李輝+果雙雙+施振旦

摘要：為提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，便于運(yùn)輸和延長(zhǎng)儲(chǔ)存時(shí)間，冷凍干燥是目前公認(rèn)最可行的技術(shù)之一。通過(guò)對(duì)豬重組抑制素蛋白冷凍干燥后的外觀、色澤、復(fù)水性以及SDS-PAGE電泳檢測(cè)，對(duì)27種常用凍干保護(hù)性物質(zhì)進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，可溶淀粉和β-環(huán)糊精的保護(hù)效果較好，表現(xiàn)在外形飽滿無(wú)坍縮、色澤細(xì)膩白亮、復(fù)溶后無(wú)沉淀、電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)蛋白條帶無(wú)降解。將篩選出的2個(gè)保護(hù)劑制備成凍干樣品放置于37 ℃烘箱中，進(jìn)行加速穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果表明，在37 ℃放置4個(gè)月后，凍干蛋白樣品保持形態(tài)色澤不變，復(fù)溶后無(wú)沉淀，蛋白無(wú)降解現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞：重組豬抑制素；冷凍干燥；凍干保護(hù)劑；復(fù)水性；穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)： Q51

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0291-03

抑制素是一種主要由雌性動(dòng)物卵泡顆粒細(xì)胞和雄性動(dòng)物睪丸支持細(xì)胞分泌的糖蛋白激素[1]，主要通過(guò)負(fù)反饋?zhàn)饔靡种拼贵wFSH、LH的分泌[2]。通過(guò)主動(dòng)或被動(dòng)免疫抑制素，可促進(jìn)垂體FSH、LH分泌，從而促進(jìn)動(dòng)物的繁殖活動(dòng)[3-6]。因此在實(shí)際生產(chǎn)中可以通過(guò)注射重組抑制素的方法，利用動(dòng)物的免疫機(jī)能，降低體內(nèi)抑制素水平，提高動(dòng)物生產(chǎn)力[7-8]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行了重組豬抑制素蛋白的大規(guī)模發(fā)酵制備研究，已經(jīng)制備了大量純度較高重組蛋白。但是作為一種生物制品，應(yīng)用于生產(chǎn)中尚存在溶液性蛋白穩(wěn)定性差、遠(yuǎn)距離運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中受溫度影響較大等缺陷[9]，因此，常通過(guò)冷凍干燥的方法制成凍干品以避免[10]。

冷凍干燥的基本原理是將蛋白溶液在低溫下凍結(jié)，真空條件下干燥而形成固體制劑。干燥過(guò)程又分為2步：移除結(jié)晶水的初步干燥和移除結(jié)合水的二次干燥[11]。然而冷凍干燥操作本身也會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，具體在于冷凍過(guò)程和干燥過(guò)程。在冷凍過(guò)程中，主要是冰晶的形成、離子強(qiáng)度的增加、pH值的改變和相分離等影響因素[12]。而在干燥過(guò)程中，尤其是在二次干燥即移除結(jié)合水的過(guò)程中，蛋白的水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面的氫鍵遭到破壞，引起蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響電荷分布，導(dǎo)致蛋白變性凝聚[9]。經(jīng)過(guò)冷凍后的蛋白質(zhì)多出現(xiàn)溶解度差、生物活性下降甚至降解等問(wèn)題。因此，在冷凍干燥過(guò)程中常在蛋白質(zhì)溶液中添加糖類、氨基酸類、蛋白類和高分子化合物等保護(hù)劑，以減少或者阻止冷凍和干燥過(guò)程中對(duì)蛋白質(zhì)的損傷[13]。

本研究著重對(duì)重組豬抑制素蛋白的凍干保護(hù)劑進(jìn)行篩選，以期篩選出1種或幾種具有良好保護(hù)效果的保護(hù)劑，為實(shí)際生產(chǎn)中的大規(guī)模推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 純化重組豬抑制素蛋白溶液（濃度5 mg/mL）由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。其他所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 真空冷凍干燥機(jī)（LGJ-12，北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；垂直電泳系統(tǒng)（北京六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon1600，上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理 將27種待測(cè)凍干保護(hù)劑按3%（m/V）比例分別添加到重組豬抑制素蛋白溶液中，待保護(hù)劑完全溶解后，用0.22 μm細(xì)菌濾器過(guò)濾除菌并分裝至1.5 mL的無(wú)菌離心管內(nèi)備用，每管1 mL。

