1 μg·mL-1；③LPS+沃尼妙林組：給予終濃度為10 μg·mL-1的沃尼妙林孵育1 h，再加入1 μg·mL-1LPS刺激；④沃尼妙林組：給予終濃度為10 μg·mL-1的沃尼妙林孵育1 h。培養(yǎng)RAW264.7細胞48 h，分別提取細胞總RNA和蛋白質(zhì)。

（3）不同濃度的沃尼妙林對LPS誘導RAW 264.7細胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白表達的影響。

實驗分為5組：①空白對照組；②LPS組：LPS終濃度為1 μg·mL-1；③④⑤LPS+沃尼妙林組：LPS終濃度為1 μg·mL-1，給予終濃度分別為5 μg·mL-1（低劑量組）、10 μg·mL-1（中劑量組）和25 μg·mL-1（高劑量組）的沃尼妙林進行預處理。沃尼妙林孵育1 h后，再加入1 μg·mL-1LPS刺激，培養(yǎng)RAW264.7細胞48 h，分別提取細胞總RNA和蛋白質(zhì)。

1.3方法

1.3.1小鼠巨噬細胞RAW264.7的培養(yǎng)

小鼠巨噬細胞RAW264.7由本室保存。參考李巖等[16]報道的RAW264.7細胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素）5%CO2、37℃條件下傳代培養(yǎng)。

1.3.2Real-Time PCR檢測RAW264.7細胞TLR4和CD14 mRNA的表達

各組細胞加入相應刺激物后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用Trizol法提取細胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總RNA至cDNA，特異性引物對制備好的cDNA進行擴增，按以下程序進行PCR反應：95℃變性10 min；95℃15 s，60℃45 s，共40個循環(huán)。使用ABI Prism 7 300 SDS Software進行分析。引物序列由上海捷瑞生物公司合成，序列見表1。

表1　引物序列Table 1Sequences of primers

1.3.3Western Blot檢測RAW 264.7細胞TLR4和

CD14蛋白的表達

各組細胞加入相應刺激物后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，使用預冷的PBS洗凈殘留培養(yǎng)液，用細胞刮子將細胞刮下并加入細胞裂解液裂解細胞30 min，5 000 r·min-1離心洗滌細胞2次，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白定量結(jié)果使用SDS上樣緩沖液進行調(diào)樣，沸水浴10 min后離心取上清上樣。進行SDSPAGE電泳（5%的濃縮膠和10%的分離膠），轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉37℃封閉1 h，加抗CD14、TLR4或GAPDH單克隆抗體，4℃孵育過夜，洗膜，加辣根過氧化物酶標記的相應二抗稀釋液37℃孵育1 h，ECL法顯影，分析條帶灰度值，以目的條帶與GAPDH條帶的灰度比值來表示TLR4和CD14蛋白相對表達量。

1.3.4統(tǒng)計學處理

應用Graphpad prism 5進行單因素方差分析（One-way ANOVA），T檢驗及各組差異分析，以P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1LPS誘導RAW264.7細胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白表達的時間效應

LPS誘導RAW264.7細胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白表達的時間效應見圖1和圖2。未受LPS刺激的RAW264.7細胞有少量的TLR4和CD14 mRNA的表達。LPS組（12 h）TLR4 mRNA（P<0.01）和CD14 mRNA（P<0.05）的表達與空白組相比開始具有統(tǒng)計學差異，并且表達量隨著時間的增加而上升。LPS組（24 h）和LPS組（48 h）TLR4和CD14 mRNA的表達與空白組相比差異極其明顯（P<0.001）。

圖1　LPS誘導RAW264.7細胞TLR4和CD14 mRNA表達的時間效應Fig.1Effects of variable time on expression of TLR4 and CD14 mRNA in LPS induced RAW264.7 cells

圖2　LPS誘導RAW264.7細胞TLR4和CD14蛋白表達的時間效應Fig.2Effects of variable time on expression of TLR4 and CD14 protein in LPS induced RAW 264.7 cells

同樣，Western Blot結(jié)果顯示在無外源性刺激的情況下，RAW 264.7細胞TLR4和CD14蛋白表達極低，LPS可以上調(diào)RAW264.7細胞TLR4和CD14蛋白的表達，并且表達量隨著時間的增加而遞增。

2.2沃尼妙林對LPS誘導RAW264.7細胞TLR4 和CD14 mRNA和蛋白表達的影響

Real-Time PCR結(jié)果顯示，在無外源性刺激的情況下，RAW264.7細胞TLR4和CD14 mRNA表達極低，單獨加入沃尼妙林對其表達無顯著影響。LPS可以極其顯著地上調(diào)RAW 264.7細胞TLR4和CD14 mRNA的表達（P<0.001）；而在LPS刺激前加入沃尼妙林進行預處理，可以抑制脂多糖誘導的TLR4 mRNA （P<0.05）和CD14 mRNA（P<0.01）的表達（見圖3）。

圖3　沃尼妙林對LPS誘導的RAW264.7細胞TLR4和CD14 mRNA表達的影響Fig.3Effects of valnemulin on expression of TLR4 and CD14 mRNA in LPS induced RAW264.7 cells

Western Blot結(jié)果顯示，LPS能上調(diào)TLR4和CD14蛋白表達，而通過沃尼妙林預處理能降低LPS誘導的TLR4和CD14蛋白表達（見圖4）。

