葛曉霞

摘要：用RT-PCR擴(kuò)增伏令夏橙體細(xì)胞胚發(fā)生類受體蛋白激酶（somatic embryogenesis receptor-like kinase，SERK）基因ORF區(qū)全長(zhǎng)，克隆入載體，酶切后亞克隆入原核表達(dá)載體，并用SDS-PAGE觀察CitSERK-LIKE基因的原核表達(dá)情況。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了pET-CitSERK1-like原核表達(dá)重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒在大腸桿菌中可經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)分子量約為69 ku的融合蛋白，與預(yù)測(cè)蛋白一致。

關(guān)鍵詞：柑橘；CitSERK1-like；表達(dá)載體；構(gòu)建；原核表達(dá)

中圖分類號(hào)： S188；S666.01

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0022-03

植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生作為植物細(xì)胞全能性的一種表達(dá)方式，是高等植物合子胚發(fā)育早期事件中基因表達(dá)調(diào)控研究的理想模型[1]。體細(xì)胞胚發(fā)生類受體蛋白激酶（somatic embryogenesis receptor-like kinase）是在體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用的一類激酶，屬于LRR-RLK亞家族。Schmidt等首先從胡蘿卜懸浮培養(yǎng)的胚性細(xì)胞中分離出第1個(gè)SERK基因，并發(fā)現(xiàn)它只在胚性細(xì)胞內(nèi)表達(dá)且只表達(dá)到體細(xì)胞胚的球形期[2]。在其他物種中，體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程與SERK基因緊密地聯(lián)系在一起，相繼在多個(gè)物種中克隆并鑒定了SERK基因，如鴨茅[3]、苜蓿[4-5]、水稻[6]、小麥[7]、馬鈴薯[8]、柑橘[9-10]、仙客來(lái)[11]、菠蘿[12-13]等。

本研究在前期克隆獲得柑橘體細(xì)胞胚發(fā)生類受體蛋白激酶基因CitSERK1-like的基礎(chǔ)上[10]，構(gòu)建了CitSERK1-like的原核表達(dá)載體，為今后大量表達(dá)、純化CitSERK1-like蛋白和開展相關(guān)的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 pMD-CitSERK1-like克隆載體的獲得

根據(jù)GenBank登錄的CitSERK-like基因序列 （登錄號(hào)為FJ851422），設(shè)計(jì)正反向引物，F(xiàn)P：5′-ATGAAGACTAAGGTTTGGGCT-3′；RP：5′-TCACCTTGGACCAGATAACTC-3′。PCR 反應(yīng)在 PTC-200 Thermocycler 中進(jìn)行。20 μL反應(yīng)體系為：0.2 μmol/L dNTP，1.5 mmol/L MgCl2，1 U Ex Taq DNA 聚合酶 （TaKaRa，Japan） ，1×buffer，正反向引物各 0.4 μmol/L，50ng模板cDNA。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.8%瓊脂糖凝膠上分離后，用E.Z.N.ADNA 回收試劑盒 （Omega，USA） 回收備用。載體的連接參照TaKaRa公司的pMD18-T Vector試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，經(jīng)PCR檢測(cè)、測(cè)序驗(yàn)證pMD-CitSERK1-like重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.2 pET-CitSERK-like原核表達(dá)載體的構(gòu)建

構(gòu)建CitSERK1-like原核表達(dá)載體引物序列為：YHF：5′-CGGAATTCATGAAGACTAAGGTTTGGGCT-3′ （EcoRⅠ），YHR：5′-GCCTCGAGTCACCTTGGACCAGATAAC-3′ （XhoⅠ），以稀釋的質(zhì)粒pMD-CitSERK1-like為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)回收、測(cè)序，用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒，回收酶切片段，與經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切的pET-28a （+） 載體進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pET-CitSERK1-like，構(gòu)建流程參見圖1。經(jīng)PCR檢測(cè)、酶切、測(cè)序驗(yàn)證ORF正確后用于蛋白表達(dá)。

