尹明遠，何建清，張格杰

(西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000)

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藏北高寒草原耐堿放線菌的多樣性及其生物活性

尹明遠，何建清，張格杰

(西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000)

[摘要]【目的】 研究藏北高寒草原耐堿放線菌的多樣性、產(chǎn)酶潛力及拮抗活性，為開發(fā)利用相關(guān)資源提供參考。【方法】 從藏北高寒草原鹽堿地采集22份土樣，用平板稀釋法從中分離放線菌，進行初步的形態(tài)鑒定后得到有代表性的36株耐堿放線菌，對這些代表性菌株的16S rRNA基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，將這些菌株鑒定到屬；采用生長速率法測定分離菌株發(fā)酵液對1種細菌和4種農(nóng)作物真菌的抑菌活性，并對分離株菌進行纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶酶活初篩，分析其拮抗活性?！窘Y(jié)果】 從22份土樣中分離到有代表性的36株耐堿放線菌；16S rRNA基因序列分析表明，這36株菌分布于放線菌門放線菌綱5個亞目5個科的5個屬，即鏈霉菌屬(Streptomyces)、糖絲菌屬(Saccharothrix)、小單孢菌屬(Micromonospora)、原小單孢菌屬(Promicromonospora)和韓國生工菌屬(Kribbella)；分離菌株中25.0%具有纖維素酶活性，8.3%具有淀粉酶活性，16.6%具有蛋白酶活性。所得耐堿放線菌中33.3%的菌株有抑菌活性，其中有5株具有高拮抗活性(抑菌圈直徑≥20 mm)，分別是J10、J14、J21、J48和J65?！窘Y(jié)論】 藏北高寒草原鹽堿地生境蘊藏著豐富的耐堿放線菌資源，這些耐堿放線菌具有高酶和拮抗菌活性。

[關(guān)鍵詞]耐堿放線菌；16S rRNA；生物活性；藏北高寒草原

能在pH 9以上的環(huán)境生長，且在pH 10～12的環(huán)境生長良好，但在pH 6.5左右的環(huán)境不能或僅能緩慢生長的放線菌，人們稱之為嗜堿放線菌[1-2]。嗜堿放線菌又可以分為專性嗜堿、兼性嗜堿和耐堿放線菌，耐堿放線菌主要分布在一些天然的高堿環(huán)境，如鹽堿湖、鹽堿地以及人為的堿性環(huán)境[3]。耐堿放線菌可以產(chǎn)生多種堿性酶和生物活性物質(zhì)，如抗生素[4-5]和酶的抑制劑[6]。耐堿放線菌是極端環(huán)境中的一個特殊類群，由于其產(chǎn)物的特殊性和廣闊的應(yīng)用前景，引起了國際上許多微生物學(xué)者的廣泛關(guān)注。藏北高寒草原地處青藏高原腹地，藏北高原大陸性氣候特征極為明顯，年平均氣溫0～3 ℃，全年無絕對無霜期，年降水量100～300 mm，年蒸發(fā)量2 000 mm。在高寒和干旱的共同作用下，高寒草原成土過程微弱，土層淺薄，土壤結(jié)構(gòu)性差且有機質(zhì)和有效養(yǎng)分含量低[7]。近幾十年來，藏北高寒草原因人為和自然因素導(dǎo)致大面積退化，以草地鹽堿化、草地沙化為主的各種草地退化不斷加速[8]。隨著草地的鹽堿化，草地土壤的性質(zhì)已經(jīng)改變。這些因素決定了藏北高寒草原土壤形成發(fā)育有其獨特之處，在這種特殊的生境中蘊藏著極為豐富的放線菌資源，基于此，本試驗以藏北耐堿放線菌為研究對象，探索藏北高寒草原耐堿放線菌資源種類、分布、拮抗活性及其酶的應(yīng)用潛力，為開發(fā)利用我國耐堿放線菌資源提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品采集根據(jù)土質(zhì)以及植被覆蓋的差別，從藏北高寒草原采集22份鹽堿土樣，置于4 ℃冰箱保存，土樣詳細情況見表1。

表 1　藏北高寒草原土樣基本情況

1.1.2分離培養(yǎng)基分離培養(yǎng)基為改良纖維素酪素瓊脂(CCMS)、甘油天門冬酰胺瓊脂(ISP5)和淀粉酪素瓊脂3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基[3]。以上培養(yǎng)基于121 ℃滅菌30 min后，用10 mol/L NaOH將pH調(diào)至9～10.0，為抑制細菌和真菌生長，在分離培養(yǎng)基中均加入終質(zhì)量濃度為70 mg/L的重鉻酸鉀。

