高仕君，聶宇，廉虹，胡盛壽

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先天性心臟病大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位小鼠模型的建立

高仕君，聶宇，廉虹，胡盛壽

摘要

目的：嘗試建立一種先天性心臟病大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位小鼠模型，為探討該類疾病發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機(jī)制提供條件。

方法：20只8～10周大的SPF級ICR孕鼠隨機(jī)分為對照組（n=5）和實(shí)驗(yàn)組（n=15）。實(shí)驗(yàn)組孕鼠在E8.5天給予單次劑量全反式視黃酸（70 mg/kg）腹腔注射，對照組孕鼠在E8.5天給予單次劑量二甲基亞砜（70 mg/kg）腹腔注射。注射完畢后繼續(xù)飼養(yǎng)至E18天后取出胚胎，在體式顯微鏡下觀察心臟表型。

結(jié)果：與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組胚胎的早產(chǎn)、流產(chǎn)、胚胎吸收的發(fā)生率顯著增加；大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位表型明顯，發(fā)生率為61.2%，同時(shí)合并突眼、神經(jīng)管畸形等多種心外表型發(fā)生。

結(jié)論：全反式視黃酸可以誘導(dǎo)小鼠胚胎發(fā)生大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位，是一種可行的疾病動(dòng)物模型。

關(guān)鍵詞心臟缺損，先天性；大血管錯(cuò)位；全反式視黃酸；模型，動(dòng)物

作者單位：100037北京市，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院國家心血管病中心阜外醫(yī)院心血管疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

（Chinese Circulation Journal，2016，31：499.）

完全性大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位（Transposition of great arteries，TGA）是一種嚴(yán)重的先天心臟發(fā)育缺陷，發(fā)病率為0.2‰～0.3‰，男女比例為1.5～3.2：1［1］，占先天性心臟病的7%～8%。TGA的主要解剖結(jié)構(gòu)改變是主動(dòng)脈起源于右心室，而肺動(dòng)脈起源于左心室。絕大多數(shù)TGA患兒出生后病情危重，其異常的解剖結(jié)構(gòu)使得患兒出生后一個(gè)月生存率為55%，6個(gè)月生存率為15%，1年內(nèi)生存率僅為10%，10歲以上的患者罕見［2］。在我國，盡管一部分患兒可以通過手術(shù)治愈，但大部分患兒由于就醫(yī)時(shí)間較晚、合并心內(nèi)畸形較多，生存率較低。因此，闡明TGA的發(fā)病機(jī)制對于該類嚴(yán)重心臟畸形的預(yù)防和治療有重要意義。目前，絕大多數(shù)TGA發(fā)病機(jī)制的研究依賴于患兒的臨床表型和正常哺乳動(dòng)物的胚胎作為對照。而利用哺乳動(dòng)物，特別是小鼠建立TGA模型的研究在國內(nèi)尚屬空白，現(xiàn)將我們的建模方法、結(jié)果和經(jīng)驗(yàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

SPF級雌性和雄性ICR小鼠（8～10周）購自北京市維通利華公司。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作按照《北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例（1996）》的相關(guān)規(guī)定規(guī)范執(zhí)行。全反式視黃酸（美國SIGMA公司），二甲基亞砜（美國SIGMA公司），顯微手術(shù)器械［上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司手術(shù)器械廠］，體式顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

小鼠準(zhǔn)備：每日晚5點(diǎn)將3只雌性小鼠與1只雄性合籠，次日早8點(diǎn)將雌、雄小鼠分籠，并檢查雌鼠陰道內(nèi)陰栓形成情況。有陰栓形成的雌鼠，取出做好標(biāo)記后，單籠飼養(yǎng)，并開始記錄妊娠天數(shù)，以發(fā)現(xiàn)陰栓形成當(dāng)日計(jì)為E0.5天。

