李　杰， 田相利， 董雙林， 高明亮， 張　凱， 奉　杰， 班文波， 張慶起

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2.連云港市贛榆區(qū)海洋漁業(yè)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 連云港 222100)

添加糖蜜對(duì)蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響?

李杰1， 田相利1??， 董雙林1， 高明亮1， 張凱1， 奉杰1， 班文波1， 張慶起2

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2.連云港市贛榆區(qū)海洋漁業(yè)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 連云港 222100)

摘要：為探討?zhàn)B殖水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與不同環(huán)境因子的關(guān)系。本文通過(guò)添加糖蜜將外源添加物的(餌料和糖蜜)C/N調(diào)整為10、15、20和25四個(gè)不同水平(分別為C1、C2、C3和C4組)，以投喂基礎(chǔ)飼料作為對(duì)照組(C0)。利用PCR-DGGE技術(shù)和冗余分析方法(RDA)，分析了添加糖蜜對(duì)蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。研究表明：蝦蟹混養(yǎng)池塘水體中細(xì)菌菌群主要由放線菌綱、藍(lán)藻綱、α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱、δ-變形菌綱、ε-變形菌綱、擬桿菌綱和芽孢桿菌綱組成。C1、C2、C3和C4四個(gè)處理組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，與C0組差異顯著。各處理組的優(yōu)勢(shì)菌群相似，其相對(duì)含量存在一定差異，放線菌綱在整個(gè)養(yǎng)殖過(guò)程中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌群落的多樣性隨養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增加，于8月檢測(cè)到γ-變形菌綱，于9月檢測(cè)到ε-變形菌綱和芽孢桿菌綱。各處理組相比較，Pielou均勻度指數(shù)變化不明顯，Shannon-Winener指數(shù)隨C/N水平的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，在養(yǎng)殖后期,C2處理組的Shannon-Winener指數(shù)明顯高于其它處理組，C4處理組最低。RDA分析表明，蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體中菌群結(jié)構(gòu)的變化是多種環(huán)境因子綜合作用的結(jié)果。影響細(xì)菌群落多樣性的主要環(huán)境因子的重要性在7月為T(mén)OC>-N，在8月為P，在9月為-N>pH>TN>TOC。綜合水質(zhì)指標(biāo)、菌群結(jié)構(gòu)和多樣性分析結(jié)果表明：調(diào)控外源添加物C/N為15時(shí)，水體細(xì)菌群落多樣性高、組成差異小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，有利于蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)的水質(zhì)條件優(yōu)化。

關(guān)鍵詞：蝦蟹混養(yǎng)；水體；環(huán)境因子；PCR-DGGE；C/N；冗余分析；細(xì)菌群落；多樣性指數(shù)

引用格式：李杰，田相利，董雙林，等. 添加糖蜜對(duì)蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2016， 46(5): 38-49.

LI Jie, TIAN Xiang-Li, DONG Shuang-Lin, et al. Effect of molasses addition on microbial community structure in the polyculture system ofPortunustrituberculatusandLitopenaeusvannamei[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(5): 38-49.

生物絮團(tuán)是水體中的藻類(lèi)、異養(yǎng)微生物、原生動(dòng)物與殘餌等形成的團(tuán)絮狀有機(jī)碎屑[1]。水體中的殘餌及氨氮、亞硝氮等有毒物質(zhì)可以通過(guò)生物絮團(tuán)被異養(yǎng)微生物和藻類(lèi)利用，從而有效改善水質(zhì)[2]。同時(shí)，絮團(tuán)可以被部分養(yǎng)殖動(dòng)物攝食，實(shí)現(xiàn)餌料的多重利用，從而顯著提高養(yǎng)殖生物的生長(zhǎng)特性，節(jié)約生產(chǎn)成本[3-4]。另外，有研究表明生物絮團(tuán)還能夠在一定程度上抑制病原菌，提高動(dòng)物的免疫力[5]。因此，生物絮團(tuán)技術(shù)在養(yǎng)殖中的應(yīng)用越來(lái)越受到人們的關(guān)注，其技術(shù)的核心是通過(guò)調(diào)節(jié)合適的水體碳氮比，從而人為控制生物絮團(tuán)的形成[4]。Avnimelech通過(guò)計(jì)算得出當(dāng)飼料中C/N=15.75時(shí)，可以促進(jìn)微生物合成菌體蛋白，并有效去除養(yǎng)殖水體氨氮和亞硝酸鹽氮[6]。當(dāng)水體C/N水平為10～20時(shí)，有利于異養(yǎng)菌的繁殖，對(duì)絮團(tuán)的形成起到促進(jìn)作用[7-8]。