1.1.3主要試劑和儀器脫脂奶粉、酵母提取物、蛋白胨、淀粉、微晶纖維素等試劑均為國產(chǎn)分析純，DNA Polymerase、dNTPs、DNA Marker DL-2000、pMD18-T vector 購自TaKaRa公司，膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；PCR儀為東勝公司產(chǎn)品。

1.1.4病原菌菌株所用菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)、南瓜枯萎菌(Fusariumoxysporum)、粉紅聚端孢(Trichotheciumroseum)、小麥根腐菌(Bipolarissorokiniana)，均由西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院真菌實驗室保存并提供。

1.2樣品預(yù)處理與菌株分離

用無菌袋裝采集的土樣，28 ℃自然風干約7 d后稱取10 g，轉(zhuǎn)移至裝有90 mL無菌水的三角瓶里，置于28 ℃恒溫振蕩箱里120 r/min充分振蕩，獲得樣品懸浮液，將樣品懸浮液放入裝有自來水的燒杯中，120 W、2 450 Hz微波處理40 s，用移液槍取1 mL至裝有9 mL無菌水的試管中，稀釋至10-3，取0.2 mL涂布于裝有CCMS、ISP5和淀粉酪素瓊脂培養(yǎng)基的分離平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)14 d。收集菌落，根據(jù)菌落形態(tài)、大小、顏色進行初步分離篩選，比較3種培養(yǎng)基的分離效果，利用分離效果最好的培養(yǎng)基純化并保藏菌株。

1.3菌株生長條件

以H1為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，參照Li等[9]的方法，利用pH6.0～12.0緩沖液體系，檢測分離菌株的pH生長范圍及最適pH。所用的pH緩沖體系如下：pH6.0～8.0，0.1 mol/L KH2PO4+0.1 mol/L NaOH；pH 9.0～10.0，0.1 mol/L NaHCO3+0.1 mol/L Na2CO3；pH11.0，0.05 mol/L Na2HPO4+0.1 mol/L NaOH；pH12.0，0.2 mol/L KCl+0.2 mol/L NaOH，緩沖液的制備參照文獻[10]的方法。在培養(yǎng)基滅菌結(jié)束后，將培養(yǎng)基與無菌緩沖液混合，然后分裝到無菌玻璃試管中。接種試驗菌株，然后于28 ℃培養(yǎng)2周，觀察菌株的生長情況。

1.4耐堿放線菌16S rRNA鑒定

按照參考文獻[11]的方法提取菌株總DNA，利用細菌通用引物(PA(對應(yīng)E.coli的7-24)5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)，PB(對應(yīng)E.coli的1 540-1 522)5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)對16S rRNA序列進行PCR擴增，得到的PCR產(chǎn)物直接送到杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序，序列用ClustalX[12]軟件進行比對，然后用MEGA4[13]軟件Neighbour-Joining法[14]進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，用于檢驗支持率的重復(fù)抽樣次數(shù)為 1 000 次。

1.5測定指標及方法

1.5.1酶活淀粉酶水解、纖維素分解、蛋白酶活性測定均參照文獻[15]的方法進行。

1.5.2拮抗活性采用生長速率法測定供試放線菌發(fā)酵液的抑菌作用，選用的細菌為金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)，植物病原真菌為番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)、南瓜枯萎菌(Fusariumoxysporum)、粉紅聚端孢(Trichotheciumroseum)和小麥根腐菌(Bipolarissorokiniana)。用十字交叉法測量抑菌圈直徑(D)，按照30 mm>D≥20 mm、20 mm>D≥10 mm及10 mm>D定義菌株拮抗性強弱。

