楊雪峰，韓慶功，鄭愛武，柳東陽，李珊珊,袁香麗，胡　萌，杜家洋，丁丹霞

(1 河南科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2 新鄉(xiāng)市畜牧技術(shù)推廣站，河南 新鄉(xiāng) 453000)

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甲酚納米乳消毒劑的質(zhì)量評價(jià)及消毒功效研究

楊雪峰1，韓慶功1，鄭愛武2，柳東陽1，李珊珊1,袁香麗1，胡萌1，杜家洋1，丁丹霞1

(1 河南科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2 新鄉(xiāng)市畜牧技術(shù)推廣站，河南 新鄉(xiāng) 453000)

[摘要]【目的】 對甲酚納米乳消毒劑進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)和消毒功效研究。【方法】 分別利用肉眼觀察和離心法檢測甲酚納米乳消毒劑的外觀性狀和物理穩(wěn)定性，染色法和稀釋法鑒別其結(jié)構(gòu)類型，透射電鏡觀察其微觀形態(tài)，激光粒度分析儀測定其粒徑大小，加速試驗(yàn)考察其穩(wěn)定性，最后通過載體定量殺菌試驗(yàn)和物體表面現(xiàn)場消毒試驗(yàn)研究甲酚納米乳消毒劑的消毒功效。【結(jié)果】 甲酚納米乳消毒劑外觀澄明、均一，離心不分層，為水包油型納米乳，乳滴呈規(guī)則的球形，平均粒徑為(34.89±3.56) nm，粒徑呈正態(tài)分布；在37 ℃貯存90 d，主藥甲酚的平均含量下降了9.62%，穩(wěn)定性良好。體積分?jǐn)?shù)0.5%和1.0%的甲酚納米乳消毒劑分別作用3和1 min以上時(shí)，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的平均殺滅率均大于99.90%；體積分?jǐn)?shù)1%和高于3%的甲酚納米乳消毒劑分別作用5和3 min以上時(shí)，對自然菌的殺滅率均大于90%；甲酚納米乳消毒劑的消毒效果與來蘇兒無顯著差異(P>0.05)?！窘Y(jié)論】 甲酚納米乳消毒劑水溶性好，刺激性氣味小，穩(wěn)定性好，消毒功效強(qiáng)，值得在臨床中推廣應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞]甲酚；納米乳；消毒劑；中和劑

甲酚是傳統(tǒng)酚類消毒劑來蘇兒(即甲酚皂溶液[1])的主要功效成分，具有水溶性低和特殊刺激性氣味等缺點(diǎn)。來蘇兒由于生產(chǎn)工藝較復(fù)雜，且刺激性氣味較重等原因，其臨床應(yīng)用受到限制。因此，生產(chǎn)中迫切需要尋求解決甲酚水溶性差和刺激性氣味重的辦法。

納米乳是近年來研究較多的一種藥物載體，具有其他藥物載體所不可比擬的優(yōu)點(diǎn)：① 屬于熱力學(xué)穩(wěn)定體系，穩(wěn)定性好，易于制備和保存；② 可提高難溶性藥物的溶解度[2]；③ 藥物被包封于納米級的小滴內(nèi)，避免了與外界因素如空氣、光等接觸，納米乳載體能保護(hù)藥物，避免藥物被氧化或水解，能提高藥物穩(wěn)定性[3]，同時(shí)具有緩釋的性能[4]；④ 能提高藥物的生物利用度[5-6]；⑤ 粒徑小且均勻，可提高包封于其中的藥物的分散度，還可促進(jìn)藥物的透皮吸收[7]；⑥ 能掩蓋一些藥物的不良?xì)馕禰3]。因此，納米乳被認(rèn)為是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ睦硐胨幬镙d體，納米乳制劑也成為近年來研究的熱點(diǎn)。本課題組以納米乳為藥物載體，以甲酚為模型藥物，研制出一種甲酚納米乳消毒劑，并就其制備方法申請了國家發(fā)明專利[8]。本研究進(jìn)一步對甲酚納米乳消毒劑的質(zhì)量及消毒功效進(jìn)行考察，以期為甲酚納米乳消毒劑的臨床應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)菌株大腸桿菌8099和金黃色葡萄球菌ATCC 6538，由河南科技學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2主要試劑甲酚(分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，營養(yǎng)瓊脂(青島市高科園海博生物技術(shù)有限公司)，MHB培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)，吐溫-80(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司)，蘇丹紅Ⅲ(上海試劑三廠)，亞甲基藍(lán)(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，牛血清白蛋白(鹽城賽寶生物科技有限公司)。

