白僵菌生產(chǎn)中防霉劑的應(yīng)用研究

繆 東，舒 燕，鄔里洋，周映華，王升平，高書鋒，周小玲，曾發(fā)嬌

（湖南省微生物研究院，湖南　長沙 410009）

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白僵菌生產(chǎn)中防霉劑的應(yīng)用研究

繆 東，舒 燕，鄔里洋，周映華，王升平，高書鋒，周小玲，曾發(fā)嬌

（湖南省微生物研究院，湖南長沙 410009）

摘 要：為了解決白僵菌固體培養(yǎng)時(shí)易遭受霉菌污染問題，以玉米螟白僵菌ABUV-3和松毛蟲白僵菌DBUV-7為供試菌株，對(duì)40%克菌靈等5種防霉劑進(jìn)行了系列研究。結(jié)果表明：5種防霉劑對(duì)毛霉菌、木霉菌、根霉菌、綠霉菌和黃曲霉菌的孢子和菌體均有抑制作用，其中以70%菌絕殺可溶性和綠霉霸粉劑的抑制效果最好；雖然5種防霉劑直接作用時(shí)會(huì)對(duì)白僵菌的孢子萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用，但在固體培養(yǎng)生產(chǎn)孢子時(shí)添加一定量的防霉劑，對(duì)孢子產(chǎn)量及其萌發(fā)并沒有抑制作用。因此，建議在白僵菌生產(chǎn)過程中，在固體培養(yǎng)基中添加70%菌決殺和綠霉霸粉劑500倍液（折合劑量為2 mg/mL），用以抑制霉菌的污染。

關(guān)鍵詞：白僵菌；防霉劑；孢子萌發(fā)；霉菌污染

白僵菌是一種半知菌類廣譜性寄生蟲真菌，自1890年美國堪薩斯州首次利用白僵菌成功地防治麥長蝽以來，該真菌在農(nóng)林牧草害蟲防治領(lǐng)域的應(yīng)用已超過100 a的歷史，取得了較好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，其防治對(duì)象涉及9個(gè)目34科的200種害蟲［1-2］。白僵菌防治害蟲的原理是以分生孢子寄生蟲體而致使其死亡。目前，白僵菌分生孢子主要通過固體培養(yǎng)獲得，而固體培養(yǎng)一般采取開放式培養(yǎng)方式，培養(yǎng)基裸露于空氣中，易受各種霉菌的污染，造成損失［3-7］。因此，為了解決白僵菌生產(chǎn)中的霉菌污染問題，實(shí)現(xiàn)白僵菌孢子穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)，以玉米螟白僵菌ABUV-3和松毛蟲白僵菌 DBUV-7為供試菌株，對(duì)40%克菌靈等5種防霉劑進(jìn)行了系列研究，以期為白僵菌在作物病蟲害防治領(lǐng)域的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種 玉米螟白僵菌 ABUV-3來自湖南省微生物研究所，松毛蟲白僵菌 DBUV-7從溆浦縣微生物所引進(jìn)，毛霉菌，根霉菌、木霉菌、綠霉菌和黃曲霉菌從食用菌污染中分離純化獲得。

1.1.2 供試防霉劑 40%克霉靈可濕性粉劑和40%克霉凈粉劑（山西省運(yùn)城市玉化工實(shí)驗(yàn)廠），70%菌絕殺可溶性粉劑（山西省運(yùn)城市豐玉化工實(shí)驗(yàn)廠），綠霉霸（山西省永濟(jì)市君宏應(yīng)用化工廠），草酸（廣州化學(xué)試劑廠）。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）白僵菌液體培養(yǎng)基：土豆20%，葡萄糖20%，蛋白胨0.5%。（2）白僵菌固體培養(yǎng)基：麥麩70%，米粉10%，糠殼20%。（3）霉菌液體培養(yǎng)基：土豆20%，葡萄糖2%。（4） 霉菌固體平板培養(yǎng)基：土豆20%，葡萄糖2%， 瓊脂2%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同種類防霉劑對(duì)白僵菌分生孢子萌發(fā)的影響以白僵菌液體培養(yǎng)基為溶劑，將防霉劑稀釋成100、200、300、400、500倍的霉菌稀釋液，每個(gè)濃度設(shè)3次重復(fù)，高壓消毒20 min，冷卻備用。每個(gè)三角搖瓶（容量300 mL，裝液量1/3）接白僵菌孢子粉一環(huán)，置25℃恒溫?fù)u床（200 r/min）培養(yǎng)，從培養(yǎng)16 h開始每隔4 h取樣一次，在顯微鏡下檢查孢子的萌發(fā)情況，以不加防霉劑的白僵菌培養(yǎng)液作空白對(duì)照。

1.2.2 不同種類防霉劑對(duì)霉菌孢子萌發(fā)的影響 以霉菌液體培養(yǎng)基為溶劑，將防霉劑配制成10 mg/mL的母液，在此基礎(chǔ)上將各防霉劑母液稀釋成100、200、300、400、500倍的霉菌稀釋液，每個(gè)濃度設(shè)3次重復(fù)，高壓消毒20 min，冷卻備用。接種不同霉菌孢子粉一環(huán)，置25℃恒溫箱中培養(yǎng)，每4 h取樣1次，在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)和菌絲體生長情況。