目前，生物絮團(tuán)技術(shù)作為一種改善養(yǎng)殖水體環(huán)境的重要手段已在國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到廣泛應(yīng)用，但對(duì)該技術(shù)的研究多集中于凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)、日本囊對(duì)蝦(Penaeusjaponicus)和羅非魚(yú)(Tilapia)等水產(chǎn)動(dòng)物的單一養(yǎng)殖模式中[1-2,9-10]，對(duì)其在混養(yǎng)模式中的應(yīng)用研究較為缺乏。三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是中國(guó)大型的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蟹類(lèi)之一，其與凡納濱對(duì)蝦的混合養(yǎng)殖是中國(guó)沿海地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要模式之一[11]，迄今未見(jiàn)生物絮團(tuán)技術(shù)對(duì)該養(yǎng)殖模式中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)等的影響。

變性梯度凝膠電泳(DGGE)是在基因水平上，通過(guò)分析DNA分子的種類(lèi)和數(shù)量來(lái)鑒定微生物種群結(jié)構(gòu)特征的一種現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)[12]，具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好和分析樣品量大等優(yōu)點(diǎn)。1993年Muyzer首次利用該技術(shù)分析了生態(tài)環(huán)境中細(xì)菌群落的多樣性，目前該技術(shù)在對(duì)海洋微生物的研究中已得到廣泛應(yīng)用[13]。例如，傅蓮英采用PCR-DGGE技術(shù)分析蝦蟹養(yǎng)殖水體及沉積物中細(xì)菌群落多樣性的變化[14]。Petri等應(yīng)用該技術(shù)研究了西波羅的海海冰垂直成層結(jié)構(gòu)中細(xì)菌群落的遺傳多樣性[15]。通過(guò)控制水體C/N水平調(diào)控水體細(xì)菌等微生物的組成和功能，是生物絮團(tuán)技術(shù)的核心之一[2,6]。本研究利用PCR-DGGE技術(shù)和冗余分析(RDA)等方法，分析了通過(guò)添加糖蜜調(diào)控外源添加物不同C/N水平對(duì)蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)中水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，探討了不同環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，以期從微生物學(xué)角度為通過(guò)C/N調(diào)控養(yǎng)殖水體水質(zhì)技術(shù)提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)池塘與圍隔

本研究于2013年7—10月在江蘇省贛榆縣佳信水產(chǎn)開(kāi)發(fā)有限公司海水養(yǎng)殖池塘中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)池塘為泥沙質(zhì)底。實(shí)驗(yàn)采用海水池塘陸基圍隔實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行，其中圍隔由支架和圍隔幔構(gòu)成，以木樁、竹竿等為支架，以高密度聚乙烯編織布為圍隔幔，架設(shè)于池塘中，面積為5m×5m，圍隔的初始條件一致，圍隔與圍隔之間是完全獨(dú)立的，且無(wú)水的交流，其具體結(jié)構(gòu)參見(jiàn)文獻(xiàn)[16]。實(shí)驗(yàn)期間，養(yǎng)殖水體利用充氣泵進(jìn)行連續(xù)充氣。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與管理

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)置了5個(gè)不同處理組，每組3個(gè)平行。各處理組通過(guò)添加糖蜜調(diào)控其C/N水平，分別設(shè)置為10(C1)、15(C2)、20(C3)和25(C4)，以不添加糖蜜組作為對(duì)照(C0，C/N在3.35～5.16之間)，詳見(jiàn)表1。本實(shí)驗(yàn)中的C/N指外源添加物(餌料和糖蜜)的碳元素與氮元素的質(zhì)量比。