藥品準(zhǔn)備：全反式視黃酸（500 mg規(guī)格）溶于20 ml二甲基亞砜中，配制成濃度為25 mg/ml的工作液，分裝保存。

動(dòng)物模型制備：將20只8～10周大的SPF級ICR孕鼠隨機(jī)分為對照組（n=5）和實(shí)驗(yàn)組（n=15）。實(shí)驗(yàn)組孕鼠在E8.5天給予單次劑量全反式視黃酸（70 mg/kg）腹腔注射，對照組孕鼠在E8.5天給予單次劑量二甲基亞砜（70 mg/kg）腹腔注射。注射完畢后繼續(xù)飼養(yǎng)至E18天。

表型判定：將E18天孕鼠脫頸處死，剖腹取出全部成型的胚胎（發(fā)育不完全的胚胎舍棄，不計(jì)入統(tǒng)計(jì)）。在體式顯微鏡下觀察主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈分別于左、右心室的連接情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高劑量全反式視黃酸對胚胎發(fā)育的影響

全反式視黃酸注射后，實(shí)驗(yàn)組孕鼠的孕期不良事件（包括孕早期流產(chǎn)、孕晚期早產(chǎn)和胚胎終止發(fā)育并被母體吸收）的發(fā)生率顯著提高（P＜0.01），15只孕鼠中有7只發(fā)生不良事件，其中3只早產(chǎn)，2只流產(chǎn)，2只胚胎吸收；對照組無不良事件發(fā)生。在實(shí)驗(yàn)組，孕早期流產(chǎn)的小鼠在剖腹探查時(shí)，子宮內(nèi)未見胚胎；孕晚期早產(chǎn)（＜E18天）的胎鼠不能成活，出生后即死亡；胚胎吸收的孕鼠腹部膨隆的程度顯著低于對照組孕鼠，剖腹探查顯示子宮內(nèi)胚體明顯小于對照組相應(yīng)日齡，幾乎所有胚胎發(fā)育不健全。

2.2 視黃酸誘導(dǎo)TGA表型發(fā)生情況（表1、圖1）

實(shí)驗(yàn)組孕鼠給藥后的平均造模成功率可達(dá)61.2%。在體式顯微鏡下可見，對照組胚胎小鼠心臟呈正位，主動(dòng)脈起自左心室、肺動(dòng)脈起自右心室，主動(dòng)脈位于肺動(dòng)脈的后方（心臟正面觀）；而TGA表型胚胎小鼠心臟呈正位，主動(dòng)脈起自右心室，肺動(dòng)脈起自左心室，主動(dòng)脈位于肺動(dòng)脈的前方（心臟正面觀）。

除外心臟表型，在TGA小鼠胚胎中，所有胚胎表現(xiàn)出特殊體型、下肢發(fā)育不健全、突眼畸形，另有7枚胚胎表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)管發(fā)育畸形，表現(xiàn)為脊柱裂或無腦畸形。

表1　實(shí)驗(yàn)組各個(gè)孕鼠胚胎總數(shù)和大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位表型發(fā)生情況［枚（%）］

3 討論

視黃酸是維生素A在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，1985年就有人發(fā)現(xiàn)視黃酸對胚胎的致畸作用［3］，在之后的研究中逐漸發(fā)現(xiàn)全反式視黃酸對細(xì)胞的增殖、分化和早期胚胎器官的形成有著顯著影響［4，5］。在心臟發(fā)育過程中，視黃酸與第二生心區(qū)的發(fā)育調(diào)控有著密切的關(guān)系［6］。國外的研究團(tuán)隊(duì)在之前的一些研究中已經(jīng)探討了視黃酸對心臟致畸作用并描述了產(chǎn)生的大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位表型，但在國內(nèi)僅僅在斑馬魚模型上有所嘗試，而未涉及利用哺乳動(dòng)物建立模型［7，8］。

圖1　對照組與實(shí)驗(yàn)組胎鼠的大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位表型和心外表型