圖4　沃尼妙林對LPS誘導RAW264.7細胞TLR4和CD14蛋白表達的影響Fig.4Effects of Val on expression of TLR4 and CD14 protein in LPS induced RAW 264.7 cells

2.3不同濃度沃尼妙林對LPS誘導RAW264.7細

胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白表達的影響

LPS刺激RAW264.7細胞前給予不同濃度的沃尼妙林進行預處理，各劑量組均能極顯著降低TLR4 和CD14 mRNA的表達（P<0.001），并且呈現(xiàn)劑量依賴性（見圖5）。

圖5　不同濃度的沃尼妙林對LPS誘導的RAW264.7細胞TLR4和CD14 mRNA表達的影響Fig.5Effects of variable concentrations of valnemulin on expression of TLR4 and CD14 mRNA in LPS induced RAW264.7 cells

Western Blot結(jié)果顯示，LPS刺激前不同濃度沃尼妙林進行預處理，能夠降低LPS誘導的TLR4和CD14蛋白表達，并且抑制作用隨著沃尼妙林濃度的遞增而增強（見圖6）。

圖6　不同濃度的沃尼妙林對LPS誘導的RAW264.7細胞TLR4和CD14蛋白表達的影響Fig.6　Effects of variable concentration of Val on expression of TLR4 and CD14 protein in LPS induced RAW264.7 cells

3　討論

急性肺損傷是由嚴重感染、休克、創(chuàng)傷等因素引起的以炎癥反應和肺泡毛細血管損傷為主要病理改變，臨床表現(xiàn)為進行性的呼吸困難和頑固性低氧血癥，死亡率較高，嚴重危害人類的健康[17]。內(nèi)毒素是首要致病因素，LPS是內(nèi)毒素的主要成分，它與細胞結(jié)合后，通過LPS-LBP-CD14三聯(lián)復合物作用于TLR4，刺激中性粒細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞等，激活細胞內(nèi)的NF-κB和MAPKs信號通路，誘導細胞產(chǎn)生并釋放大量的細胞因子和炎性介質(zhì)，如TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β、NO等，導致急性肺損傷的發(fā)生[18-19]。研究顯示，烏司他丁和地塞米松對LPS誘導急性肺損傷具有保護作用，均可以通過抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子的釋放，最終達到阻止炎癥反應帶來的損傷[20-21]。研究報道，在LPS所致的小鼠急性肺損傷模型中，預服用沃尼妙林可以顯著抑制NF-κB的活力，抑制炎性細胞因子TNF-α，IL-6等的分泌，提高抗炎因子IL-10的水平，有效保護LPS誘導的急性肺損傷[22]。

激發(fā)細胞內(nèi)多種信號傳導的第一步是宿主受體識別LPS，并通過CD14和TLR4激活LPS內(nèi)在免疫信號轉(zhuǎn)導途徑進而激活NF-kB，而轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的活化是炎癥反應的共同途徑。因此，研究從阻斷病理性信號傳入入手，以LPS上游信號通路TLR4和CD14為研究對象，研究發(fā)現(xiàn)LPS可以使TLR4和CD14 mRNA和蛋白的表達量明顯增強。在LPS刺激前對RAW264.7細胞進行沃尼妙林預處理，可以顯著降低TLR4和CD14 mRNA和蛋白的表達量。不同濃度的沃尼妙林處理LPS誘導的RAW264.7細胞，結(jié)果顯示沃尼妙林顯著抑制了LPS誘導RAW264.7細胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白的表達，并且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

綜上所述，沃尼妙林可以通過調(diào)控炎性相關(guān)因子和炎性介質(zhì)的影響而起到有效保護LPS誘導急性肺損傷的作用，可能是由于沃尼妙林有效抑制了LPS信號通路的上游受體TLR4和CD14的表達，抑制LPS對單核巨噬細胞的活化而導致的。這是對沃尼妙林的抗炎作用及對炎癥信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控機制的進一步補充，對于臨床上預防和治療急性肺損傷具有重要意義。

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Effects of Valnemulin on LR4 and CD14 Expression in Lipopolysaccharide-treated RAW264.7 Cells

Wu Zhiyong，Liu Siqi，Qi Bingyao，Song Guangping，Wang Chunli，Chen Zhibao
（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Abstract:To explore the effect of valnemulin（Val）in this process which LPS induces TLR4 and CD14 expression in RAW264.7 cells.The expression of CD14 and TLR4 was detected by Real-Time PCR and Western Blot cell.After the discovery that LPS stimulated RAW264.7 cells，it might lead to increase TLR4 and CD14 expression.The different concentrations of valnemulin could reduce LPS-induced TL4 and CD14 expression in dose-dependent manner of mRNA and protein levels.The results showed that valnemulin had anti-inflammatory properties on LPS-induced acute lung injury，and could significantly improve the LPS-induced acute lung injury.

Key words：valnemulin;LPS;macrophage cells;TLR4;CD14

中圖分類號：R392

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2090（2016）01-0059-05

doi:10.3969/j.issn.1002-2090.2016.01.013

收稿日期：2014-12-10

基金項目：校內(nèi)博士啟動基金（XDB2012-14）。

作者簡介：武智勇（1989-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院2012級碩士研究生。

通訊作者：陳志寶，男，教授，博士研究生導師，E-mail：chenzhibao_2000@sina.com。