甲酚納米乳消毒劑，本課題組前期制備[8]。來蘇兒，參照文獻(xiàn)[9]制備。

30 mg/mL吐溫-80 PBS液：精密稱取3 g吐溫-80于容量瓶中，加入PBS定容至100 mL，高壓滅菌。同法配制5 mg/mL硫代硫酸鈉PBS液、10 mg/mL吐溫-80+10 mg/mL卵磷脂+5 mg/mL硫代硫酸鈉PBS液。

1.1.3主要儀器DU 800 UV/ Vis Spectrophotometer 紫外/可見分光光度計(jì)(美國beckman coulter公司)；日立H27500透射電鏡(日本日立公司)；Zetasizer Nano ZS型激光粒度分析儀(英國Malvern Instrument公司)；SHP-250型生化培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)。

1.2甲酚納米乳消毒劑的質(zhì)量評價(jià)

1.2.1外觀性狀的鑒別用肉眼觀察甲酚納米乳消毒劑的外觀性狀，并參照文獻(xiàn)[10]，將其離心(15 000 r/min)15 min，觀察是否出現(xiàn)分層，不分層則說明納米乳物理穩(wěn)定性好。

1.2.2結(jié)構(gòu)類型的鑒定① 染色法。參照文獻(xiàn)[11]，利用油溶性染料蘇丹紅Ⅲ(紅色)和水溶性染料亞甲基藍(lán)(藍(lán)色)在納米乳中擴(kuò)散的快慢來判斷納米乳類型。若紅色擴(kuò)散快于藍(lán)色，則為油包水(W/O)型納米乳，反之則為水包油(O/W)型。② 稀釋法[3]。取適量甲酚納米乳消毒劑置于潔凈燒杯中，不停加入蒸餾水稀釋，觀察消毒劑被稀釋的情況。若消毒劑能與蒸餾水混合均勻，并能被蒸餾水無限稀釋，則判定其為O/W型，反之則為W/O型。

1.2.3微觀形態(tài)的觀察和粒徑大小的分布情況用透射電鏡觀察甲酚納米乳消毒劑的微觀形態(tài)。取10倍稀釋的甲酚納米乳消毒劑1滴，滴加在覆有碳膜的銅網(wǎng)上，自然晾干后，用20 mg/mL磷鎢酸溶液(pH 7.4)滴在銅網(wǎng)上負(fù)染15 min，自然揮干后在透射電鏡下觀察納米乳的微觀形態(tài)。另取10倍稀釋的甲酚納米乳消毒劑適量，利用激光粒度分析儀測定其平均粒徑。

1.2.4穩(wěn)定性的考察利用加速試驗(yàn)方法考察甲酚納米乳消毒劑的化學(xué)穩(wěn)定性。取密封好的甲酚納米乳消毒劑，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)貯存 90 d，貯存前、后分別利用已建立的紫外分光光度法測定其有效成分甲酚的含量。每次檢測3批樣品，每批樣品重復(fù)測3次，結(jié)果取其平均值。依據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》(2008版)，確定其在常溫下的存貯時(shí)間。

1.3甲酚納米乳消毒劑的消毒效果評價(jià)

依據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》(2008版)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.1中和劑篩選試驗(yàn)以大腸桿菌8099為試驗(yàn)菌，將其第3代菌懸液用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，并與牛血清白蛋白按體積比1∶1混勻，稀釋成 (2.5×103)～(1.5×104) CFU/mL的菌懸液，備用。

以30 mg/mL吐溫-80 PBS、5 mg/mL硫代硫酸鈉PBS、10 mg/mL吐溫-80+10 mg/mL卵磷脂+5 mg/mL硫代硫酸鈉PBS為供篩中和劑，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，按中和劑懸液定量鑒定試驗(yàn)操作程序[12]進(jìn)行試驗(yàn)，甲酚納米乳消毒劑體積分?jǐn)?shù)為3%，中和作用時(shí)間為5 min。滿足以下條件則判定所選中和劑及其濃度適宜：第1組不長菌或僅有極少數(shù)菌落生長；第2組有菌落生長，較第1組多，但較第3、4、5組少；第3、4、5組菌落數(shù)相近，且誤差率不超過15%；第6、7、8組無細(xì)菌生長。第3、4、5組的組間菌落數(shù)誤差率=[(3組間菌落平均數(shù)-各組菌落平均數(shù))的絕對值之和÷3組菌落平均數(shù)之和]×100%。

