趙江陳純王軼菲，2王紅，2黃杰，2王浩

（1. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 天津科 技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

山楂提取物對(duì)急性損傷線蟲(chóng)的保護(hù)作用

趙江1陳純1王軼菲1，2王紅1，2黃杰1，2王浩1

（1. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 天津科 技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

以秀麗隱桿線蟲(chóng)（Canorhabditis elegans）為模式生物研究山楂提取物（Haworth fruit extract，HFE）對(duì)其急性氧化損傷的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。飼喂線蟲(chóng)于含有不同濃度（0、25、50和100 μg/mL）HFE的NGM（Nematode growth medium）培養(yǎng)基中，研究HFE對(duì)線蟲(chóng)急性應(yīng)激耐受能力的影響。結(jié)果顯示，飼喂HFE后，秀麗線蟲(chóng)表現(xiàn)出比正常組更高的壽命，并且在胡桃醌氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激及紫外輻射應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中壽命均明顯延長(zhǎng)，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)HFE組線蟲(chóng)的脂褐素自發(fā)熒光明顯減弱，并且與HFE濃度呈劑量依賴效應(yīng)。 HFE能夠顯著延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲(chóng)的壽命，同時(shí)對(duì)多種氧化損傷具有較好的保護(hù)作用，改善機(jī)體的抗氧化能力，有效延緩衰老。

秀麗隱桿線蟲(chóng)；山楂提取物；急性損傷；延緩衰老

在正常情況下，生物體內(nèi)處于氧化與抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，保護(hù)機(jī)體免受損傷。生物體內(nèi)最初的自由基是由機(jī)體正常的代謝活動(dòng)產(chǎn)生［1］，但是當(dāng)受到外界有害刺激，例如，胡桃醌在線蟲(chóng)體內(nèi)分解為超氧化物自由基，紫外線輻射會(huì)破壞機(jī)體內(nèi)的代謝平衡，導(dǎo)致ROS的積累，從而機(jī)體內(nèi)活性氧自由基的數(shù)量會(huì)顯著增多，造成脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的發(fā)生，加速機(jī)體組織功能的損傷［2］。如果不及時(shí)清除體內(nèi)過(guò)量的自由基，就會(huì)引起機(jī)體內(nèi)包括蛋白、核酸及其他大分子物質(zhì)的氧化損傷，對(duì)細(xì)胞活性和功能造成極大的傷害［3］。

秀麗隱桿線蟲(chóng)生命周期短暫，是研究藥物藥理學(xué)和藥物影響基因表達(dá)的理想模式生物［4］。有研究表明線蟲(chóng)長(zhǎng)壽突變體能夠增強(qiáng)抵抗氧化應(yīng)激、紫外輻射損傷、熱應(yīng)激等破壞胞內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡體系的刺激的能力［5］，而所有能夠提高線蟲(chóng)抵抗外界刺激能力的干預(yù)措施均能夠延長(zhǎng)線蟲(chóng)的壽命［6］。