實(shí)驗(yàn)圍隔中均放養(yǎng)三疣梭子蟹密度為6ind/m2，放養(yǎng)凡納濱對(duì)蝦密度為45ind/m2。實(shí)驗(yàn)用三疣梭子蟹苗及凡納濱對(duì)蝦皆購(gòu)自連云港贛榆佳信水產(chǎn)開(kāi)發(fā)有限公司。三疣梭子蟹放養(yǎng)時(shí)平均甲寬(1.71±0.21)cm，平均甲長(zhǎng)(0.88±0.10)cm，平均體重(0.29±0.03) g。凡納濱對(duì)蝦放養(yǎng)時(shí)體長(zhǎng)(1.76±0.44)cm，平均體重(0.12±0.03)g。三疣梭子蟹和凡納濱對(duì)蝦于2013年7月13日放養(yǎng)，于10月12日收獲完畢。

根據(jù)Avnimelech總結(jié)的生物絮團(tuán)養(yǎng)殖系統(tǒng)的C/N調(diào)控公式[6]，并根據(jù)餌料投喂量調(diào)整不同實(shí)驗(yàn)組糖蜜的添加量。糖蜜添加計(jì)算公式為：

C/N=(ΔCH×C1%+Feed×C2%)/(Feed×N%)。

式中：ΔCH為糖蜜添加量；C1%為糖蜜中有機(jī)碳含量；Feed為投餌量；N%為餌料中N的含量。

三疣梭子蟹餌料選用鮮活藍(lán)蛤(殼肉比為3.27，含水率為78.29%，含碳量32.78%，含氮量9.76%)；凡納濱對(duì)蝦選用連云港正大農(nóng)牧有限公司生產(chǎn)的對(duì)蝦配合飼料(含水率7.00%，含碳量34.65%，含氮量6.72%)。添加碳源為購(gòu)于山東壽光某公司的糖蜜(總有機(jī)碳含量28.91%)。

表1　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及糖蜜添加

Note:①Treatments; ②Stocking density of Litopenaeus vannamei; ③Stocking density of Portunus trituberculatus; ④Molasses addition to shrimp feed; ⑤Molasses addition to creep feed

1.2.2 實(shí)驗(yàn)管理鮮活藍(lán)蛤每日18:00—19:00投喂1次，投喂量參照周演根等[11]。對(duì)蝦飼料每天投喂2次，投喂時(shí)間為7:00—8:00與18:00—19:00。每7d檢查生長(zhǎng)，根據(jù)蝦蟹生長(zhǎng)情況調(diào)整餌料投喂量。

養(yǎng)殖期間圍隔不換水，僅補(bǔ)充因蒸發(fā)與滲漏造成的損失，水深保持在1.2～1.4m之間。7月底開(kāi)始使用增氧機(jī)充氧。每晚10:00至次日清晨6:00充氣，晴天下午2:00—4:00充氣，并根據(jù)天氣狀況調(diào)整。隨著餌料投喂量與糖蜜添加量的增加，生物絮團(tuán)逐步形成后調(diào)整成全天24h連續(xù)充氧。

糖蜜根據(jù)投餌量隨時(shí)調(diào)整，充分溶解后潑灑，每2h潑灑1次，天氣狀況不好不潑灑。

1.3 實(shí)驗(yàn)樣品的采集與預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)于2013年7—9月開(kāi)展。每月下旬，用采水器在實(shí)驗(yàn)圍隔的3個(gè)固定點(diǎn)、水深為0.5m左右處分別采集1000mL水樣，置于無(wú)菌的聚乙烯瓶中。待靜置30min后，經(jīng)800目篩絹過(guò)濾，0.22μm抽濾后，濾膜置于無(wú)菌EP管中，于-80℃超低冰箱中保存待測(cè)，水樣立即用于水質(zhì)指標(biāo)(總氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽、總氮、活性磷、總磷和總有機(jī)碳)的測(cè)定。

1.4 日常水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

1.5 變形梯度凝膠電泳DGGE

1.5.1 DGGE凝膠電泳采用CTAB化學(xué)法提取水體總DNA，以總DNA為模板，對(duì)細(xì)菌16SrDNA的特異性片段V3區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，特異性擴(kuò)增引物為GC-341f和534r。PCR反應(yīng)體系(50μL)為：2×Taq Master Mix25μL，DNA模板2μL，上下游引物各1μL，ddH2O 21μL。以DNA maker-2000為標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)PCR擴(kuò)增片段在1%的瓊脂糖凝膠的位置。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于聚丙烯酰胺凝膠(變行劑梯度為40%～65%)的點(diǎn)樣孔內(nèi)，在1×TAE的緩沖液中進(jìn)行電泳(時(shí)間為16h)，然后將凝膠置于5μg/mL的溴化乙錠溶液中進(jìn)行避光染色，蒸餾水漂洗后用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行拍照分析。

