張志強(qiáng)， 夏　笠， 熊小文， 李　日韋， 李　鵬， 許建華

福建醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，福州　350108

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靈芝三萜組分增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)HER2+乳腺癌細(xì)胞凋亡的研究

張志強(qiáng)， 夏笠， 熊小文， 李日韋， 李鵬， 許建華

福建醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，福州350108

摘要:目的探討靈芝三萜組分(GLE)增強(qiáng)紫杉醇(PTX)誘導(dǎo)人表皮生長因子受體2陽性(HER2+)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制。方法磺酰羅丹明B(SRB)法和臺盼藍(lán)染色計數(shù)法檢測細(xì)胞增殖活性。CompuSyn軟件分析藥物相互作用。免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)。采用人乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型研究體內(nèi)抗腫瘤作用。結(jié)果體外實驗表明，GLE與PTX協(xié)同抑制SKBR-3細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和阻斷HER2信號通路的傳導(dǎo)。體內(nèi)動物實驗表明，GLE增強(qiáng)PTX抗HER2+乳腺癌的作用。結(jié)論GLE與PTX在體內(nèi)外對HER2+乳腺癌SKBR-3細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用。

關(guān)鍵詞:靈芝； 三萜類； 紫杉酚； 乳腺腫瘤； 細(xì)胞凋亡； 協(xié)同

紫杉醇(paclitaxel，PTX)是獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療卵巢癌、乳腺癌和肺癌等多種腫瘤的有效藥物，其作用機(jī)制是通過誘導(dǎo)和促進(jìn)微管蛋白聚合，抑制細(xì)胞分裂和紡錘體的形成，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[1-2]。人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)屬于酪氨酸激酶受體的ErbB家族的一個成員，在人乳腺癌中約有20%～30%存在過表達(dá)[1-3]。PTX是治療晚期乳腺癌的一線化療方案的重要組成成分之一，但是PTX具有嚴(yán)重的副作用，如免疫抑制、神經(jīng)毒性等。目前主要采用結(jié)構(gòu)修飾、改進(jìn)劑型、聯(lián)合用藥等途徑提高PTX療效，降低不良反應(yīng)[3]。靈芝三萜組分(ganoderma lucidum extract, GLE)具有抗腫瘤活性[4]，本文研究GLE增強(qiáng)PTX誘導(dǎo)HER2+乳腺癌細(xì)胞SKBR-3凋亡的作用和機(jī)制，為GLE應(yīng)用于乳腺癌的輔助治療提供一些實驗和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物健康BALB/c裸鼠(18±2)g，SPF級[上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號:SCXK(滬)2012-0002]。

1.1.2材料GLE由福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院李鵬副教授提取并純化?；酋Ａ_丹明B (sulforhodamine B，SRB，批號230162，美國Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO，批號1108223，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(批號1247076，美國Gibco公司)；胎牛血清(批號140506，杭州四季青生物工程材料有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中。細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.2細(xì)胞增殖活性的測定

1.2.2.1SRB法參照文獻(xiàn)[5]，實驗設(shè)對照組及不同濃度加藥組，每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，計算半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)。

1.2.2.2臺盼蘭染色計數(shù)法將細(xì)胞用藥物處理后制成細(xì)胞懸液，與0.4%臺盼藍(lán)溶液以9∶1混合均勻，并在顯微鏡下計數(shù)活細(xì)胞和死亡細(xì)胞。

1.2.3細(xì)胞凋亡的檢測收集藥物處理后的SKBR-3細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌2次后，用含有5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI的Binding Buffer避光孵育15 min，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡百分率。

1.2.4免疫印跡分析提取藥物處理后的細(xì)胞總蛋白并定量。將等量的蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜，加入封閉液室溫封閉1 h后，與一抗孵育4 ℃過夜。隨后用洗滌緩沖液洗滌3次，與二抗室溫孵育2 h，再用洗滌緩沖液洗滌3次后，加入化學(xué)發(fā)光劑顯影、拍照。

1.2.5體內(nèi)抑瘤實驗取對數(shù)生長期的SKBR-3細(xì)胞，按照每只裸鼠接種2×107個細(xì)胞/0.2 mL生理鹽水于右前肢皮下。待瘤體積長至2 000 mm3左右時，再將瘤塊切成體積大致相等的小瘤塊接種至24只裸鼠右前肢皮下。待瘤體積長至35 mm3左右時，將裸鼠按瘤體積大小隨機(jī)分成4組，每組6只，分別為：(1)對照組；(2)PTX給藥組(5 mg/kg，靜脈注射，q3d×5)；(3)GLE給藥組(250 mg/kg，口服，qd×14)；(4)聯(lián)合給藥組(GLE+PTX)。每3天用游標(biāo)卡尺測量裸鼠瘤塊最長徑L(mm)和最短徑W(mm)，并記錄裸鼠體質(zhì)量，計算公式如下：

