高秀芝易欣欣劉慧王曉東崔宗均

（1. 北京農學院食品科學與工程學院 農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室 食品質量與安全北京實驗室，北京102206；2. 中國農業(yè)大學農學與生物技術學院 中國農業(yè)大學生物質工程中心，北京 100193）

東北傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵過程中微生物的多樣性

高秀芝1易欣欣1劉慧1王曉東1崔宗均2

（1. 北京農學院食品科學與工程學院 農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室 食品質量與安全北京實驗室，北京102206；2. 中國農業(yè)大學農學與生物技術學院 中國農業(yè)大學生物質工程中心，北京 100193）

以東北傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬為研究對象，分析豆醬發(fā)酵過程中微生物群落的動態(tài)變化。分別選擇發(fā)酵豆醬0、35、65、75和105 d（成品豆醬）作為研究材料，通過PCR-DGGE分析微生物多樣性，檢測了豆醬發(fā)酵過程中蛋白質和氨基酸態(tài)氮的變化。結果表明，豆醬發(fā)酵過程中主要優(yōu)勢細菌為芽孢桿菌和乳酸菌，芽孢桿菌包括枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌的近緣種等；主要乳酸菌為乳球菌、明串珠菌、魏斯氏菌等種屬細菌的近緣種；東北豆醬發(fā)酵過程中優(yōu)勢真菌為米曲霉、散囊菌和謝瓦氏曲霉的近緣種，隨發(fā)酵時間延長數(shù)量逐漸減少；粗蛋白相對含量先略有平穩(wěn)上升后下降，最后成品醬粗蛋白含量下降為24.76%；氨基態(tài)氮含量一直在增加，成品醬中為101.2 g/kg。

PCR-DGGE；傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬；微生物多樣性

豆醬又稱黃豆醬、黃醬或大豆醬，是以大豆為主要原料，經過自然發(fā)酵而成的半流動狀態(tài)的發(fā)酵食品［1］。我國制醬的歷史久遠，起源于我國的制醬工藝早已普及到韓國、日本、印度尼西亞等東南亞國家和地區(qū)。東北作為我國大豆的主產區(qū)，其大豆年產量占全國總產量的50%左右，東北傳統(tǒng)豆醬的制作也是非常普遍的，同時也是我國自制豆醬的主要生產地區(qū)。

豆醬作為主要發(fā)酵豆制品之一，其傳統(tǒng)發(fā)酵過程在多種微生物的參與下，發(fā)生了多種生化反應，產生了多種風味物質，這些風味物質賦予了豆醬特殊的香味、適宜的口感和色澤［2］。豆醬發(fā)酵過程中有多種微生物的參與，目前研究發(fā)現(xiàn)的主要類群有霉菌、酵母菌和細菌［3，4］。霉菌能夠分泌蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等多種酶類，這些酶可以將原料中的蛋白質水解為多肽和多種氨基酸，將淀粉水解為葡萄糖、雙糖、三糖及糊精等物質，為酵母菌和細菌發(fā)酵產生風味物質創(chuàng)造了條件。本研究結合傳統(tǒng)分離方法和現(xiàn)代分子生態(tài)學的手段分析東北傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中微生物菌群的變化，結合蛋白質和氨基酸態(tài)氮的變化分析微生物在豆醬發(fā)酵過程中的主要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

根據東北豆醬的發(fā)酵工藝，分別選擇發(fā)酵豆醬0、35、65、75和105 d（成品豆醬）作為研究材料。1.2 方法

1.2.1 豆醬樣品總DNA提取 取不同時期的豆醬樣品各2.0 g，采用氯苯法［5］，直接從各豆醬樣品中提取豆醬中的基因組總DNA，然后用RNA酶進行純化［6］。