1.2.3 不同濃度防霉劑涂布對(duì)霉菌菌絲生長的影響用無菌水作溶劑，將防霉劑配制成10 mg/mL的母液，在此基礎(chǔ)上將各防霉劑母液稀釋成100、200、300、400、500倍的霉菌稀釋液，每種防霉劑每個(gè)濃度吸0.2 mL涂布到霉菌培養(yǎng)平板上，以無菌水作空白對(duì)照，置25℃恒溫箱中培養(yǎng)，每隔4 h觀察平板上霉菌菌絲體生長變化的情況。

1.2.4 不同種類防霉劑對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響 用自來水配制不同濃度的防霉劑稀釋夜，在白僵菌固體培養(yǎng)基中加入75%的防霉劑，攪拌均勻，堆制后用塑料布蓋上悶1 h左右；每個(gè)處理接種25%的白僵菌種子發(fā)酵液，攪拌均勻用塑料框盛裝，厚度約16 cm，25℃恒溫保濕培養(yǎng)，待形成分生孢子后停止培養(yǎng)，40℃下干燥，均勻取樣；稱取1 g樣品，搗碎，用0.1%吐溫作稀釋劑，根據(jù)產(chǎn)孢量的多少進(jìn)行適當(dāng)稀釋，在顯微鏡下用血球板計(jì)算白僵菌產(chǎn)孢量。

1.2.5 添加防霉劑生產(chǎn)的白僵菌分生孢子萌發(fā)率的檢測(cè) 將不同種類防霉劑生產(chǎn)的白僵菌孢子粉接種至白僵菌孢子萌發(fā)培養(yǎng)液中，放置在25℃恒溫?fù)u床上（200 r/min）培養(yǎng)；從培養(yǎng)16 h開始，每2 h取樣1次，在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，每種每次觀察100個(gè)孢子，以不加防霉劑培養(yǎng)的白僵菌孢子粉作空白對(duì)照，比較其萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類防霉劑對(duì)白僵菌分生孢子萌發(fā)的影響

從表1中可以看出，各防霉劑對(duì)白僵菌孢子萌發(fā)均有不同程度的抑制作用；其中，以70%菌絕殺和綠霉霸粉劑的抑制作用最明顯，100～400倍稀釋液條件下白僵菌孢子均不能萌發(fā)；40%克霉靈可濕性粉劑、40%克霉凈粉劑、草酸對(duì)白僵菌孢子萌發(fā)的抑制濃度分別為100倍、100倍、200倍。這表明，各防霉劑對(duì)白僵菌分生孢子的抑制作用由高到低依次為70%菌絕殺＞綠霉霸粉劑＞40%克霉靈可濕性粉劑＞40%克霉凈粉劑＞草酸，其對(duì)白僵菌分生孢子的抑制劑量分別為1.75、2.5、4.0、4.0和5.0 mg/mL。

表1 不同種類防霉劑處理對(duì)白僵菌分生孢子萌發(fā)抑制作用的比較

2.2 不同種類防霉劑對(duì)霉菌孢子萌發(fā)的影響

從表2中可以看出，不同種類防霉劑對(duì)同一霉菌的抑制作用有差異，同一種防霉劑對(duì)不同霉菌的抑制作用也有區(qū)別。其中，70%菌絕殺和綠霉霸粉劑的抑霉效果最顯著，稀釋500倍時(shí)，綠霉菌和黃霉菌孢子均未萌芽，而毛霉菌、木霉菌和根霉菌孢子在稀釋400倍時(shí)也不能萌芽；其他3種防霉劑對(duì)霉菌的抑制濃度為100～200倍液。

2.3 不同濃度防霉劑涂布對(duì)霉菌菌絲生長的影響

表2 不同種類防霉劑處理對(duì)霉菌孢子萌發(fā)抑制作用的比較

由表3可知，70%菌絕殺和綠霉霸的抑霉效果最好，不同稀釋倍數(shù)涂布，5種霉菌的菌絲生長均受抑制；其中，70%菌絕殺粉劑，稀釋200倍涂布時(shí)根霉菌和綠霉菌的菌絲溶解變色，稀釋100倍涂布時(shí)，木霉菌和黃霉菌的菌絲溶解變色；綠霉霸粉劑稀釋300涂布時(shí)，綠霉菌的菌絲溶解變色。40%克霉靈可濕性粉稀釋300倍涂布時(shí)，5種霉菌的菌絲生長均受抑制。40%克霉凈粉稀釋300倍涂布時(shí)，毛霉菌和木霉菌的菌絲生長均受抑制；稀釋200倍涂布時(shí)，根霉菌、綠霉菌和黃霉菌的菌絲生長均受抑制。草酸稀釋200倍涂布時(shí)，毛霉菌、木霉菌、根霉菌和綠霉菌的菌絲生長均受抑制；稀釋100倍時(shí)，黃霉菌的菌絲生長均受抑制。

