王海娟戴雨珂蘇森森王英潘渠

（1. 成都醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，成都 610500；2. 成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，成都 610500；3. 成都軍區(qū)總醫(yī)院腎內(nèi)科，成都 610500）

一個融合魏斯氏菌隱蔽質(zhì)粒的序列分析

王海娟1戴雨珂2蘇森森1王英3潘渠1

（1. 成都醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，成都 610500；2. 成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，成都 610500；3. 成都軍區(qū)總醫(yī)院腎內(nèi)科，成都 610500）

從融合魏斯氏菌（Weissella confusa QJ012）中發(fā)現(xiàn)一個隱蔽質(zhì)粒（pQJ012），測序結(jié)果顯示該質(zhì)粒大小為1 489 bp，堿基G+C含量為42.8%。BLAST結(jié)果顯示該質(zhì)粒的核苷酸序列同pJY33和pKLCA的同源性分別為93%、92%。ORF1編碼一個282個氨基酸殘基的復(fù)制蛋白（Rep），其氨基酸序列與質(zhì)粒pJY33和pKLCA的同源性分別為91%、85%。根據(jù)復(fù)制蛋白、dso和sso的序列特征，推定pQJ012的復(fù)制方式為滾環(huán)復(fù)制，是滾環(huán)復(fù)制pT181家族成員。質(zhì)粒pQJ012可能構(gòu)建為良好的表達載體。

融合魏斯氏菌；隱蔽質(zhì)粒；序列分析；復(fù)制蛋白

魏斯氏菌（Weissella）屬于乳酸菌（Lactic acid bacteria），近年來，魏斯氏菌在微生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)及發(fā)酵、工業(yè)、食品加工等方面的應(yīng)用開始受到研究者的關(guān)注。魏斯氏菌作為益生菌的一員，對胃腸道健康有一定的促進作用［1］。魏斯氏菌具有β-葡糖苷酶活性［2］，較好的抗真菌性［3］，能促進乳桿菌（Lactobacillus）的生長［4］。魏斯氏菌產(chǎn)生的乳酸和各種胞外多糖，對食品的風(fēng)味感官有一定的影響［5］。同時，相關(guān)魏斯氏菌新種的發(fā)現(xiàn)，證實其在食品的防腐方面也有著較大的應(yīng)用潛能［6］。魏斯氏菌益生性質(zhì)的廣泛應(yīng)用有待于其分子與基因水平更深層次的研究。

尋找新的質(zhì)粒，構(gòu)建轉(zhuǎn)化率高的表達載體是促進魏斯氏菌基因工程發(fā)展的方法之一，也是魏斯氏菌走向?qū)嵺`應(yīng)用的有效途徑。2007年P(guān)ark等［7］首次從韓國泡菜分離的食竇魏斯氏菌（W. cibaria）中鑒定出3個質(zhì)粒，pKLCA、pKLCB和pKLCC。國內(nèi)學(xué)者在對發(fā)酵辣白菜的研究中，從食竇魏斯氏菌中分離出2個質(zhì)粒，其大小分別為3 000 bp和8 000 bp［8］。Kim等［9］從韓國泡菜分離得到的食竇魏斯氏菌（W. cibaria KLC140）中發(fā)現(xiàn)6種不同的質(zhì)粒，其中最小的質(zhì)粒長度為2 126 bp，命名為pKW2124，該質(zhì)粒的復(fù)制方式為θ復(fù)制。將pKW2124與slpA和 gfp 的融合基因連接，導(dǎo)入載體pUC19，形成一個8.6 kb的表面展示載體pKWCSLGFP。隨后，相關(guān)學(xué)者把pKW2124的復(fù)制起始點（ori）、核糖體結(jié)合位點（RBS）、復(fù)制蛋白（rep）基因插入克隆載體pUC19，形成載體pKUCm1。實驗發(fā)現(xiàn)，pKUCm1宿主范圍廣泛，包括魏斯氏菌屬（Weissella），乳球菌屬（Lactococcus），明串珠菌屬（Leuconostoc），乳桿菌屬（Lactobacillus），同時，含有啟動子的β-半乳糖苷酶基因被成功插入載體pKUCm1，形成可應(yīng)用于藍白斑篩選的質(zhì)粒pKUGal［7］。目前，已發(fā)現(xiàn)的魏斯氏菌質(zhì)粒還非常有限，而以上已被發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒中除pKW2124的復(fù)制方式被證實為θ復(fù)制外，其余質(zhì)粒復(fù)制方式都不明確。新質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)對魏斯氏菌分子生物學(xué)及遺傳學(xué)的研究具有重要意義。