山楂作為一種藥食同源的水果，已經(jīng)被衛(wèi)生部認(rèn)定為功能性食品的原料，并作為中草藥收錄于藥典中［7］。其富含原花青素、黃酮等多種活性成分，可以有效清除體內(nèi)自由基，減少氧化損傷，具有顯著的抗氧化活性。本研究以秀麗隱桿線蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ缴?，?duì)山楂提取物的體內(nèi)抗氧化活性進(jìn)行了研究，觀察正常壽命變化，氧化應(yīng)激能力的變化，以此評(píng)價(jià)HFE的抗氧化能力及調(diào)控衰老的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)、OP50尿嘧啶缺陷型大腸桿菌（E. coli）均由天津科技大學(xué)食品添加劑與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控研究室提供。山楂提取物購(gòu)自天津尖峰有限公司。HWS-850恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱：寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；臺(tái)式冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司；CKX41熒光顯微鏡：奧林巴斯有限責(zé)任公司；UVmini-1240紫外分光光度計(jì)：日本島津儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 壽命實(shí)驗(yàn) 用M9緩沖液反復(fù)沖洗NGM培養(yǎng)基表面的線蟲(chóng)，離心，棄上清，加入M9及線蟲(chóng)裂解液，離心，20℃靜置過(guò)夜，蟲(chóng)卵孵化成L1期線蟲(chóng)，接種到涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)48-54 h，即得到L4期線蟲(chóng)。收集同期化線蟲(chóng)，隨機(jī)分為4組，挑取線蟲(chóng) 至不同濃度山楂提取物的NGM培養(yǎng)基（0、25、50和100 μg/mL），每組5板，每板30條。每4 d更換一次相應(yīng)的新鮮培養(yǎng)基，每2 d定點(diǎn)計(jì)數(shù)1次，同時(shí)觀察線蟲(chóng)的生存狀況，直至線蟲(chóng)全部死亡為止，繪制線蟲(chóng)壽命曲線。

1.2.2 SOD活性的測(cè)定 按照壽命實(shí)驗(yàn)中的飼養(yǎng)方法培養(yǎng)5-6 d。M9緩沖液沖洗NGM表面的線蟲(chóng)，離心，棄上清。加入生理鹽水冰上勻漿，離心，取上清。根據(jù)SOD測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 急性實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 胡桃琨急性實(shí)驗(yàn) 按照壽命實(shí)驗(yàn)中的飼養(yǎng)方法培養(yǎng)5-6 d。挑取線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到胡桃琨終濃度為500 μmol/L的NGM培養(yǎng)基中。每小時(shí)計(jì)數(shù)1次，挑出死亡線蟲(chóng)并計(jì)數(shù)。直至線蟲(chóng)全部死亡為止，繪制線蟲(chóng)壽命曲線。收集存活率為20%時(shí)期的線蟲(chóng)，NaN3麻醉線蟲(chóng)，倒置熒光顯微鏡下，激發(fā)340-380 nm，發(fā)射430 nm，觀察線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素水平，固定曝光時(shí)間和強(qiáng)度，拍攝熒光圖片，檢測(cè)線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素水平。倒置熒光顯微鏡觀察線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素水平。

1.2.3.2 高溫?zé)峒毙詫?shí)驗(yàn) 按照壽命實(shí)驗(yàn)中的飼養(yǎng)方法培養(yǎng)5-6 d。挑取線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到NGM培養(yǎng)基中，30℃，預(yù)熱培養(yǎng)1 h，然后轉(zhuǎn)移至35℃繼續(xù)培養(yǎng)。每小時(shí)計(jì)數(shù)1次，挑出死亡線蟲(chóng)并計(jì)數(shù)直至線蟲(chóng)全部死亡為止，繪制線蟲(chóng)壽命曲線。收集存活率為20%時(shí)期的線蟲(chóng)，倒置熒光顯微鏡觀察線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素水平。

1.2.3.3 紫外輻射急性實(shí)驗(yàn) 按照壽命實(shí)驗(yàn)中的飼養(yǎng)方法培養(yǎng)5-6 d，挑取線 蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到NGM培養(yǎng)基中。將秀麗線蟲(chóng)置于輻射強(qiáng)度為75 uw/cm2紫外線下，暗視野照射13 min。每30 min計(jì)數(shù)1次，挑出死亡線蟲(chóng)并計(jì)數(shù)。直至線蟲(chóng)全部死亡為止，繪制線蟲(chóng)壽命曲線。收集存活率為20%時(shí)期的線蟲(chóng)，倒置熒光顯微鏡觀察線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素水平。

1.3 數(shù)據(jù)的分析與處理

使用SPSS statistics17.0，Excel2003等軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，采用（）的方法表示結(jié)果。P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異，以上結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山楂提取物的活性成分