1.2.2 PCR-DGGE

1.2.2.1 細菌PCR 以基因組總DNA為模板，357FGC和517R作為細菌的引物［6］。PCR反應體系為（50 μL）：10×PCR Buffer（Tiangen）5 μL，2 mmol/L dNTP mix 4 μL，45 pmol 357F和517R各0.5 μL，5 unit/μL Taq DNA 聚合酶（Tiangen）0.2 μL，模板10 ng/μL DNA 1 μL。反應程序為95℃ 10 min，93℃變性1 min，48℃ 退火1 min，72℃ 延伸1 min 20 s，共30個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴增產物以2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2.2 真菌PCR 以基因 組總DNA為模板，NL1-GC和LS2作為真菌引物［6］。PCR反應體系為（50 μL）：10×PCR Buffer（Tiangen）5 μL，2 mmol/L dNTP mix 4 μL，45 pmolNL1-GC和LS2各0.5 μL，5 unit/μL Taq DNA 聚合酶（Tiangen）0.3 μL，模板10 ng/μL DNA 1 μL。反應程序為：95℃ 5 min，95℃變性1 min，56℃ 退火45 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸7 min。擴增產物以2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2.3 DGGE及條帶測序 對樣品DNA的PCR產物進行變性梯度凝膠電泳（DGGE），儀器采用Bio-Rad DCode突變檢測系統(tǒng)。膠濃度為20%-60%，取PCR產物13 μL，加入7 μL DGGE loading buffer，混勻后進樣，200 V恒壓，61℃恒溫，電泳5 h。

電泳結束后，使用SYBRRGreen I染色30 min，用凝膠成像儀302 nm下觀察，照相，對特征性條帶進行切膠，回收條帶，對膠回收的條帶再進行一次無GC-夾子的PCR擴增。PCR產物經電泳檢測后，委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。根據16S rDNA和26S rDNA查詢互聯(lián)網數(shù)據庫，分析親緣關系及相似性。

1.2.3 蛋白質及氨基酸的測定

1.2.3.1 粗蛋白的測定 凱氏定氮法測定樣品中粗蛋白［2］，將不同時期豆醬樣品自然干燥，樣品過40目篩，稱取0.1 g左右放入樣品管，每個樣品做3個重復。然后將樣品進行消煮、蒸餾及滴定。稱取0.1 g左右的蔗糖，代替樣品，按以上步驟做空白測定，要求消耗鹽酸的體積不超過0.2 mL；精確稱取0.1 g左右的（NH4）2SO4，按以上步驟做蒸餾回收率測定。

1.2.3.2 氨基酸態(tài)氮的測定 甲醛滴定法測定樣品中氨基酸態(tài)氮［6］，稱取0.2 g樣品于燒杯中，加去離子水50 mL，加2-3滴麝香草酚酞指示劑，搖勻，用0.100 N NaOH溶液滴定至淡藍色。加入中性甲醛20 mL，搖勻，靜置1 min，此時藍色應消失。再用0.100 N NaOH溶液滴定至淡藍色。記錄兩次滴定消耗的堿液毫升數(shù)。

2 結果

2.1 東北豆醬發(fā)酵過程中細菌的多樣性

東北豆醬發(fā)酵過程中細菌的PCR-DGGE圖譜如圖1所示，0 d樣品（原材料）中有多條菌帶，條帶具體信息見表1，其中b、d、k 和l 均維持較長時間，其它條帶在隨后的檢測中很快消失；圖譜中35 d條帶最少，優(yōu)勢種為b、g、k和l，35 d之后仍存在很長時間，數(shù)據庫比對結果為魏斯氏菌屬、乳酸菌和弗氏檸檬酸桿菌的近緣種，它們在整個發(fā)酵過程中起到一定的作用；發(fā)酵65 d以后條帶數(shù)逐漸增多，在最后的成品醬中，條帶較集中，優(yōu)勢種明顯，h、k、l、o和u形成成品醬的最主要的5個條帶。

圖1 東北豆醬發(fā)酵各階段細菌的DGGE分析圖譜

表1 圖1中DGGE條帶的近緣菌

2.2 東北豆醬發(fā)酵過程中真菌的多樣性分析

東北豆醬發(fā)酵過程中真菌PCR-DGGE結果如圖2所示，各條帶具體分析信息見表2。0 d原料中真菌組成較簡單，k、l 和 p 為優(yōu)勢菌條帶，k、l 為假絲酵母屬近緣種，條帶 k 和 p 持續(xù)到發(fā)酵中后期一直存在，但含量逐漸降低，其它條帶（i 和 j）很快消失；豆醬發(fā)酵中期（35-75 d）真菌種類較豐富，有明顯的優(yōu)勢條帶（h、k 和p），成品豆醬（105 d）真菌條帶很少，含量很低。條帶a、b、c、d、e、f和g 在發(fā)酵中期檢測到，成品醬中消失，其中 a 和 d均為曲霉菌（Aspergillus bridgeri）近緣種，b 和 f 均為散囊菌（Eurotium rubrum），可能為同一種菌具有的兩個條帶。