1.5.2 DGGE條帶的切割、回收、克隆、轉(zhuǎn)化和測(cè)序在紫外燈照射下切割DGGE泳道上較亮的特征條帶，置于50μL的ddH2O中，4℃過(guò)夜。選用Zymoclean凝膠回收試劑盒純化回收優(yōu)勢(shì)條帶的DNA。將回收純化的DNA連接到pEASYT1載體上進(jìn)行克隆，然后將連接產(chǎn)物導(dǎo)入Transl-T1感受態(tài)細(xì)胞中完成DNA的轉(zhuǎn)化。在LB培養(yǎng)基上挑取白色的陽(yáng)性克隆產(chǎn)物，通過(guò)載體通用引物M13F/R進(jìn)行檢測(cè)，然后在測(cè)序公司完成測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用BIO-RAD公司的Quantity One4.6.1軟件對(duì)DGGE電泳圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。采用BLAST軟件找出與目的基因同源相似性高的序列。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立采用MEGA6.3軟件。分別用香農(nóng)維納指數(shù)(H′)和Pielou指數(shù)(J)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)菌群落的多樣性和均勻度。

計(jì)算公式為：H′=-∑PilnPi;

J=H′/lnS。

式中：Pi為第i條帶的灰度占該樣品總灰度的比率；S為樣品所有條帶的總數(shù)目。

采用SPSS17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P<0.05作為差異顯著水平。運(yùn)用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件CANOCO4.5將數(shù)字化的DGGE指紋圖譜和環(huán)境因子相結(jié)合，完成冗余分析(RDA)。

2結(jié)果

2.1 蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)水體中環(huán)境因子指標(biāo)

2.2 水體細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)特征

圖1為水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的DGGE指紋圖譜。結(jié)果表明，7月各個(gè)處理組含有的共性條帶數(shù)量最多，條帶數(shù)目及停留位置均差異不大，表明7月水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征相似。而8、9月代表不同處理組的條帶在電泳圖譜組中數(shù)量、停留位置均出現(xiàn)差異，各處理組既含共性條帶，也含特異性條帶，而9月位于同一位置的條帶亮度也出現(xiàn)不同程度的變化，說(shuō)明細(xì)菌菌群在DNA分子水平上可能發(fā)生了變化。從整個(gè)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)來(lái)看，C0和C4組含有的條帶數(shù)目較少，C1～C3組含有條帶數(shù)目較多，其中C3組8月最多，條帶數(shù)目為30、29、29，C2組9月最多，條帶數(shù)目為34、35、35，而C4組最少，條帶數(shù)目為28、27、24。綜合以上結(jié)果，各處理組間的細(xì)菌類(lèi)型仍存在一定相似性，但隨著養(yǎng)殖時(shí)間的推移，不同C/N水平下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征差異越來(lái)越顯著。

對(duì)水體DGGE指紋圖譜中可辨認(rèn)的條帶進(jìn)行切割、回收測(cè)序，獲得陽(yáng)性克隆序列為：7月21條，8月26條，9月25條，大小均在169～196bp之間。測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索并進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果表明切膠序列與已知物種序列具有極高的相似度(98%～100%)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果構(gòu)建的水體菌群系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，7月水體細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群主要?dú)w屬于7個(gè)綱：放線菌綱(Actinobacteria)、藍(lán)藻綱(Cyanobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)和擬桿菌綱(Bacteroidetes)。其中，放線菌綱條帶數(shù)目在C1組分布最多，C3組條帶數(shù)目最多為α-變形菌綱，而C4組的藍(lán)藻綱條帶數(shù)目最多。8月水體細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群主要?dú)w屬于5個(gè)綱：放線菌綱、藍(lán)藻綱、α-變形菌綱、γ-變形菌綱(條帶數(shù)目最少，僅為1條，且只在實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn))和擬桿菌綱，其中，放線菌綱條帶數(shù)目在C1組分布最多，C4組的藍(lán)藻綱條帶數(shù)目最多，擬桿菌綱的條帶數(shù)目在各個(gè)處理組中分布均勻。9月水體細(xì)菌的主要優(yōu)勢(shì)菌群歸屬于放線菌綱、藍(lán)藻綱、α-變形菌綱、γ-變形菌綱、δ-變形菌綱、ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)和擬桿菌綱等9個(gè)綱。其中C2組含有的放線菌群條帶數(shù)目最多，擬桿菌綱在C0和C1數(shù)目較多，8月未檢測(cè)到的δ-變形菌綱在9月重新出現(xiàn)。