瘤體積(mm3)=0.5×L×W2

抑瘤率(%)=[對照組瘤質(zhì)量(g)-給藥組瘤質(zhì)量(g)]×100%/對照組瘤質(zhì)量(g)

2結(jié)果

2.1GLE和PTX抑制SKBR-3細(xì)胞的增殖GLE作用24，48和72 h后的IC50分別為(38.96±4.10)，(23.95±3.50)和(17.13±3.09)μg/mL，呈現(xiàn)明顯的時間和濃度依賴性(圖1)。PTX作用24，48和72 h后的IC50分別為(2.76±0.28)，(1.86±0.32)和(1.45±0.02) ng/mL(圖1)。根據(jù)其作用24 h后對細(xì)胞增殖抑制的IC50，分別將25 μg/mL和2.0 ng/mL作為研究GLE 和PTX是否具有協(xié)同抑制SKBR-3細(xì)胞增殖作用的濃度。

2.2PTX與GLE協(xié)同抑制SKBR-3細(xì)胞的增殖臺盼藍(lán)拒染法結(jié)果表明，作用24 h后GLE(25 μg/mL)和PTX(2 ng/mL)對SKBR-3細(xì)胞的增殖抑制率分別為3.17%和15.8%，兩者聯(lián)合用藥后則可提高至31.68%(圖2)。

為進(jìn)一步研究協(xié)同效果，分別將GLE和PTX的濃度降至原來的一半，再通過協(xié)同分析軟件CompuSyn分別研究固定濃度比例(12 500∶1)的GLE和PTX聯(lián)合作用SKBR-3細(xì)胞24，48和72 h后的協(xié)同效果。結(jié)果表明，GLE和PTX在24，48和72 h的聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)分別為(0.847±0.222)，(0.827±0.042)和(0.601±0.118)。

2.3GLE和PTX協(xié)同誘導(dǎo)SKBR-3細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，作用SKBR-3細(xì)胞24 h后，GLE(25 μg/mL)和PTX(2 ng/mL)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡率分別為10.5%和15.6%，兩者聯(lián)合作用后為28.3%，而對照組為6%(圖3)。

2.4GLE和PTX協(xié)同增強(qiáng)對HER2和凋亡相關(guān)信號通路的影響免疫印跡結(jié)果顯示，作用SKBR-3細(xì)胞24 h后，GLE(25 μg/mL)對HER2和凋亡相關(guān)信號通路的影響較小，PTX(2 ng/mL)則對這些信號通路有一定的影響，但是兩者聯(lián)合作用后能夠顯著抑制細(xì)胞HER2信號通路的活化和激活線粒體凋亡途徑(圖4)。

2.5GLE增強(qiáng)PTX體內(nèi)抗SKBR-3乳腺癌的作用SKBR-3細(xì)胞裸鼠移植瘤實驗結(jié)果表明，治療結(jié)束后，與對照組比較，PTX(5 mg/kg，q3d×5，靜脈注射)和GLE(250 mg/kg，qd×14，口服)單獨給藥組的抑瘤率分別為28.5%和19.4%，而聯(lián)合用藥組的抑瘤率則提高至48.4%，顯示很好的協(xié)同抗HER2+乳腺癌的效果(圖5)。

3討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，對女性身心健康有嚴(yán)重影響甚至威脅生命[6]。研究表明，HER2的過表達(dá)與這些細(xì)胞的惡性特征相關(guān)，包括侵襲、轉(zhuǎn)移能力和對化療藥物的抗性等。HER2基因擴(kuò)增可以作為乳腺癌預(yù)后差的一個獨立評估因子，不論淋巴結(jié)是否陽性，HER2陽性的乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險遠(yuǎn)高于其他人群[7]。HER2通過形成同源或者和家族中其他成員形成異源二聚體，導(dǎo)致其胞內(nèi)尾部的酪氨酸殘基磷酸化而被激活，進(jìn)而激活PI3K-AKT、MAPK等多條信號通路，刺激乳腺癌細(xì)胞增殖。PTX是臨床上治療乳腺癌的一線化療藥物，但是腫瘤細(xì)胞對PTX容易產(chǎn)生耐藥性，這是導(dǎo)致臨床上化療失敗的重要原因之一[8]。此外，研究表明HER2的過表達(dá)還會降低PTX的藥物敏感性[9]。為了提高PTX等化療藥物的臨床療效，亟需研發(fā)更為有效的治療策略。研究表明，通過針對腫瘤發(fā)生發(fā)展不同階段的多個靶點而使用作用機(jī)制不同的藥物進(jìn)行聯(lián)合治療癌癥的策略顯示出明顯的優(yōu)越性[10-11]。從中草藥中尋找低毒、高效的抗腫瘤活性成分成為當(dāng)今抗腫瘤藥物發(fā)展戰(zhàn)略的重點之一[12]。