表 1　甲酚納米乳消毒劑中和劑篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2載體定量殺菌試驗(yàn)在無菌棉布片(1.0 cm×1.0 cm)上分別逐片滴加3×108CFU/mL的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌懸液10 μL，干燥后即制成載體菌片。取載體菌片，分別浸入5 mL甲酚納米乳消毒劑和來蘇兒(體積分?jǐn)?shù)分別為0.2%，0.5%，1.0%)中，以磷酸鹽緩沖液作為陽性對照組，作用至預(yù)定時(shí)間(1，3，5 min)，取出載體菌片，放入裝有5 mL 30 mg/mL吐溫-80 PBS液中和劑的試管中，作用10 min后，敲打振蕩試管80次，以充分洗脫菌片上的殘存菌并混勻。然后取洗脫液原液及其不同稀釋度(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5)的稀釋液500 μL，用平板傾注法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。不同濃度的甲酚納米乳消毒劑和來蘇兒分別重復(fù)3次，計(jì)算平均殺菌率。

1.3.3物體表面現(xiàn)場消毒試驗(yàn)選擇木質(zhì)油漆桌面為代表，用5.0 cm×5.0 cm 無菌不銹鋼規(guī)格板限定采樣區(qū)域。消毒前先用無菌棉拭沾濕稀釋液進(jìn)行涂抹法采樣，作為消毒前的陽性對照組，并將中和劑、稀釋液進(jìn)行接種培養(yǎng)，作為陰性對照組。然后分別用無菌棉拭蘸取不同體積分?jǐn)?shù)(分別為1%，3%，5%)的甲酚納米乳消毒劑和來蘇兒，對桌面進(jìn)行涂擦消毒。消毒作用至預(yù)定時(shí)間(3，5，10 min)時(shí)，用無菌棉拭沾濕30 mg/mL吐溫-80 PBS中和劑，以同樣方法進(jìn)行涂抹采樣，作為試驗(yàn)組。最后將采樣棉拭頭置入裝有5 mL稀釋液的試管中，充分振蕩洗脫。取洗脫液進(jìn)行活菌培養(yǎng)，計(jì)數(shù)培養(yǎng)后的自然菌總數(shù)，計(jì)算自然菌的滅除率。

2結(jié)果與分析

2.1甲酚納米乳消毒劑的質(zhì)量評價(jià)

2.1.1外觀性狀的鑒別甲酚納米乳消毒劑外觀呈深黃色，澄清，透明，均一，在燒杯中晃動(dòng)無掛壁現(xiàn)象，流動(dòng)性良好；離心后未見分層，仍均勻、澄清，表明該納米乳消毒劑的物理穩(wěn)定性好。

2.1.2結(jié)構(gòu)類型的鑒定在甲酚納米乳消毒液中，亞甲基藍(lán)的擴(kuò)散速度大于蘇丹紅Ⅲ，且該納米乳能被蒸餾水無限稀釋，說明制備的納米乳為O/W型。

2.1.3微觀形態(tài)和粒徑大小分布透射電鏡下觀察，甲酚納米乳消毒劑的乳滴呈規(guī)則的球形，分布均勻，無粘連(圖1)。粒度分析結(jié)果(圖2)表明，甲酚納米乳消毒劑的乳滴平均粒徑為(34.89±3.56) nm，粒徑分布呈正態(tài)分布。

圖 1　甲酚納米乳消毒劑的透射電鏡照片(×50 000倍)

2.1.4穩(wěn)定性考察結(jié)果甲酚納米乳消毒劑在 37 ℃放置 90 d，放置前的甲酚平均含量138.42 mg/mL，放置后的甲酚平均含量為125.10 mg/mL，下降了9.62%。說明甲酚納米乳消毒劑的性能穩(wěn)定，可在常溫下至少貯存2年。