2.3水體細(xì)菌群落的相對(duì)豐度

圖3為水體細(xì)菌群落的相對(duì)豐度圖。結(jié)果顯示，隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行，各處理組水體細(xì)菌群落的相對(duì)豐度出現(xiàn)差異，優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生變化。其中，7月各處理組的優(yōu)勢(shì)菌群為放線菌綱、α-變形菌綱和藍(lán)藻綱，相對(duì)含量分別在13.11%～32.28%、10.22%～21.32%和10.02%～23.85%間，而β-變形菌綱、γ-變形菌綱、δ-變形菌綱和擬桿菌綱在各處理組中含量均較低，其中γ-變形菌綱僅在C4組出現(xiàn)。8月C0、C1、C2和C3中的優(yōu)勢(shì)菌群為放線菌綱，相對(duì)含量分別是30.55%、27.79%、27.89%和29.34%，其次是藍(lán)藻綱，而C4組的優(yōu)勢(shì)菌群是藍(lán)藻綱，相對(duì)含量是28.82%，其次是放線菌綱。γ-變形菌綱僅在C0～C4調(diào)控組被檢測(cè)到，其他種類(lèi)的細(xì)菌含量以C1最高，相對(duì)含量達(dá)到26.81%，說(shuō)明C1組優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)含量較低。在9月，放線菌綱是各處理組優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)含量分別為34.94%、40.87%、37.06%、36.73%和39.26%，其中，C0的相對(duì)含量最低，而C1與C2組不含δ-變形菌綱?？傮w上看，芽孢桿綱和ε-變形菌綱為9月新出現(xiàn)菌群，且只在各C/N調(diào)控組出現(xiàn)，而β-變形菌綱僅出現(xiàn)在7月。綜合以上可以看出，不同C/N水平下水體細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群及其含量出現(xiàn)差異，表明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

表2　不同C/N水平的水體環(huán)境因子指標(biāo)

注：表中同一列中標(biāo)注的不同字母表示每月各數(shù)據(jù)之間差異顯著(P<0.05)。

Note:Data in the same column with different superscripts are significantly different in the same month (P<0.05).

圖1　水體細(xì)菌群落DGGE指紋圖譜

圖2　水體菌群16S rDNA-V3序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的CA分析

圖4所示為不同處理組的CA分析。從圖中的變量因子(C0、C1、C2、C3、C4分別由圖4中的A、B、C、D、E表示)載荷和卡方距離可以看出，代表不同處理的點(diǎn)分布在排序圖的不同空間。7月代表各處理組的點(diǎn)基本分布在排序圖的中心附近；8月中C2和C3處理分布在排序軸的中心附近，C1和C4分布其兩側(cè)，都與對(duì)照組C0相距較遠(yuǎn)；而在9月，C2處理分布在排序軸的中心附近，與C1和C3處理差距不遠(yuǎn)，C0和C4處理靠近在排序圖的邊緣。綜上表明，不同C/N水平條件下細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)組成隨著養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行差異越來(lái)越明顯。

2.5 水體各類(lèi)細(xì)菌群落的相對(duì)豐度與環(huán)境因子的RDA分析

將不同C/N水平條件下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)DGGE圖譜數(shù)字化后與8種環(huán)境因子相結(jié)合進(jìn)行RDA分析，兩者之間的關(guān)系如圖5所示。代表不同處理組的點(diǎn)分布在排序圖的不同空間，表明不同C/N水平條件下水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。

圖3　水體中各種細(xì)菌群落的相對(duì)豐度

(圖中大寫(xiě)英文字母A、B、C、D和E分別代表C0、C1、C2、C3、C4不同處理組，A1～A3、B1～B3、C1～C3、D1～D4和E1～E3分別代表相應(yīng)處理的3個(gè)重復(fù)。A, B, C, D and E represents C0, C1, C2, C3 and C4, respectively and A1～A3，B1～B3，C1～C3，D1～D3 and E1～E3 represents three replicates for each treatments.)