1.2.2 凍干處理 凍干過(guò)程中有常規(guī)工藝，流程如下：（1）預(yù)凍。將分裝好的樣品，放入-80 ℃冰箱中預(yù)凍，使樣品完全結(jié)冰；同時(shí)，打開(kāi)冷凍干燥機(jī)的壓縮機(jī)，使凍干機(jī)的冷阱溫度降至-50 ℃以下。（2）升華干燥。將預(yù)凍好的樣品打開(kāi)蓋子，迅速放入凍干機(jī)的擱板上并蓋上真空罩，開(kāi)啟真空泵抽真空，使真空度降至1 Pa，并保持12 h；待樣品完全干燥后，取出樣品蓋上蓋子，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 凍干樣品的檢測(cè)

1.3.1 外觀檢查 應(yīng)以白色疏松體、骨架成型好、無(wú)坍縮、外形細(xì)致為好。

1.3.2 復(fù)水性檢查 取1 mL蒸餾水加入凍干樣品中，應(yīng)以迅速溶解、無(wú)沉淀為好。

1.3.3 蛋白穩(wěn)定性檢查 取復(fù)水后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，以無(wú)降解條帶為好。

1.3.4 37 ℃加速穩(wěn)定性試驗(yàn) 通過(guò)外觀、復(fù)水性和蛋白穩(wěn)定性檢查后，篩選出較好的組放入37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行加速穩(wěn)定性試驗(yàn)，時(shí)間為4個(gè)月，每個(gè)月定期取樣并重復(fù)上述檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外觀及復(fù)水性檢查

添加凍干保護(hù)劑的凍干制品均為白色疏松體，但大部分表現(xiàn)出坍縮、中空，樣品呈絲狀或絮狀。而添加甘露醇、PEG系列、甘氨酸、磷酸氫二鈉、L-半胱氨酸、可溶淀粉和β-環(huán)糊精組表現(xiàn)出細(xì)致粉狀，不易松散，樣品表面整齊、光滑、無(wú)肉眼可見(jiàn)細(xì)孔。凍干樣品加水后均能迅速溶解，但有少量沉淀，僅添加可溶淀粉和β-環(huán)糊精組能徹底溶解。對(duì)照組則呈現(xiàn)出微黃色絮狀，加水后漂浮于液面之上，經(jīng)超聲波及加熱助溶后仍不溶解（表1）。上述結(jié)果說(shuō)明可溶淀粉和β-環(huán)糊精對(duì)重組豬抑制素蛋白的冷凍干燥具有較好的保護(hù)作用。

2.2 蛋白穩(wěn)定性檢查

加水溶解后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加凍干保護(hù)劑的試驗(yàn)組中蛋白條帶無(wú)降解（圖1）。

2.3 37 ℃加速穩(wěn)定性試驗(yàn)

將篩選出的可溶淀粉和β-環(huán)糊精2組放入37 ℃烘箱進(jìn)行處理。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，保存1～4個(gè)月凍干品的外觀形態(tài)、顏色、復(fù)水性以及蛋白的穩(wěn)定性無(wú)明顯變化（表2、圖2）。

3 討論

蛋白溶液類藥物的運(yùn)輸和儲(chǔ)存對(duì)外界環(huán)境（尤其是對(duì)溫度）的要求較苛刻，因此一般須在2～8 ℃環(huán)境下儲(chǔ)運(yùn)。而經(jīng)過(guò)干燥處理后，在保證蛋白質(zhì)活性和復(fù)水性不變的前提下可降低環(huán)境溫度的影響，而且凍干后的蛋白質(zhì)量較輕，可降低運(yùn)輸成本。目前的干燥技術(shù)有噴霧干燥[14-15]、噴霧-冷凍干燥[16-18]、流化床干燥[19]和冷凍干燥等幾種，其中應(yīng)用最廣泛的是冷凍干燥。冷凍干燥是通過(guò)抽真空而降低水的沸點(diǎn)，使樣品中的冰直接升華為水蒸氣的方法。因?yàn)樵跇悠穬鼋Y(jié)狀態(tài)，且在接近真空的條件下進(jìn)行，所以冷凍干燥具有其他方法所不能比擬的優(yōu)勢(shì)，例如：保證了蛋白質(zhì)的生物活性、損失少、體積不改變、凍干產(chǎn)品為多孔狀、易溶、樣品氧化少、干燥徹底等[11，20]。據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局信息，目前我國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)上市的凍干蛋白類藥物產(chǎn)品有重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、注射用重組人干擾素α2b、鼠表皮生長(zhǎng)因子、外用重組人表皮生長(zhǎng)因子、注射用重組鏈激酶、注射用重組人白介素-2、注射用重組人生長(zhǎng)激素、人凝血因子Ⅷ、人纖維蛋白原等。