2.2甲酚納米乳消毒劑的消毒效果

2.2.1中和劑的篩選由表2可知，只有30 mg/mL吐溫-80 PBS作為中和劑時(shí)的組間菌落數(shù)誤差率小于15%，表明30 mg/mL吐溫-80 PBS能有效中和甲酚納米乳消毒劑對試驗(yàn)菌的殘余作用，中和劑及其中和產(chǎn)物對試驗(yàn)菌及培養(yǎng)基無不良影響。據(jù)此確定，30 mg/mL吐溫-80 PBS為甲酚納米乳消毒劑的適宜中和劑。

表 2　甲酚納米乳消毒劑對大腸桿菌的中和劑篩選試驗(yàn)結(jié)果

注：Ⅰ.30 mg/mL吐溫-80的PBS;Ⅱ.5 mg/mL硫代硫酸鈉PBS;Ⅲ. 10 mg/mL吐溫-80+10 mg/mL卵磷脂+5 mg/mL硫代硫酸鈉PBS。

Note：Ⅰ.PBS contains 30 mg/mL Tween-80;Ⅱ.PBS contains 5 mg/mL sodium thiosulfate;Ⅲ.PBS contains 10 mg/mL Tween-80 and 10 mg/mL Lecithin and 5 mg/mL sodium thiosulfate.

2.2.2載體定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果由表3可知，隨著甲酚納米乳消毒劑體積分?jǐn)?shù)的增加和作用時(shí)間的延長，其消毒效果增強(qiáng)；體積分?jǐn)?shù)0.5%和1.0%甲酚納米乳消毒劑分別作用3和1 min以上，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的平均殺滅率均大于99.90%，與來蘇兒的消毒效果無顯著差異(P>0.05)。

表 3　甲酚納米乳消毒劑的載體定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3物體表面現(xiàn)場消毒試驗(yàn)結(jié)果由表4可知，隨著甲酚納米乳消毒劑體積分?jǐn)?shù)的增加和作用時(shí)間的延長，其消毒效果逐漸增強(qiáng)；體積分?jǐn)?shù)1%和高于3%的甲酚納米乳消毒劑分別作用5和3 min以上，其對自然菌的殺滅率均大于90%，與來蘇兒的消毒效果無顯著差異(P>0.05)。

表 4　甲酚納米乳消毒劑的物體表面現(xiàn)場消毒試驗(yàn)結(jié)果

3討論與結(jié)論

3.1甲酚納米乳消毒劑的質(zhì)量評價(jià)

質(zhì)量評價(jià)不但是新藥研制時(shí)的最基本要求，也是藥效學(xué)研究的基礎(chǔ)。納米乳的質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[13]，通常主要有外觀性狀、劑型鑒別、結(jié)構(gòu)類型、微觀形態(tài)、粒徑大小和穩(wěn)定性等。納米乳的外觀通常呈透明或半透明狀，高速離心后不分層，仍維持透明或半透明狀；結(jié)構(gòu)類型主要有水包油(O/W)型、油包水(W/O)型和雙連續(xù)型，通常采用稀釋法[3]和染色法[11]等進(jìn)行鑒別；微觀形態(tài)通常為圓球形，粒徑一般在10～100 nm，分布均勻；穩(wěn)定性考察指標(biāo)通常包括粒徑、外觀、澄清度及主藥的含量等。本試驗(yàn)對甲酚納米乳消毒劑的質(zhì)量評價(jià)結(jié)果表明，甲酚納米乳消毒劑外觀澄明、均一，離心不分層，為O/W型，乳滴呈規(guī)則的球形，平均粒徑為(34.89±3.56) nm，粒徑呈正態(tài)分布；在37 ℃貯存90 d，主藥甲酚的平均含量下降了9.62%，穩(wěn)定性良好。依據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》(2008版)，甲酚納米乳消毒劑在常溫下至少可存貯2年。

3.2甲酚納米乳消毒劑的消毒效果評價(jià)