圖4不同處理組的CA分析

Fig.4The CA analysis of different treatment group

圖5　不同C/N水平水體中各類(lèi)細(xì)菌群落

2.6水體細(xì)菌群落多樣性

本研究采用香農(nóng)-維納指數(shù)衡量細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性，采用Pielou指數(shù)來(lái)反映群落結(jié)構(gòu)的的均勻度[17]，從而對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行相對(duì)準(zhǔn)確的分析。從圖6可以看出，從時(shí)間尺度看，香農(nóng)維納指數(shù)和均勻度指數(shù)在整體上均呈現(xiàn)先高后低的變化趨勢(shì)，以8月最高，7月最低，9月略低于8月。從不同C/N水平來(lái)看，C2組香農(nóng)維納指數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，較其他處理組要高；而均勻度最高值則出現(xiàn)在8月的C1組，與C2組相差不大。C4組香農(nóng)維納指數(shù)和均勻度指數(shù)均最低，其他處理組則介于兩者之間。綜合上述2個(gè)指數(shù)可以看出，C2組細(xì)菌群落的多樣指數(shù)最高，C4組最低。

圖6　基于DGGE圖譜計(jì)算的Shannon-Winener

3討論

3.1 蝦蟹混養(yǎng)池塘水體中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)特征。

PCR-DGGE技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)中用于鑒定并分析細(xì)菌群落多樣性變化的一種重要分析手段[18]，該方法消除了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的限制，可在基因水平上更加全面、真實(shí)地反映細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)信息[19]。本研究以該技術(shù)手段分析了不同糖蜜添加量蝦蟹混養(yǎng)池塘7—9月水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性。研究發(fā)現(xiàn)，各處理細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群為放線菌、α-變形菌、藍(lán)細(xì)菌和一些未知不可培養(yǎng)細(xì)菌。這一結(jié)果與其它研究存在較大的差異。例如，羅鵬等研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門(mén)(β綱細(xì)菌占1/5)和CFB(Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides)是凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌群[20]；而夏耘等研究表明，在草魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，絮團(tuán)的主要細(xì)菌類(lèi)型為變形菌、放線菌、擬桿菌及一些未知不可培養(yǎng)細(xì)菌[21]。這種差異可能與養(yǎng)殖種類(lèi)、模式、養(yǎng)殖用水的類(lèi)型以及添加的碳源和餌料的不同有關(guān)。本研究在養(yǎng)殖初期檢測(cè)到β-變形菌，但這些細(xì)菌在養(yǎng)殖后期未被檢測(cè)到，證實(shí)了Stevens等的研究結(jié)果[22]；養(yǎng)殖后期，C/N調(diào)控組新出現(xiàn)了ε-變形菌綱和芽孢桿菌綱細(xì)菌，這與趙培[23]的研究結(jié)果相似。

3.2 蝦蟹混養(yǎng)系統(tǒng)中水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性指數(shù)

群落多樣性是衡量群落穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，群落組成越復(fù)雜，其結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，得到的緩沖越大，可以很好地應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的變化和群落內(nèi)部種群的波動(dòng)。表征生物多樣性指標(biāo)的參數(shù)較多[29]，本研究使用了香農(nóng)維納指數(shù)和均勻度指數(shù)。可以看出，細(xì)菌群落多樣性指數(shù)變化趨勢(shì)與DGGE指紋圖譜的分析結(jié)果基本一致。其中，7月的香農(nóng)維納指數(shù)和均勻度指數(shù)最低，說(shuō)明7月的細(xì)菌多樣性最低，群落組成最簡(jiǎn)單，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[30]。而8、9月的細(xì)菌群落的香農(nóng)維納指數(shù)相差不大，表明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，抗外界干擾能力比較強(qiáng)。群落多樣性與養(yǎng)殖環(huán)境關(guān)系密切，當(dāng)生態(tài)環(huán)境惡化時(shí)，微生物多樣性則會(huì)明顯下降[31]，且在一定范圍內(nèi)，隨營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的增加而增大，而過(guò)高則會(huì)受到抑制[32]。本研究發(fā)現(xiàn)處理組C1、C2和C3的香農(nóng)維納指數(shù)高于對(duì)照組，其中C2組的多樣性指數(shù)數(shù)值在養(yǎng)殖后期明顯高于其它處理組，而C4組則為最低。這表明C/N水平影響不同養(yǎng)殖模式水體細(xì)菌群落多樣性，當(dāng)C/N水平過(guò)高時(shí)，則可能會(huì)抑制環(huán)境敏感細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖，造成多樣性的下降[24,31,33-34]。