1.3 pET-CitSERK-like原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-CitSERK1-like和空白載體pET-28a （+） 分別轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E. coli BL21，挑取陽(yáng)性克隆，接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基 （含卡那霉素），37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1 ∶100的比例接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)至D600 nm約為0.6～1.0時(shí)，加IPTG 1.0 mmol/L分別誘導(dǎo)0、1、2、3、4、5、6、7 h。其間收集菌液，4 ℃、12 000 g離心1 min，棄上清液，沉淀用100 μL SDS凝膠加樣緩沖液 （Tris-HCl 50 mmol/L，pH值6.8；SDS 2%；二硫蘇糖醇100 mmol/L；溴酚藍(lán)0.1%；甘油10%） 重懸，混勻后沸水浴5 min，12 000 g 離心1 min，取20 μL上清液于12%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)。樣品在濃縮膠中以40 V電壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠和濃縮膠界面時(shí)，將電壓調(diào)至80 V，直至溴酚藍(lán)接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳，取出凝膠。切除濃縮膠，將分離膠置于考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染色，脫色后進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 pMD-CitSERK1-like克隆載體的獲得

從伏令夏橙甘油誘導(dǎo)1個(gè)月的胚性愈傷中克隆SERK基因，隨機(jī)挑取多個(gè)克隆測(cè)序，獲得包含完整的SERK ORF cDNA序列的單克隆。序列分析結(jié)果表明，CitSERK1-like cDNA 序列長(zhǎng)度為1 866 bp （圖2），編碼621個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量均為69.125 ku。

2.2 pET-CitSERK-like原核表達(dá)載體構(gòu)建

用分別帶有EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)的1對(duì)引物擴(kuò)增CitSERK-like基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)，擴(kuò)增產(chǎn)物在用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切與純化后，連接到使用同樣2個(gè)酶酶切、純化過(guò)的pET-28a （+） 載體上，構(gòu)建獲得原核表達(dá)載體pET-CitSERK1-like。含該表達(dá)載體的克隆經(jīng)PCR檢測(cè)、酶切驗(yàn)證，圖3結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增片段、酶切片段與CitSERK-like基因編碼區(qū)片段大小相同。測(cè)序確認(rèn)讀碼框正確后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株BL21中誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。

2.3 CitSERK-like基因的原核表達(dá)與SDS-PAGE分析

重組質(zhì)粒pET-CitSERK1-like轉(zhuǎn)入E.coli BL21后，用IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)。結(jié)果表明，pET-CitSERK1-like能夠表達(dá)1條約69 ku的特異蛋白 （箭頭所示），與預(yù)測(cè)的含有六聯(lián)組氨酸標(biāo)簽 （6×His Tag） 的融合蛋白的分子量大小吻合，而空白對(duì)照pET-28a （+） 質(zhì)粒表達(dá)的蛋白中沒有此帶（圖4）。

3 討論

在高等植物中，體細(xì)胞胚發(fā)生為基因工程、細(xì)胞工程等生物技術(shù)改良品種提供了良好的試驗(yàn)體系[14]。體細(xì)胞胚發(fā)生類受體蛋白激酶在植物生命活動(dòng)中是極其重要的一類激酶，目前，擬南芥[15]、水稻[6]、萵苣[16]等多個(gè)物種中相繼獲得轉(zhuǎn)基因植株，證明該基因在植物體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，該基因在參與植物生命活動(dòng)，如植物發(fā)育[4，17]、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[18-19]和抗逆反應(yīng)[6]等方面具有非常重要的生理功能。雖然在不同物種中已分離鑒定出眾多體細(xì)胞胚發(fā)生類受體蛋白激酶，但目前對(duì)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和配體識(shí)別等方面了解還并不清晰，要闡明體細(xì)胞胚類受體蛋白激酶在體胚發(fā)生過(guò)程中的作用，還需從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步研究。本研究構(gòu)建了柑橘CitSERK-like基因的原核表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌中成功表達(dá)了含His-tag的融合蛋白，為進(jìn)一步進(jìn)行蛋白純化以及驗(yàn)證CitSERK1-like蛋白功能創(chuàng)造了條件。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zimmerman J L. Somatic embryogenesis：a model for early development in higher plants[J]. The Plant Cell，1993，5（10）：1411-1423.