本研究從融合魏斯氏菌QJ012菌株中分離出一個隱蔽性質(zhì)粒，并對該質(zhì)粒進行測序和分析，旨在構(gòu)建為良好的表達載體。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pUC57為廣州艾基有限生物公司提供，T載體試劑盒、革蘭陽性菌基因組提取試劑盒和PCR（Ex Taq）購自大連寶生物公司（TaKaRa）。質(zhì)粒提取試劑盒購自北京索來寶科技有限公司，膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司（Bio-Tek USA），限制性內(nèi)切酶購自Thermo公司。培養(yǎng)條件：MRS培養(yǎng)基［10］37℃靜置培養(yǎng)18-48 h。

1.2 方法

1.2.1 魏斯氏菌的分離鑒定 菌株QJ012樣本來自湖南泡菜。將泡菜樣品在MRS培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取生長的單菌落進行革蘭染色觀察。魏斯氏菌應(yīng)該為紫紅色的短桿狀細菌。培養(yǎng)篩選出的革蘭陽性菌，用革蘭陽性菌基因組提取試劑盒提取基因組。根據(jù)細菌16S rDNA基因的高度保守，利用細菌16S rDNA通用引物對（正義：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反義：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA -3'），擴增QJ012菌株的16S rDNA基因。PCR擴增片段通過膠回收純化，然后進行A-T克隆，最后送到成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2 生化鑒定 過氧化氫酶試驗采用傳統(tǒng)方法進行。葡萄糖、L-阿拉伯糖、纖維二糖、半乳糖、麥芽糖的發(fā)酵產(chǎn)酸試驗使用細菌微量生化管進行，培養(yǎng)方式為37℃靜置培養(yǎng)［11］。

1.2.3 質(zhì)粒提取與測序 離心收集融合魏斯氏菌QJ012菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pQJ012，膠回收試劑盒分離純化質(zhì)粒條帶。將分離純化得到的質(zhì)粒委托廣州艾基生物有限公司進行測序，方法為物理破碎后導(dǎo)入載體pUC57，然后測序。

1.2.4 酶切鑒定 測序后通過分析pQJ012具有的酶切位點，使用HindⅢ和Nhe I 對質(zhì)粒提取液進行雙酶切，通過分析酶切前后條帶大小，鑒定其能否被相應(yīng)限制性內(nèi)切酶切開。

1.2.5 質(zhì)粒相似性鑒定及序列注釋 利用序列比對工具BLAST，在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對融合魏斯氏菌質(zhì)粒pQJ012的測序結(jié)果，檢索該質(zhì)粒與已知魏斯氏菌質(zhì)粒的同源性。利用NCBI網(wǎng)站上的ORF Finder（Open reading frame finder）尋找該質(zhì)?？赡艽嬖诘拈_放閱讀框（ORF）。利用DNAMAN（V6）軟件標注該質(zhì)粒的重要酶切位點。

1.2.6 復(fù)制方式推定 通過分析質(zhì)粒pQJ012的Rep以及dso和sso保守序列，推導(dǎo)pQJ012復(fù)制方式所屬家族及其可能的復(fù)制方式。

2 結(jié)果

2.1 魏斯氏菌的分離鑒定

從樣本中分離出一株魏斯氏菌，在MRS平板培養(yǎng)基上，魏斯氏菌形成透明的小菌落，呈微隆起圓狀輪廓；革蘭氏染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌呈革蘭氏陽性，短桿狀，將其命名為QJ012。QJ012菌株的16S rDNA基因擴增片段長1 631 bp，序列比對結(jié)果表明，融合魏斯氏菌（W.confusa Inje LM S-338）的16S rDNA序列（GenBank：DQ321751.1）是與擴增片段最相似的序列，相似性為99.9%，1 569 bp中有2個堿基不同；其次是魏斯氏菌（Weissella sp. MMZ50B，GenBank：EU157913.1），相似性為99.7%，1 546 bp中有5個堿基不同。QJ012菌株的16S rDNA基因同與其最相似的融合魏斯氏菌的16S rDNA基因差異僅為0.01 %，可判斷QJ012菌株為融合魏斯氏菌。