圖2 東北豆醬發(fā)酵各階段真菌的DGGE分析圖譜

2.3 東北豆醬發(fā)酵過程中蛋白質與氨基酸態(tài)氮的變化

東北豆醬在發(fā)酵過程中粗蛋白含量呈現(xiàn)出平穩(wěn)上升然后又迅速下降的變化趨勢（圖3），0 d粗蛋白含量為40.4%，隨后在豆醬發(fā)酵過程中平穩(wěn)上升，65 d粗蛋白含量最高為43.4%，發(fā)酵開始時微生物消耗環(huán)境中的糖，使得豆醬中蛋白質的相對比例提高，最后成品醬105 d中粗蛋白含量下降為24.8%。豆醬發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮呈逐步上升最后趨于平穩(wěn)的變化趨勢（圖3），0 d氨基酸態(tài)氮的含量為58.8 g/kg，最后成品豆醬105 d氨基酸態(tài)氮含量為121.3 g/kg，比0 d增加了接近1.1倍，略低于75 d的氨基酸態(tài)氮的含量，究其原因可能是豆醬抽取醬油時流失到醬油中部分氨基酸態(tài)氮；說明豆醬在發(fā)酵微生物體系中蛋白酶系的作用下，水解產生游離氨基酸，使得環(huán)境中氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升。

表2 圖2中DGGE條帶的近緣菌

圖3 東北豆醬發(fā)酵過程中粗蛋白與氨基酸態(tài)氮的變化

3 討論

在細菌DGGE圖譜中條帶h為明串珠菌屬（91%）近緣種，明串珠菌能夠代謝產生葡聚糖、甘露醇等有益物質，同時代謝能生成風味物質［7］；條帶l為乳酸乳球菌（100%）的近緣種，該種菌在發(fā)酵食品中尤其是乳制品中常被分離到［8，9］，乳酸菌在生長代謝過程中能產生乳酸，與酵母菌代謝產物作用生成酯類物質，認為該菌在成品醬風味形成中起到重要的作用，另外乳酸菌合成的肽聚糖對免疫系統(tǒng)具有調節(jié)作用［10］；條帶o為解脲芽孢桿菌（98%）近緣種，該菌也常參與物質分解，分析對豆醬發(fā)酵有一定的作用；條帶u為梭菌屬（90%）近緣種，在0 d曾出現(xiàn)，發(fā)酵過程中沒有檢測到，而成品醬又重新出現(xiàn)，分析可能為發(fā)酵過程中污染雜菌。

近年來多種散囊菌在磚茶中被分離和鑒定［11］，研究發(fā)現(xiàn)散囊菌發(fā)酵液可促進α-淀粉酶對淀粉的酶解、胃蛋白酶和胰蛋白酶對蛋白質的酶解，有利于淀粉、蛋白質消化吸收，同時還能抑制脂肪在消化系統(tǒng)中的降解、吸收，從而改善人體腸道功能［12］，分析對豆醬的保健功能的形成具有一定的作用；條帶 c 和 g 為謝瓦氏曲霉（Aspergillus chevalieri）近緣種，僅在75 d樣品中有明顯條帶，為四川茯磚茶優(yōu)勢菌，分析可協(xié)同散囊菌共同作用于豆醬發(fā)酵。條帶 p 為米曲霉（Aspergillus oryzae）近緣種，發(fā)酵過程基本一直存在，0 d含量甚微，15 d含量最高，45 d后含量逐漸下降，成品醬（90 d）隱約可見，可產生蛋白酶、淀粉酶及糖化酶等多種酶類，將原料中的蛋白質降解為蛋白胨、多肽及各種氨基酸，將淀粉降解為糊精及各種低分子糖類，如麥芽糖、葡萄糖；條帶 m 和 n 均為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）近緣種，僅在65 d出現(xiàn)，尖孢鐮刀菌是大豆根腐病的主要致病菌，條帶m、n和條帶e、o分析可能為發(fā)酵過程中污染的雜菌。