2結(jié)果與分析

2.1耐堿放線菌菌株的鑒定

本試驗從22份土樣中共分離得到89株放線菌，根據(jù)形態(tài)特征和培養(yǎng)特征去重復(fù)后獲得36株耐堿放線菌。對這36株代表性耐堿放線菌進行16S rRNA基因序列測定，序列保存在GenBank相應(yīng)數(shù)據(jù)庫中。用Blast搜索軟件從GenBank等數(shù)據(jù)庫進行相似度搜索，調(diào)出相似度最高的相關(guān)性菌株的16S rRNA基因序列，用ClustalX比對后用 MEGA4構(gòu)建系統(tǒng)進化樹 (圖1)，確定了36株耐堿放線菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。由圖1可知，藏北高寒草原鹽堿地生境的耐堿放線菌組成較簡單，供試的36株耐堿放線菌分布于放線菌門放線菌綱下5個亞目5個科5個屬，即鏈霉菌屬(Streptomyces)、糖絲菌屬(Saccharothrix)、小單孢菌屬(Micromonospora)、原小單孢菌屬(Promicromonospora)和韓國生工菌屬(Kribbella)。其中鏈霉菌屬為藏北草原優(yōu)勢放線菌，占分離菌的83.2%；小單孢菌屬、糖絲菌屬，分別占分離菌的5.5%，8.3%；原小單孢菌屬和韓國生工菌屬僅占分離菌的2.7%。

36株耐堿放線菌與其參比菌株的相似度見表 2。由表2可知，供試36株耐堿放線菌16S rRNA基因序列與參比菌株的相似度在98.0%～99.0%，以16S rRNA基因序列相似度≥98.0%作為同一個物種的標準[3，16]，根據(jù)圖1可以判斷，這36株放線菌中僅菌株J46與StreptomycesalbovinaceusHBUM 175136 (FJ532408.1)相似度為98.0%；其他菌株與其相似菌株的相似度均為99%；可以初步判定這36株菌在系統(tǒng)發(fā)育地位上屬于已知放線菌屬。Kasai等[17]研究發(fā)現(xiàn)，小單孢菌屬(Micromonospora)種之間16S rRNA基因序列相似度高達99.3%，而同樣2個種的DNA-DNA同源性依然小于70%，這表明小單孢菌屬(Micromonospora)種間16S rRNA基因序列相似度不高于99.3%的可能為新種，本試驗共分離到2株小單孢菌屬(Micromonospora)菌株，分別是J53、J93(表2)，且這2株菌株與該屬數(shù)據(jù)庫中最相近的代表種的16S rRNA序列相似度均小于99.3%，表明這2株放線菌可能是小單孢菌屬(Micromonospora)的潛在的新種。

Micromonospora.小單孢菌屬；Kribbella.韓國生工菌屬；Saccharothrix.糖絲菌屬；Promicromonospora.原小單孢菌屬；Streptomyces.鏈霉菌屬

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，36株菌株的pH生長范圍為7.0～11.0，最適pH為9.0～10.0，未分離到在pH8.0以下不生長的放線菌，可知所得36株菌株均為耐堿放線菌。

2.23種培養(yǎng)基對36株耐堿放線菌菌株的分離效果

由表3可見，用CCMS培養(yǎng)基共分離到7株耐堿放線菌，分布在4個屬；用ISP5培養(yǎng)基分離到6株菌，分布在1個屬；用淀粉酪素瓊脂培養(yǎng)基分離到23株菌，分布在3個屬?？梢娪玫矸劾宜丨傊囵B(yǎng)基分離得到的菌株數(shù)最多，且物種單一；CCMS培養(yǎng)基分離得到的菌株雖少，但物種較多，分離效果最好。

表 3　3種培養(yǎng)基對36株耐堿放線菌菌株的分離效果比較

2.3分離耐堿放線菌菌株的酶活及拮抗活性

對分離的36株耐堿放線菌進行纖維素利用、淀粉酶水解和蛋白酶活性測定，結(jié)果(表4)表明，供試放線菌對不同靶標菌的抑制作用差異較小，對金黃色葡萄球菌和小麥根腐菌的拮抗效果最好，拮抗菌株比例分別達到8.3%和11.1%，對南瓜枯萎菌和番茄灰霉菌拮抗菌株比例次之，達到5.6%，對粉紅聚端孢拮抗菌株比例較低，達到2.7%。抑菌圈直徑>20 mm的菌株有5株，具體結(jié)果見表5。

表 4　36株耐堿放線菌對不同靶標菌的拮抗能力

由表5可見，36株耐堿放線菌中有9株具有纖維素酶活性，占供試菌株的25.0%；3株具有淀粉酶活性，占供試菌株的8.3%；6株具有蛋白酶活性，占供試菌株的16.6%。抑菌活性試驗結(jié)果表明：36株耐堿放線菌中有12株具有拮抗活性，占分離菌株數(shù)的33.3%，其中3株能抑制金黃色葡萄球菌生長，4株能抑制小麥根腐菌生長，2株能抑制番茄灰霉菌生長，2株能抑制南瓜枯萎菌生長，1株能抑制粉紅聚端孢生長?？梢?，藏北高寒草原土壤中具有相對豐富的拮抗放線菌資源，可為新抗生素的開發(fā)提供廣闊空間。

表 5　36株耐堿放線菌的拮抗能力及酶活

注：0～22 為抑菌圈直徑(mm)，0表示無拮抗活性；纖維素酶：-.陰性；+.陽性；+++.濾紙條降解≥2/3。蛋白酶/淀粉酶:-.陰性;+.陽性。

Note:“0” - “22” represent the diameters of inhibition zone (mm),“0” no antagonistic activity；Cellulase:“-”.Negative;“+”.Positive;“+++”.Degradation of the filter paper≥2/3.Amylase/proteinase:“-”,Negative;“+”.Positive.