在冷凍干燥過(guò)程中需要添加保護(hù)劑以盡可能維持蛋白的生物學(xué)活性和溶解性。關(guān)于保護(hù)劑可保護(hù)冷凍干燥中蛋白質(zhì)穩(wěn)定的機(jī)制，目前主要有2種觀點(diǎn)：（1）具有黏性的保護(hù)劑包圍在蛋白質(zhì)分子周圍，組織蛋白質(zhì)的伸展和沉淀，也稱之為玻璃態(tài)假說(shuō)；（2）蛋白質(zhì)分子中存在著大量氫鍵，結(jié)合水通過(guò)氫鍵與蛋白質(zhì)分子連接，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在冷凍干燥過(guò)程中失去水分后，保護(hù)劑能替代水分子，保持氫鍵的連接，使蛋白質(zhì)分子不直接暴露在外，也稱之為水替代假說(shuō)。目前大多數(shù)學(xué)者較認(rèn)可后者。因此一些容易生成氫鍵的多羥基化合物，如糖類、多元醇、一些氨基酸、蛋白質(zhì)[21-24]和鹽類等成為凍干保護(hù)劑的首選[25-26]。此外，凍干保護(hù)劑的選擇還要力求成本低廉、無(wú)污染以及配方簡(jiǎn)單。有研究發(fā)現(xiàn)，保護(hù)劑的分子量也會(huì)影響到蛋白的凍干及凍干后蛋白穩(wěn)定性，Tonnis等對(duì)分子量從6 ku到540 ku的糖類進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)并非分子量越大的糖保護(hù)效果越好，而是糖鏈較柔軟易彎曲的糖類保護(hù)效果較好[9]。通過(guò)對(duì)重組豬抑制素的凍干研究，篩選出的可溶淀粉和β-環(huán)糊精具有較好的保護(hù)效果。這2種物質(zhì)也常用作食品和藥品的輔料和增容劑，其具有較好保護(hù)效果可能與其空間位阻小，較容易隨蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)折疊而折疊有關(guān)。NaCl在凍干過(guò)程中也起重要作用，Andrea等研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)NaCl凍干樣品表現(xiàn)出外形致密水晶狀，凍干時(shí)間較長(zhǎng)。當(dāng)NaCl含量升高至0.3%時(shí)，凍干品呈現(xiàn)出光滑疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因此相對(duì)于無(wú)NaCl樣品，凍干速度更快[13]。本研究將蛋白質(zhì)溶解于NaCl濃度為0.9%的生理鹽水中，凍干過(guò)程中的表現(xiàn)與Andrea等的結(jié)果一致。

我國(guó)大部分的地區(qū)夏季氣溫最高在37 ℃，在凍干蛋白藥品運(yùn)輸儲(chǔ)存時(shí)一般不高于此溫度，因此選擇37 ℃作為加速穩(wěn)定試驗(yàn)的溫度。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，凍干品37 ℃處理4個(gè)月不影響外觀及穩(wěn)定性。董世娟等在重組豬IFNα的凍干研究中發(fā)現(xiàn)添加2%～5%的甘露醇作為保護(hù)劑具有較好的保護(hù)效果，在40 ℃加速穩(wěn)定試驗(yàn)3個(gè)月后，凍干品穩(wěn)定性無(wú)明顯變化[27]。鄒民吉等對(duì)重組SRH蛋白同樣在37 ℃進(jìn)行加速穩(wěn)定試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)右旋糖苷40、蔗糖和甘氨酸組成的保護(hù)劑具有較好的保護(hù)效果[28]。張雪梅等篩選出15 mmol/L精氨酸+10 mmol/L谷氨酸+4%甘露醇+1%蔗糖/海藻糖，然后放置于40 ℃處理12個(gè)月不影響蛋白穩(wěn)定性[29]。說(shuō)明添加保護(hù)劑凍干后的蛋白在室溫下穩(wěn)定性很高，即便提高保存溫度，藥品的穩(wěn)定性也不受影響。

隨著基因工程技術(shù)的進(jìn)步，越來(lái)越多人類急需的蛋白質(zhì)藥物開(kāi)發(fā)出來(lái)。針對(duì)不同的蛋白需要量身定做高效的凍干保護(hù)劑。盡管目前已經(jīng)在該領(lǐng)域取得了令人欣喜的進(jìn)步，但是對(duì)于其保護(hù)機(jī)理仍未清晰。因此未來(lái)的主要研究方向?qū)⑹枪タ吮Ｗo(hù)機(jī)理，然后通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)分子的氨基酸構(gòu)成以及三維空間結(jié)構(gòu)的分析，對(duì)應(yīng)性地設(shè)計(jì)一些高效凍干保護(hù)劑，進(jìn)一步提高凍干產(chǎn)品的品質(zhì)。

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