本文利用高濃度的全反式視黃酸誘導(dǎo)胚胎產(chǎn)生TGA表型，其表型產(chǎn)生的機(jī)制至今不明。目前有研究報(bào)道的可能的作用途徑包括：神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移、視黃酸受體及視黃酸相關(guān)蛋白功能改變。神經(jīng)嵴細(xì)胞參與了流出道發(fā)育及分隔過程，因此神經(jīng)嵴細(xì)胞在遷移方向、遷移數(shù)量上出現(xiàn)的任何改變都可能引起流出道發(fā)育畸形，其中大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位就是主要結(jié)果之一［9］。視黃酸受體主要有RAR、RXR兩種，其與視黃酸結(jié)合蛋白（cellular retinoic acid-binding protein，CRABP）共同調(diào)控胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞的增殖過程。視黃酸在CRABP與視黃酸受體RAR結(jié)合后可以導(dǎo)致發(fā)育中的細(xì)胞周期停滯和凋亡，從而抑制流出道局部的發(fā)育。這也是可能導(dǎo)致TGA的原因之一［10］。

同時(shí)，鑒于視黃酸強(qiáng)大的胚胎毒性作用，TGA表型常常伴隨其它心外畸形的出現(xiàn)，如突眼、肢體發(fā)育畸形、神經(jīng)管發(fā)育畸形、無腦等。這些心外畸形的出現(xiàn)與國外其他團(tuán)隊(duì)的研究一致，充分提示視黃酸的致畸作用是系統(tǒng)性的，可能同時(shí)影響多條發(fā)育相關(guān)的分子信號通路，如Notch通路、左右不對稱發(fā)育通路等［11］。由此，在利用全反式視黃酸構(gòu)建小鼠TGA模型的實(shí)際操作中有如下兩方面需要尤其關(guān)注：第一，給藥時(shí)間點(diǎn)的把握。由于小鼠胚胎的心臟發(fā)育時(shí)間窗為8.5～10.5天，在此期間心臟發(fā)育過程迅速。因此給藥時(shí)間點(diǎn)的偏移將影響藥物對心臟的致畸作用，表現(xiàn)為大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位表型獲得率低。第二，腹腔注射部位的選定。小鼠為雙角子宮，子宮位置大致分布于腹部兩側(cè)。本研究選用高濃度的全反式視黃酸，給藥后藥物擴(kuò)散和吸收速率差異易造成局部藥物濃度過高，因此腹腔注射部位應(yīng)選擇靠近腹中線部位。

總之，本文描述的這種大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位動(dòng)物模型可以為疾病提供一種良好的哺乳動(dòng)物模型，從而可以更契合、便捷、深入地研究疾病的發(fā)病機(jī)制。

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（編輯：許菁）

Establishment of Congenital Heart Disease Transposition of Great Arteries in Experimental Mice Model

GAO Shi-jun，NIE Yu，LIAN Hong，HU Sheng-shou.
State Key Laboratory of Cardiovascular Disease，Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital，CAMS and PUMC，Beijing （100037），China

Abstract

Objective：To establish a mice model of congenital heart disease transposition of great arteries in order to provide a research reference for the occurrence and development of transposition of great arteries.

Methods：A total of 20 pregnant ICR mice at 8-10 weeks of age were divided into 2 groups：Control group，the mice received a single dose of DMSO 70 mg/kg at 8.5 days of gestation，n=5 and Experiment group，the mice received a single dose of all-trans retinoic acid 70 mg/kg at 8.5 days of gestation，n=15.All animals were treated for 18 days and then the embryos were taken to observe cardiac morphology under stereomicroscope.

Results：Compared with Control group，Experiment group had obviously increased occurrence rates of premature delivery，abortion and embryo absorption，and 61.2% phenotype for transposition of great arteries； meanwhile，combining with non-heart defect phenotypeas exophthalmos and spinal malformation.

Conclusion：All-trans retinoic acid may induce transposition of great arteries in mice embryos，which is a feasible animal model in experimental research.

Key wordsHeart delects，congenital； Transposition of great arteries； All-trans retinoic acid； Model，animals

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81441010，81430006，81500239）

作者簡介：高仕君碩士研究生主要從事先天性心臟病和心臟再生的科研工作Email：dr.gaoshijun@hotmail.com通訊作者：胡盛壽Email：shengshouhu@yahoo.com

中圖分類號：R54

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號：1000-3614（2016）05-0499-03

doi：10.3969/j.issn.1000-3614.2016.05.019

Corresponding Author：HU Sheng-shou，Email：shengshouhu@yahoo.com

收稿日期：（2015-11-06）