靈芝為多孔菌科(polyproraceae)靈芝屬(Ganoderma)真菌植物赤芝(Ganodermalucidum)的干燥子實體[13]。靈芝性溫、味甘，多分布于閩、云、貴、冀、吉、蘇、浙等省，在我國已經(jīng)有悠久的藥用歷史，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)中益氣、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本之功效，是一種珍貴的中藥材。靈芝能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，對人體的毒副作用小，是傳統(tǒng)的抗腫瘤和輔助藥物。

前期研究顯示，GLE是靈芝抗腫瘤的活性部位[4]。本研究通過SRB法檢測細(xì)胞增殖活性的結(jié)果表明，GLE可以明顯增強(qiáng)PTX抑制SKBR-3細(xì)胞增殖的作用，并具有時間和劑量依賴性。分析結(jié)果顯示，PTX與SKBR-3聯(lián)合用藥具有協(xié)同效果。通過臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)結(jié)果也顯示，GLE和PTX聯(lián)合用藥比單獨用藥抑制細(xì)胞增殖的效果好。細(xì)胞凋亡是機(jī)體在生長、發(fā)育和受到外來刺激時清除多余、衰老和受損傷的細(xì)胞以保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡和維持正常生理活動過程的一種自我調(diào)節(jié)機(jī)制，它涉及到一系列信號級聯(lián)反應(yīng)。免疫印跡和流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，GLE可通過增強(qiáng)PTX抑制HER2信號通路的活化和激活線粒體凋亡途徑來誘導(dǎo)SKBR-3細(xì)胞凋亡。SKBR-3荷瘤裸鼠實驗結(jié)果表明，GLE可以明顯增強(qiáng)PTX體內(nèi)抗HER2+乳腺癌的作用。尤其值得注意的是，GLE和PTX聯(lián)合用藥并沒有顯示出明顯的毒性。因此，本研究結(jié)果表明，GLE在體內(nèi)外可以增強(qiáng)PTX抗HER2+乳腺癌的活性，其機(jī)制與抑制HER2+信號通路和激活線粒體凋亡途徑有關(guān)，提示GLE與PTX聯(lián)合用藥對HER2+乳腺癌可能是一種安全有效的治療方案，為GLE應(yīng)用于抗HER2+乳腺癌治療提供了實驗和理論依據(jù)。

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(編輯:張慧茹)

Enhancement of Paclitaxel Induced Apoptosis in HER2+Breast Cancer Cells by the Triterpene Component of Ganoderma Lucidum

ZHANG Zhiqiang, XIA Li, XIONG Xiaowen, LI WEI, LI Peng, XU Jianhua

School of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350108

ABSTRACT:ObjectiveTo study the enhancement effect of paclitaxel (PTX) induced apoptosis in HER2+ breast cancer cells by the triterpene component of Ganoderma lucidum (GLE) and its mechanism.MethodsCell proliferation was analyzed by SRB and trypan blue exclusion staining method.The expression of proteins was detected by Western blot.Antitumor activity in vivo was studied in SKBR-3 xenograft model.ResultsIn vitro, GLE and PTX had synergistic effect on the proliferation and induced apoptosis in SKBR-3 cells, and on the upregulation of proteins related to cell apoptosis and blocking transduction of HER2 signaling pathway.In vivo, GLE enhanced antitumor activity of PTX against HER2+ breast cancer.ConclusionGLE and PTX have synergistic antitumor effect against the HER2+ breast cancer cells SKBR-3 both in vitro and in vivo.

KEY WORDS:Ganoderma lucidum； triterpenes； paclitaxel； breast neoplasms； apoptosis； coordinative theory

收稿日期:2015-10-08

基金項目:福建省自然科學(xué)基金(2015J01678)；福建省自然科學(xué)基金青年項目(2010J05068)；福建省高校杰出青年科研人才培育計劃(JA13133)；福建省中青年教師教育科研基金資助項目(JA13151)；華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室開放基金(HN2015-05)

作者簡介:張志強(qiáng)(1975-)，男，助理研究員，醫(yī)學(xué)博士通訊作者: 許建華.Email:xjh@fjmu.edu.cn

中圖分類號:R282.71； R737.9； R916.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-4194(2016)01-0001-05