由液相譜圖結(jié)果（圖1）分析可得，山楂提取物的主要活性成分及其所占比重分別為原花青素B219.86%，表兒茶素15.27%，綠原酸3.10%，金絲桃苷2.91%，異槲皮素1.34%。

2.2 山楂提取物對(duì)線蟲(chóng)壽命 的影響

HFE組線蟲(chóng)的平均壽命和最高壽命均高于對(duì)照組（表1，圖1），且線蟲(chóng)壽命隨著HFE濃度的升高呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，其中100 μg/mL HFE的平均壽命和最高壽命分別較對(duì)照組延長(zhǎng)了23.24%（P<0.05），25.49%（P<0.01），表明HFE能夠有效的延緩線蟲(chóng)衰老，延長(zhǎng)壽命。

圖1 高效液相色譜法測(cè)定山楂活性成分

表1 山楂提取物對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響

圖2 線蟲(chóng)壽命曲線

2.3 山楂提取物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)SOD活力的影響

SOD作為線蟲(chóng)體內(nèi)最主要的抗氧化酶，主要清除機(jī)體內(nèi)過(guò)量的超氧化物自由基。數(shù)據(jù)（圖3）表明總SOD及Cu，Zn-SOD活力與HFE濃度呈劑量依賴效應(yīng)。其中50和100 μg/mL HFE組線蟲(chóng)總SOD活力分別較對(duì)照組提高了8.6%（P<0.05）、16.4%（P<0.05），100 μg/mL HFE組線蟲(chóng)Cu，Zn-SOD活力提高了24.4%（P<0.05）。

圖3 線蟲(chóng)體內(nèi)SOD活力

2.4 急性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 山楂提取物對(duì)胡桃琨氧化損傷線蟲(chóng)的保護(hù)作用 數(shù)據(jù)（圖4）顯示HFE能夠有效延長(zhǎng)胡桃醌氧化損傷線蟲(chóng)的平均存活時(shí)間，減少線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素堆積水平，其中50和100 μg/mL劑量組線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素?zé)晒馑椒謩e較對(duì)照組下降了36.73%（P<0.01）及53.65%（P<0.01）。

2.4.2 山楂提取物對(duì)熱急性損傷線蟲(chóng)的保護(hù)作用

數(shù)據(jù)（圖5）顯示，0、25、50和100 μg/mL HFE組秀麗線蟲(chóng)在35℃高溫環(huán)境中的平均存活時(shí)間分別為10.22、11.13、12.00和12.27 h，脂褐素相對(duì)熒光值分別為0.54、0.42、0.30和0.22單位，表明HFE延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命的同時(shí)也提高線蟲(chóng)的熱應(yīng)激耐受能力。

2.4.3 山楂提取物對(duì)紫外輻射損傷線蟲(chóng)的保護(hù)作用 線蟲(chóng)存活時(shí)間曲線（圖6）顯示，25、50和100 μg/mL HFE劑量組線蟲(chóng)的平均存活壽命較對(duì)照組分別延長(zhǎng)了6.20%、25.81%及35.44%，各劑量組線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素?zé)晒夂烤@著降低（P<0.05）。

圖4 胡桃醌急性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（A：壽命曲線；B：脂褐素?zé)晒鈭D）

圖5 高溫急性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（A：壽命曲線；B：脂褐素?zé)晒鈭D）

圖6 紫外輻射急性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（A：壽命曲線；B：脂褐素?zé)晒鈭D）

3 討論

山楂富含原花青素、黃酮等多種活性成分，可以有效清除體內(nèi)自由基，減少氧化損傷［8］。Liu等［9］研究發(fā)現(xiàn)HFE具有明顯清除羥自由基與過(guò)氧化氫的能力，其抗氧化活性顯著高于維生素C和維生素E。本研究顯示飼喂HFE的線蟲(chóng)平均壽命顯著延長(zhǎng)，脂褐素水平顯著降低，這與汪曉燕等［10］的正丁醇可有效減少線蟲(chóng)體內(nèi)34.3%的ROS含量的研究結(jié)果相一致。此外，綠茶提取物兒茶素能夠影響線蟲(chóng)daf-2胰島素/類胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，減少線蟲(chóng)氧化應(yīng)激損傷［11］。