表3 不同濃度防霉劑涂布對(duì)霉菌菌絲生長的影響

2.4 不同種類防霉劑對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響

從表4中可以看出，在固體培養(yǎng)基中添加稀釋300倍的防霉劑，各處理的孢子產(chǎn)量與對(duì)照處理差異不顯著，且能有效抑制霉菌的生長。這說明通過防霉劑抑制白僵菌分生孢子生產(chǎn)中霉菌的發(fā)生切實(shí)可行。

2.5 添加防霉劑生產(chǎn)的白僵菌分生孢子萌發(fā)率的檢測(cè)

表4 不同種類防霉劑處理對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量的影響

由表5可知，與對(duì)照相比，添加了防霉劑生產(chǎn)的白僵菌分生孢子萌發(fā)時(shí)并未見異常，培養(yǎng)28 h后孢子萌發(fā)率均達(dá)100%。這進(jìn)一步證明，防霉劑對(duì)白僵菌沒有產(chǎn)生不良影響，不會(huì)妨礙其病蟲害防治效果。

表5 培養(yǎng)基中加入防霉劑生產(chǎn)的白僵菌孢子萌發(fā)率的比較

3 小結(jié)與討論

通過對(duì)防霉劑一系列的試驗(yàn)研究，結(jié)果表明，40%克菌靈等5種防霉劑直接作用時(shí)，對(duì)白僵菌ABUV-3和DBUV-7的孢子萌發(fā)都將產(chǎn)生不同程度的抑制作用，但種類及作用濃度不同時(shí)抑制作用表現(xiàn)出一定差異，由高到低依次為70%菌絕殺＞綠霉霸粉劑＞40%克霉靈可濕性粉劑＞40%克霉凈粉劑＞草酸，其對(duì)白僵菌分生孢子的抑制劑量分別為1.75、2.5、4.0、4.0和5.0 mg/mL。

5種防霉劑對(duì)毛霉菌、木霉菌、根霉菌、綠霉菌和黃曲霉菌的孢子和菌體均有抑制作用。其中，以70%菌絕殺可溶性和綠霉霸粉劑的抑制效果最好，不僅可抑制霉菌孢子萌發(fā)，而且可使菌絲體自溶變色。這可能是因?yàn)槊咕辗烂箘┧幬锖?，?xì)胞質(zhì)發(fā)生了變化，破壞了酶活性，導(dǎo)致蛋白變性所引起的，其詳細(xì)作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

將防霉劑添加到白僵菌固體培養(yǎng)基中進(jìn)行白僵菌孢子生產(chǎn)，在稀釋濃度為300倍時(shí)，其孢子產(chǎn)量與空白對(duì)照沒有明顯差異，且孢子萌發(fā)率不受影響。

綜上所述，建議在白僵菌生產(chǎn)過程中，可在固體培養(yǎng)基中添加70%菌決殺和綠霉霸粉劑500倍液（折合劑量為2 mg/mL），用以抑制霉菌的污染。

參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯：成 平）

Application Research on Mould Inhibitors Production of Beauveria bassiana

MIAO Dong，SHU Yan，WU Li-yang，ZHOU Ying-hua，WANG Sheng-ping，GAO Shu-fen，ZHOU Xiao-ling，ZENG Fa-jiao
（Hunan Institute of Microbiolgy， Changsha 410009， PRC）

Abstract：In order to solve the problem of Beauveria bassiana vulnerable to mould contamination in solid culture， the corn borer Beauveria bassiana ABUV-3 and the pine caterpillars Beauveria bassiana DBUV-7 as for the tested strains， a series of studies of 40% Kejunling and other five kinds of mould inhibitors were conducted. The results showed that the five kinds of mould inhibitors on spores and bacteria of Mucor， Trichoderma， Rhizopus， green mould and Aspergillus flavus all have inhibitory effect， in which the inhibitory effects， the 70% of soluble Junjuesha and Lvmeiba powder was the best； although the direct action of the 5 mould inhibitors will bring inhibited effect on the spore germination of Beauveria bassiana， there was no inhibitory effect on spore production and germination by adding a certain amount of mould inhibitor when producing spore in solid culture. Therefore， it is suggested that in the process of production of Beauveria bassiana， in solid culture medium added with 500 times liquid of 70% Junjuesha and Lvmeiba powder （equivalent dose for 2 mg / mL） to inhibit mould contamination.

Key words：Beauveria bassiana； mould inhibitors； spore germination； mould contamination

中圖分類號(hào)：S476.15

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-060X（2016）05-0008-04

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.05.003

收稿日期：2016-02-29

基金項(xiàng)目：湖南省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（2011NK2013）；湖南省科技成果重點(diǎn)推廣項(xiàng)目（2011CK2006）

作者簡介：繆 東（1974-），男，湖南長沙市人，助理研究員，主要從事動(dòng)物營養(yǎng)及飼料研究。