[2]Schmidt E D，Guzzo F，Toonen M A，et al. A leucine-rich repeat containing receptor-like kinase marks somatic plant cells competent to form embryos[J]. Development，1997，124（10）：2049-2062.

[3]Somleva M N，Schmidt E D L，de Vries S C. Embryogenic cells in Dactylis glomerata L. （Poaceae） explants identified by cell tracking and by SERK expression[J]. Plant Cell Reports，2000，19（7）：718-726.

[4]Nolan K E，Irwanto R R，Rose R J. Auxin up-regulates MtSERK1 expression in both Medicago truncatula root-forming and embryogenic cultures[J]. Plant Physiology，2003，133（1）：218-230.

[5]Nolan K E，Kurdyukov S，Rose R J. Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE1 （SERK1） gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula[J]. Journal of Experimental Botany，2009，60（6）：1759-1771.

[6]Hu H，Xiong L，Yang Y. Rice SERK1 gene positively regulates somatic embryogenesis of cultured cell and host defense response against fungal infection[J]. Planta，2005，222（1）：107-117.

[7]Singla B，Khurana J P，Khurana P. Characterization of three somatic embryogenesis receptor kinase genes from wheat，Triticum aestivum[J]. Plant Cell Reports，2008，27（5）：833-843.

[8]Sharma S K，Millam S，Hein I，et al. Cloning and molecular characterisation of a potato SERK gene transcriptionally induced during initiation of somatic embryogenesis[J]. Planta，2008，228（2）：319-330.

[9]Shimada T，Hirabayashi T，Endo T，et al. Isolation and characterization of the somatic embryogenesis receptor-like kinase gene homologue （CitSERK1） from Citrus unshiu Marc.[J]. Scientia Horticulturae，2005，103（2）：233-238.

[10]Ge X X，F(xiàn)an G E，Chai L J，et al. Cloning，molecular characterization and expression analysis of a SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE gene （CitSERK1-like） in Valencia sweet orange[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2010，32（6）：1197-1207.

[11]Savona M，Mattioli R，Nigro S，et al. Two SERK genes are markers of pluripotency in Cyclamen persicum Mill[J]. Journal of Experimental Botany，2012，63（1）：471-488.

[12]Ma J，He Y，Hu Z，et al. Characterization and expression analysis of AcSERK2，a somatic embryogenesis and stress resistance related gene in pineapple[J]. Gene，2012，500（1）：115-123.

[13]Ma J，He Y H，Wu C H，et al. Cloning and molecular characterization of a SERK gene transcriptionally induced during somatic embryogenesis in Ananas comosus cv. Shenwan[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2012，30（1）：195-203.

[14]Guo W W，Li D L，Duan Y X. Citrus transgenics：current status and prospects[J]. Transgenic Plant Journd，2007，1：202-209.

[15]Hecht V，Vielle-Calzada J P，Hartog M V，et al. The arabidopsis SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASE 1 gene is expressed in developing ovules and embryos and enhances embryogenic competence in culture[J]. Plant Physiology，2001，127（3）：803-816.

[16]Santos M O，Romano E，Vieira L S，et al. Suppression of SERK gene expression affects fungus tolerance and somatic embryogenesis in transgenic lettuce[J]. Plant Biology，2009，11（1）：83-89.

[17]Albrecht C，Russinova E，Hecht V，et al. The Arabidopsis thaliana SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASES1 and 2 control male sporogenesis[J]. The Plant Cell，2005，17（12）：3337-3349.

[18]Albertini E，Marconi G，Reale L，et al. SERK and APOSTART：candidate genes for apomixis in Poa pratensis[J]. Plant Physiology，2005，138（4）：2185-2199.

[19]Albrecht C，Russinova E，Kemmerling B，et al. Arabidopsis SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASE proteins serve brassinosteroid-dependent and-independent signaling pathways[J]. Plant Physiology，2008，148（1）：611-619.賀 容，張生珍，王 超，等. 羊種布氏桿菌3型Omp25基因序列及其表達(dá)蛋白生物信息學(xué)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：25-28.