目前，納米技術(shù)與納米材料已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，但在消毒領(lǐng)域的應(yīng)用尚鮮見報(bào)道[14]。魏坤等[15]對復(fù)方納米銀抗菌乳液消毒效果的研究結(jié)果表明，用該消毒液原液作用1 min，對棉布載體上金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和大腸桿菌的平均殺滅率均達(dá)到99.9%以上；對傷寒沙門菌作用2 min，平均殺滅率亦達(dá)到99.9%以上；用該消毒液原液擦拭消毒并作用2 min，對手上自然菌平均殺滅率達(dá)到97%以上，說明該納米銀復(fù)方消毒液具有良好的殺菌效果。魏秋華等[14]以醋酸氯已定和納米氧化物為主要抗菌成分，經(jīng)納米乳化技術(shù)工藝制備出一種皮膚消毒納米乳液，該消毒納米乳液具有良好的殺菌效果，原液對布片上金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作用3 min，對白色念珠菌作用5 min，平均殺滅率均達(dá)99.90%以上；且在降低醋酸氯己定含量的條件下，其殺菌效果仍明顯優(yōu)于文獻(xiàn)[16]報(bào)道的含氯己定消毒劑。本試驗(yàn)利用載體定量殺菌試驗(yàn)和物體表面現(xiàn)場消毒試驗(yàn)，研究了甲酚納米乳消毒劑的消毒功效，結(jié)果表明，體積分?jǐn)?shù)0.5%和1.0%的甲酚納米乳消毒劑分別作用3和1 min以上時(shí)，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的平均殺滅率均大于99.90%；體積分?jǐn)?shù)1%和高于3%的甲酚納米乳消毒劑分別作用5和3 min以上時(shí)，對自然菌的殺滅率均大于90%；甲酚納米乳消毒劑的消毒效果與來蘇兒無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果提示，甲酚納米乳消毒劑的消毒功效較強(qiáng)，與來蘇兒的消毒效果相當(dāng)。但與來蘇兒相比，甲酚納米乳消毒劑水溶性好，刺激性氣味小，穩(wěn)定性好的優(yōu)勢，值得在臨床中推廣應(yīng)用。

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Quality evaluation and disinfection efficacy of cresol nanoemulsion disinfectant

YANG Xue-feng1,HAN Qing-gong1,ZHENG Ai-wu2,LIU Dong-yang1,LI Shan-shan1,YUAN Xiang-li1,HU Meng1,DU Jia-yang1,DING Dan-xia1

(1CollegeofAnimalScience,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang,Henan453003,China;2XinxiangHusbandryTechniquePopularizationStation,Xinxiang,Henan453000,China)

Abstract:【Objective】 The aim of this study was to evaluate the quality and disinfection efficacy of novel cresol nanoemulsion disinfectant.【Method】 The external properties,physical stability,structure type,micromorphology,particle size,and stability of cresol nanoemulsion disinfectant were determined by macroscopic observation,centrifuge method,staining/dilution method,transmission electron microscope,laser particle size analyzer,and acceleration test,respectively.The carrier quantify disinfect experiment and body surface disinfection test were also conducted to evaluate the disinfection efficacy of the disinfectant.【Result】 Cresol nanoemulsion disinfectant was clear,uniform,and not creamed after centrifugalization.The emulsion belonged to oil-in-water type and the droplet was regular sphere.The mean droplet size was (34.89±3.56) nm with normal distribution.The average content of cresol reduced by 9.62% after storing for 90 days at 37 ℃,indicating that it was stable.The average killing rates of cresol nanoemulsion disinfectants with concentrations of 0.5% and 1.0% (V/V) against E.coli and S.aureus were all higher than 99.90% for more than 3 and 1 min,respectively.The average killing rates against natural bacteria were all higher than 90% when disinfectants with concentrations of 1% and >3% (V/V) were used for over 5 and 3 min,respectively.The difference in disinfection effects of cresol nanoemulsion disinfectant and Lysol was not significant (P>0.05).【Conclusion】 Cresol nanoemulsion disinfectant had good solubility,small pungent taste,good stability and strong disinfection efficacy.Thus,it can be generalized and applied in clinic.

Key words:cresol;nanoemulsion;disinfectant;neutralizer

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-02-0209:3710.13207/j.cnki.jnwafu.2016.03.004

[收稿日期]2014-07-24

[基金項(xiàng)目]新鄉(xiāng)市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(13NY29)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201210467037)

[作者簡介]楊雪峰(1973-)，女，河南泌陽人，副教授，博士，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)研究。E-mail:yangxuefeng2003@126.com

[中圖分類號]S859.79+9.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)03-0023-05