2.2 生化試驗驗證

融合魏斯氏菌QJ012的生化試驗結(jié)果為不產(chǎn)生過氧化氫酶，不能利用L-阿拉伯糖，發(fā)酵葡萄糖、纖維二糖、半乳糖和麥芽糖均產(chǎn)酸，符合魏斯氏菌屬和融合魏斯氏菌種的生化特征。生化試驗結(jié)果符合分子鑒定的結(jié)論。

2.3 質(zhì)粒提取與序列測定

融合魏斯氏菌QJ012質(zhì)粒提取液電泳結(jié)果（圖1）顯示該提取液有2個條帶，分別為1.5 kb和14.5 kb，提示QJ012可能攜帶兩個質(zhì)粒。將較小的條帶代表的質(zhì)粒命名為pQJ012，分離純化該質(zhì)粒，委托廣州艾基生物有限公司進行測序。測序后發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒大小為1 489 bp，測序結(jié)果提交GenBank，登錄號為：KR973434。

2.4 酶切鑒定

通過DNAMAN軟件對pQJ012序列的酶切位點分析顯示其能被HindⅢ和Nhe I切開。兩個酶切位點相距347個堿基，雙酶切后，質(zhì)粒將被切為347 bp和1 142 bp兩個線性片段。融合魏斯氏菌質(zhì)粒提取液經(jīng)雙酶切后電泳結(jié)果（圖1）顯示有0.3 kb、1.1 kb、1.2 kb、2 kb和13 kb共5條條帶，其中0.3 kb與1.1 kb條帶應(yīng)為pQJ012被切開后產(chǎn)生的條帶，1.2 kb、2 kb和13 kb條帶應(yīng)為14.5 kb條帶所代表質(zhì)粒被切開后產(chǎn)生的條帶。

圖1 融合魏斯氏菌質(zhì)粒pQJ012酶切鑒定電泳圖

2.5 質(zhì)粒相似性鑒定及序列注釋

質(zhì)粒pQJ012的G+C含量為42.8%，BLAST比對結(jié)果顯示，該質(zhì)粒的核苷酸序列與食竇魏斯氏菌中已被發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒pJY33（2 365 bp）、pKLCA（1 490 bp）最為相似，與pJY33（GenBank number：KF879106.1）的相似性為93%，1 454 bp中相似序列長度為1 354 bp；與pKLCA（GenBank number：AY188776.1）的相似性為92%，1 498 bp中相似序列長度為1 364 bp。目前，pJY33與pKLCA在PubMed尚無文獻可供查閱。通過ORF搜索，pQJ012有5個ORF，ORF1編碼一個282個氨基酸殘基的蛋白，從593 bp到1 441 bp，應(yīng)為該質(zhì)粒的復(fù)制蛋白（Rep）（圖2）；其余ORF在GenBank沒有與之相匹配的蛋白。該Rep的氨基酸序列與pJY33和pKLCA的Rep氨基酸序列同源性分別為91%和85%。 該質(zhì)粒沒有編碼影響菌株表型的蛋白，應(yīng)歸為隱蔽質(zhì)粒。

圖2 質(zhì)粒pQJ012的物理圖譜

2.6 復(fù)制方式推定

滾環(huán)復(fù)制的質(zhì)粒必須攜帶dso和sso位點，并編碼相關(guān)復(fù)制蛋白，根據(jù)dso和復(fù)制蛋白的不同，滾環(huán)復(fù)制的質(zhì)粒至少被分為7大家族：pT181、pC194/pUB110、pE194/pLS1、pSN2、pGA1、pG13和pTX14［12］。pT181家族的復(fù)制蛋白的保守結(jié)構(gòu)域是pfam02486，dso位點有三項特征：復(fù)制蛋白切開位點nic區(qū)的保守序列為TAATAG［13］；圍繞nic區(qū)有3個反向重復(fù)序列［14］；dso位點位于復(fù)制蛋白編碼區(qū)的N端。pT181家族的sso位點為ssoA，其保守序列是TAGCGA/T［13］。經(jīng)過序列分析，pQJ012的復(fù)制蛋白具有保守結(jié)構(gòu)域pfam02486；其dso位點具有pT181家族的三項特征（圖3-A，圖4）。pQJ012的 sso位點吻合ssoA的特征（圖3-B）。綜上，我們推定pQJ012的復(fù)制方式為滾環(huán)復(fù)制，屬于pT181家族。