與山東的傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬比較分析，山東豆醬中的細菌和真菌種類更豐富，原料不同和環(huán)境條件差異是導致兩種豆醬中微生物種類不同的主要原因［13］。其主要的細菌類型為芽孢桿菌和乳酸菌，其中芽孢桿菌基本貫穿整個豆醬發(fā)酵過程，淀粉液化芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）以及乳酸菌中明串珠菌（Leuc onostoc）和魏斯氏菌（Weissella）為首次從豆醬中分離到的細菌［13］。國內一些研究人員認為芽孢桿菌有可能對發(fā)酵不利，但據國外報道韓國傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬［14］和尼日利亞傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品“Soy-daddawa”［15］中芽孢桿菌為發(fā)酵主要作用細菌，本研究結果與國外報道是一致的。而乳酸菌在豆醬發(fā)酵后期起作用，產生風味物質。真菌主要是存在于豆醬發(fā)酵過程中的前期和中期，說明真菌主要是在豆醬發(fā)酵的前期和中期起作用。其中山東豆醬分離特有菌為卷枝毛霉（Mucor circinelloides），東北豆醬PCR-DGGE分析特有散囊菌（Eurotium rubrum）和謝瓦氏曲霉（Aspergillus chevalieri），兩種豆醬共有酵母菌為（Saccharomyces dairensis）。東北豆醬和山東豆醬粗蛋白和氨基酸態(tài)氮發(fā)酵過程中變化趨勢相同［16］，延吉豆醬的粗蛋白發(fā)酵前期至中期高于山東豆醬，原因是延吉豆醬原材料為純大豆，而山東豆醬原料為大豆和玉米（大豆75%，玉米25%）；延吉豆醬發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量明顯高于山東豆醬氨基酸態(tài)氮含量，最后東北豆醬成品醬的氨基酸態(tài)氮含量為山東成品豆醬的1.2倍。氨基酸本身就是重要的呈味物質，特別是游離氨基酸與豆醬獨特風味的形成密切相關［17］。

4 結論

東北豆醬發(fā)酵過程中芽孢桿菌（Bacillus）和乳酸菌（Lactobacteria）為優(yōu)勢細菌，主要芽孢桿菌包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、淀粉液化芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）等；主要乳酸菌為乳球菌（Lactococcus）、明 串 珠 菌（Leuconostoc）、 魏 斯 氏 菌（Weissella cibaria）等種屬的近緣種。東北豆醬發(fā)酵過程中主要工作真菌為米曲霉（Aspergillus oryzae）、散囊菌（Eurotium rubrum）和謝瓦氏曲霉（Aspergillus chevalieri）的近緣種，為豆醬發(fā)酵過程中優(yōu)勢真菌，隨發(fā)酵時間延長數(shù)量逐漸減少。粗蛋白相對含量先略有平穩(wěn)上升后下降，最后成品醬粗蛋白含量下降為24.76%；氨基態(tài)氮含量一直在增加，成品醬中為101.2 g/kg。

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（責任編輯 李楠）

Microbial Diversity of Traditional Soybean Paste During Fermentation in Northeastern China

GAO Xiu-zhi1YI Xin-xin1LIU Hui1WANG Xiao-dong1CUI Zong-jun2
（1. Faculty of Food Science and Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue，Beijing Laboratory of Food Quality and Safety，Beijing 102206；2. Center of Biomass Engineering，College of Agronomy and Biotechnology，China Agricultural University，Beijing 100193）

This work is to analyze the dynamic variation of microbial community during the fermentation of traditional soybean paste in northeastern China. Selecting the fermented 0 d，35 d，65 d，75 d and 105 d soybean pastes as research materials，the microbial diversity was analyzed，and the changes of proteins and amino acid-nitrogen were detected，by PCR-DGGE technique. The results showed that the dominant bacteria during the fermentation of soybean paste were Bacillus and Lactobacteria，and the Bacillus mainly covered the closely related species of B. subtilis，B. pumilus，B. amyloliquefaciens，B. licheniformis，et al. The main species of Lactobacteria included the closely related ones of Lactococcus，Leuconostoc，Weissella cibaria，et al. The dominant fungi during the fermentation of soybean paste were the closely related species of Aspergillus oryzae，Eurotium rubrum，and Aspergillus chevalieri，and they decreased gradually with the fermentation time. The crude protein of the soybean paste finally decreased to 24.76% after increasing smoothly in former fermentation process. The amino acidnitrogen kept on increasing during whole progress and its concentration was up to 101.2 g/kg in final soybean paste.

PCR-DGGE；traditional fermented soybean paste；microbial diversity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.034

2015-07-30

北京市教委面上項目（KM201310020010）

高秀芝，女，博士，副教授，研究方向：食品微生物；E-mail：gxz@bac.edu.cn

崔宗均，男，教授，研究方向：微生物分子生態(tài)學；E-mail：acuizj@cau.edu.cn