3結(jié)論與討論

從藏北高寒草原22份土樣中分離得到了36株代表性耐堿放線菌，這36株菌分布于放線菌綱5個亞目5個科5個屬內(nèi)，藏北高寒草原土壤放線菌組成較簡單，可能與藏北草原海拔高、低溫缺氧、有機質(zhì)分解緩慢、土壤干旱貧瘠等嚴酷的生態(tài)條件有關(guān)，本研究結(jié)果與顏霞等[18]對西藏亞高山草原土壤放線菌的研究結(jié)果一致。進一步研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌屬是藏北高寒草原環(huán)境的絕對優(yōu)勢菌種，這與Lee等[19]的研究結(jié)果相同，這也是土壤放線菌區(qū)系的一個顯著特點。分離的36株耐堿放線菌中25.0%的菌株具有纖維素酶活性,8.3%的菌株具有淀粉酶活性、16.6%的菌株具有蛋白酶活性，少數(shù)菌株(如J65)具有較高的纖維素酶活性，個別菌株(如J9、J11、J34、J52)可以產(chǎn)生2種酶。分離的36株菌株中33.3%的有抑菌活性，其中菌株J10、J14、J21、J48和J65有高拮抗活性(抑菌圈直徑D≥20 mm)，菌株J90和J96株具有廣譜拮抗活性，這些結(jié)果說明藏北高寒草原蘊藏豐富的耐堿放線菌資源，有待于進一步的發(fā)掘及開發(fā)。

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Biological activity and diversity of alkali tolerant actinomycetes in northern Tibet alpine grassland

YIN Ming-yuan，HE Jian-qing，ZHANG Ge-jie

(TibetAgriculturalandAnimalHusbandryCollege，Linzhi，Tibet860000，China)

Abstract:【Objective】 This study analyzed biodiversity,enzymes producing potential and antagonistic activity of alkali tolerant actinomycetes to provide reference for exploration of related resources.【Method】 A total of 22 soil samples were collected from saline-alkaline fields in northern Tibet Alpine grassland.Actinomycetes were isolated with plate dilution method.According to morphological characters,36 typical stains were selected.The alkali tolerant actinomycete strains were identified by sequence analysis of 16S rRNA.The antimicrobial activities of 36 strains were tested against plant pathogenic fungi and bacteria by measuring the mycelium growth rate.The activities of enzymes including amylase,proteinase and cellulase were also detected.【Result】 A total of 36 representative strains were separated from 22 samples and 16S rRNA sequence analysis showed that they were grouped into 5 genera (Streptomyces,Saccharothrix,Micromonospora,Promicromonospora,Kribbella)of 5 families belong to 5 orders of actinobacteria.Among the 36 strains,25.0% could produce cellulase,8.3% could produce amylase and 16.6% could produce proteinase. Among the obtained alkali tolerant actinomycetes,33.3% showed antibacterial activity and those with high activity (diameter of inhibition zone was ≥20 mm) were J10,J14,J21,J48,and J65.【Conclusion】 Diverse alkali tolerant actinomycetes with high enzyme producing activity and antagonistic activity against bacteria were discovered from saline-alkaline environments in northern Tibet grassland.

Key words:alkali torelant actinomycete;16S rRNA;biological activity;northern Tibet alpine grassland

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-03-1408:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.04.020

[收稿日期]2015-07-02

[基金項目]國家自然科學(xué)基金項目(31260005)；西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院研究生創(chuàng)新計劃項目(YJS2015-02)

[作者簡介]尹明遠(1991-)，男，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士，主要從事極端環(huán)境放線菌研究。E-mail:397598979@qq.com[通信作者]何建清(1971-)，女，四川南充人，教授，主要從事放線菌和生物防治研究。E-mail:hejianqingxz@163.com

[中圖分類號]Q938

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)04-0142-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160314.0845.040.html