圖3 質(zhì)粒pQJ012 dso（A）和pQJ012 ssoA（B）序列比對圖

圖4 質(zhì)粒pQJ012復(fù)制起始點示意圖

3 討論

魏斯氏菌屬于益生菌，能產(chǎn)生β-葡糖苷酶、胞外多糖，具有食品防腐性能等優(yōu)勢，在醫(yī)藥與食品加工方面具有極大的開發(fā)潛力和商業(yè)價值。魏斯氏菌質(zhì)粒的研究是在分子基因水平改造魏斯氏菌的基礎(chǔ)，新質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)，對于微生物的遺傳學(xué)研究和構(gòu)建具有自主知識產(chǎn)權(quán)的表達載體都具有重要意義。目前，魏斯氏菌質(zhì)粒的研究還非常有限，魏斯氏菌中已被發(fā)現(xiàn)并對其序列進行了分析研究的質(zhì)粒有pKLCA、pKLCB、pKLCC［7］和pKW2124［9］。以上被發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒中，只有pKW2124的復(fù)制方式已被驗證為θ復(fù)制，同時pKW2124已被成功構(gòu)建為表達載體［9］，而且以上已被分析的魏斯氏菌中的質(zhì)粒均分離自食竇魏斯氏菌。本研究中pQJ012為融合魏斯氏菌中首次被分離報道的質(zhì)粒，pQJ012同食竇魏斯氏菌中已發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒pJY33（2 365 bp）和pKLCA（1 490 bp）最相似。這兩個質(zhì)粒在GenBank中有供查詢的序列，但在PubMed尚無文獻可供直接查閱。

分析pQJ012、pJY33和pKLCA的基本元件，即復(fù)制起點和復(fù)制蛋白，發(fā)現(xiàn)他們都屬于滾環(huán)復(fù)制pT181家族。pQJ012、pJY33與pKLCA的質(zhì)粒復(fù)制雙鏈啟動位點dso都符合滾環(huán)復(fù)制pT181家族的特征，nic區(qū)都含有保守序列TAATAG，圍繞nic區(qū)都有3個反向重復(fù)序列。只是3個質(zhì)粒的反向重復(fù)序列的堿基序列雖然相同，但間距有所不同。3個質(zhì)粒的質(zhì)粒復(fù)制單鏈啟動位點sso都是ssoA。3個質(zhì)粒的推定復(fù)制蛋白（Rep）的氨基酸序列同源性很高，都有滾環(huán)復(fù)制蛋白保守結(jié)構(gòu)域pfam02486。

4 結(jié)論

本研究首次從融合魏斯氏菌中發(fā)現(xiàn)一個隱蔽質(zhì)粒pQJ012，其核苷酸序列同食竇魏斯氏菌中的pJY33和pKLCA的同源性分別為93%和92%。ORF1編碼復(fù)制蛋白（Rep），該復(fù)制蛋白氨基酸序列與質(zhì)粒pJY33和pKLCA的同源性分別為91%和85%。推斷pQJ012的復(fù)制方式為滾環(huán)復(fù)制，屬于滾環(huán)復(fù)制pT181家族成員，質(zhì)粒pQJ012可能構(gòu)建為良好的表達載體。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Complete DNA Sequence Analysis of a Cryptic Plasmid Isolated from Weissella confusa

WANG Hai-juan1DAI Yu-ke2SU Sen-sen1WANG Ying3PAN Qu1
（1. Department of Pathogenic Biology，Chengdu Medical College，Chengdu 610500；2. School of Public Health，Chengdu Medical College，Chengdu 610500；3. Department of Kidney Disease，General Hospital of Chengdu Military Region，Chengdu 610500）

A cryptic plasmid isolated from Weissella confusa QJ012，designated as pQJ012，was sequenced and characterized，and it was a 1489 bp circular molecule with a 42.8% G+C content. The result of BLAST showed that nucleotide sequence of pQJ012 was in homology with pJY33（93%）and pKLCA（92%）. ORF1 encoded a 282 amino acid residue Rep protein that was 91% identical to pJY33 and 85% identical to pKLCA in homology. Sequence analysis indicated that plasmid pQJ012 belonged to pT181 family of rolling-circle replication（RCR）. The pQJ012 may be constructed as a promising expression vector.

Weissella confuse；cryptic plasmid；sequence analysis；replication protein

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.029

2015-08-13

國家自然科學(xué)基金項目（31170007），四川省教育廳科技基金重點項目（14ZA0219），成都醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)學(xué)科建設(shè)項目（CYXK2012005）

王海娟，女，研究方向：病原生物與感染性疾病研究；E-mail：934147264@qq.com

潘渠，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：病原生物與感染性疾病研究，E-mail：ppqlove@126.com；王英，E-mail：renshicu123456@163.com