秀麗隱桿線蟲(chóng)是研究衰老調(diào)控機(jī)制最理想的模式生物之一。本實(shí)驗(yàn)以25、50和100 μg/mL劑量HFE飼喂秀麗隱桿線蟲(chóng)，研究顯示飼喂HFE的線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶SOD的活力顯著升高，減少脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。這與Liu等［12］的研究發(fā)現(xiàn)側(cè)柏中提取的500 μg/mL的正丁醇可有效減少線蟲(chóng)體內(nèi)34.3%的ROS含量等的研究結(jié)果相一致。有研究表明胡桃醌在線蟲(chóng)體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激分解產(chǎn)生超氧化物自由基［13，14］，本研究發(fā)現(xiàn)HFE能夠顯著減少氧化損傷，降低線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素水平，延長(zhǎng)線蟲(chóng)的存活時(shí)間。其中與對(duì)照組相比，100 μg/mL HFE降低了胡桃醌氧化損傷線蟲(chóng)體53.6%的脂褐素水平；研究表明，線蟲(chóng)壽命延長(zhǎng)的同時(shí)其熱應(yīng)激的耐受能力也會(huì)有一定程度的提升［15］，熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中，HFE組線蟲(chóng)壽命有效延長(zhǎng)，熱應(yīng)激耐受能力顯著提高；同時(shí)也有研究證明秀麗線蟲(chóng)壽命的延長(zhǎng)伴隨紫外輻射耐受能力的提高［16］，紫外輻射實(shí)驗(yàn)中，HFE組線蟲(chóng)壽命均高于對(duì)照組，且其效應(yīng)與HFE劑量呈正相關(guān)，100 μg/mL HFE有效延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命34.6%，減少線蟲(chóng)體內(nèi)50.2%的脂褐素。這與Elena等［17］研究發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果提取物能夠延長(zhǎng)秀麗線蟲(chóng)壽命，增加線蟲(chóng)熱應(yīng)激耐受能力，其中age-1突變體線蟲(chóng)紫外輻射存活率提高74.4%，daf-16突變體線蟲(chóng)紫外輻射存活率較空白對(duì)照組降低12.8%的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

一定劑量的山楂提取物可以有效降低線蟲(chóng)體內(nèi)脂褐素水平，在胡桃醌氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激及紫外輻射氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中山楂提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)有顯著的保護(hù)作用。

［1］Beal MF. Aging, energy, and oxidative stress in neurodegenerative diseases［J］. Annals of Neurology, 1995, 38（3）：357-366.

［2］ Niki E. Lipid peroxidation and its inhibition：overview and perspectives［J］. Journal of Oleo Science, 2001, 50：313-320.

［3］ Escobedo J, Pucci AM, Koh TJ. HSP25 protects skeletal muscle cells against oxidative stress［J］. Free Radical Biology and Medicine, 2004, 37（9）：1455-1462.

［4］ Rand JB, Johnson CD. Genetic pharmacology：interactions between drugs and gene products in Caenorhabditis elegans［J］. Methods in Cell Biology, 1995, 48：187-204.

［5］Honda Y, Honda S. Oxidative stress and life span determination in the nematode Caenorhabditis elegans［J］. Annals of the New York Academy of Sciences, 2002, 959（1）：466-474.

［6］Lee EY, Shim YH, Chitwood DJ, et al. Cholesterol-producing transgenic Caenorhabditis elegans lives longer due to newly acquired enhanced stress resistance［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, 328（4）：929-936.

［7］Liu P, Yang B, Kallio H. Characterization of phenolic compounds in Chinese hawthorn（Crataegus pinnatifida Bge. var. major）fruit by high performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry［J］. Food Chemistry, 2010, 121（4）：1188-1197.

［8］Von EM, Brunner H, Haegeli A, et al. Hawthorn/passion flower extract and improvement in physical exercise capacity of patients with dyspnoea class II of the NYHA functional classification［J］. Acta Therapeutica, 1994, 20：47-66.

［9］Liu T, Cao Y, Zhao M. Extraction optimization, purification and antioxidant activity of procyanidins from hawthorn（C. pinnatifida Bge. var. major）fruits［J］. Food Chemistry, 2010, 119（4）：1656-1662.

［10］汪曉燕, 王香明, 王丹巧, 等. 不同生長(zhǎng)階段線蟲(chóng)衰老相關(guān)基因的表達(dá)變化及川芎提取物的調(diào)控作用［J］. 中國(guó)中藥雜志, 2010（12）：1599-1602.

［11］Abbas S, Wink M. Epigallocatechin gallate inhibits beta amyloid oligomerization in Caenorhabditis elegans and affects the daf-2/insulin-like signaling pathway［J］. Phytomedicine, 2010, 17（11）：902-909.

［12］Liu H, Liang F, Su W, et al. Lifespan extension by n-butanol extract from seed of Platycladus orientalis in Caenorhabditis elegans［J］. Journal of Ethnopharmacology, 2013, 147（2）：366-372.

［13］ de Castro E, et al. Isolation of long-lived mutants in Caenorhabditis elegans using selection for resistance to juglone［J］. Free Radical Biology and Medicine, 2004, 37（2）：139-145.

［14］陸婉, 曲中原, 鄒翔, 等. 胡桃醌的研究進(jìn)展［J］. 2008 年中國(guó)藥學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)暨第八屆中國(guó)藥師周論文集, 2008.

［15］Wiegant FAC, Surinova S, Ytsma E, et al. Plant adaptogens increase lifespan and stress resistance in C. elegans［J］. Biogerontology, 2009, 10（1）：27-42.

［16］Lithgow G J, Walker G A. Stress resistance as a determinate of C. elegans lifespan［J］. Mechanisms of Ageing and Development, 2002, 123（7）：765-771.

［17］Vayndorf EM, Lee SS, Liu RH. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans［J］. Journal of Functional Foods, 2013, 5（3）：1235-1243.

（責(zé)任編輯 李楠）

The Protective Effect of Haworth Fruit Extract on Caenorhabditis elegans in Acute Damages

ZHAO Jiang1CHEN Chun1WANG Yi-fei1，2WANG Hong1，2HUANG Jie1，2WANG Hao1
（1. College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. School of Biological Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457）

The work aims to study the protective effect of haworth fruit extract（HFE）on the acute oxidative damage and its possible protection mechanism in Caenorhabditis elegans. The C. elegans were fed with nematode growth medium（NGM）containing different dose of HFE（0，25，50 and 100 μg/mL）to study impacts of HFE on the acute stress tolerance. C. elegans with feeding in different dose of HFE had a longer lifespan than the normal group，moreover，their lifespans became significantly longer under the experiments of juglone oxidative stress，heat stress and UV radiation stress. Concurrently，the autofluorescence level of lipofuscin in HFE group of C. elegans significantly decreased and it was dose-dependent effect to the concentration of HFE. In conclusion，HFE significantly prolongs the lifespan of C. elegans and has a solid protection under a variety of oxidative stress conditions with improving the antioxidant capacity and efficient anti-aging

Caenorhabditis elegans；extract of haworth fruit；acute damage；anti-aging

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.035

2015-08-31

“十二五”國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD33B05）

趙江，男，碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究；E-mail：tozjmail@163.com

王浩，男，博士，副教授，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究；E-mail：wanghao@tust.edu.cn