3.3 蝦蟹混養(yǎng)池塘水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間的關(guān)系

參考文獻(xiàn)：

[1]Avnimelech Y, Kochba M. Evaluation of nitrogen uptake and excretion by tilapia in biofloc tanks using N-15 tracing [J]. Aquaculture, 2009, 287(1): 163-168.

[2]Avnimelech Y. Feeding with microbial flocs by tilapia in minimal discharge bioflocs technology ponds [J]. Aquaculture, 2007, 264(1): 140-147.

[3]Emerenciano M, Ballester E L C, Cavalli R O, et al. Biofloc technology application as a food source in a limited water exchange nursery system for pink shrimp Farfantepenaeus brasiliensis (Latreille, 1817)[J]. Aquaculture Research, 2012, 43(3): 447-457.

[4]Crab R, Defoirdt T, Bossier P, et al. Biofloc technology in aquaculture: beneficial effects and future challenges [J]. Aquaculture, 2012, 356: 351-356.

[5]Crab R, Lambert A, Defoirdt T, et al. The application of bioflocs technology to protect brine shrimp (Artemiafranciscana) from pathogenicVibrioharveyi[J]. Journal of Applied Microbiology, 2010, 109(5): 1643-1649.

[6]Avnimelech Y. Carbon/nitrogen ratio as a control element in aquaculture systems [J]. Aquaculture, 1999, 176(3): 227-235.

[7]Hargreaves J A. Photosynthetic suspended-growth systems in aquaculture [J]. Aquacultural Engineering, 2006, 34(3): 344-363.

[8]Asaduzzaman M, Wahab M A, Verdegem M C J, et al. C/N ratio control and substrate addition for periphyton development jointly enhance freshwater prawnMacrobrachiumrosenbergiiproduction in ponds [J]. Aquaculture, 2008, 280(1): 117-123.

[9]Azim M E, Little D C. The biofloc technology (BFT) in indoor tanks: water quality, biofloc composition, and growth and welfare of Nile tilapia (Oreochromisniloticus) [J]. Aquaculture, 2008, 283：29-35.

[10]盧炳國(guó), 王海英, 謝駿, 等. 不同C/N水平對(duì)草魚(yú)池生物絮團(tuán)的形成及其水質(zhì)的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2013(8): 1220-1228.

Lu B G, Wang H Y, Xie J, et al. Effect of C/N ratio on bioflocs formation and water quality in zero-water exchange grass crap tanks[J]. Journal of Fisheries of China, 2013(8): 1220-1228.

[11]周演根, 馬甡, 蘇躍朋, 等. 三疣梭子蟹與凡納濱對(duì)蝦混養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2010, 40(3): 11-16.

Zhou Y G, Ma S, Su Y P, et al. Studies on the Effects of Polyculture of Litopenaeus vannamei with Portunus trituberculatus[J]. Periodical of Ocean University of China, 2010, 40(3): 11-16.

[12]車(chē)玉伶, 王慧，胡洪營(yíng)，等. 微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性解析技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)環(huán)境, 2005, 14(1): 127-133.

Che Y L, Wang H, Hu H Y, et al. Research progresses on analytical technologies used in microbial community structure and diversity[J]. Ecology and Environment, 2005, 14(1): 127-133.

[13]張振冬, 王淑芬, 曹宇峰. DGGE技術(shù)及其在海洋環(huán)境微生物多樣性研究中的應(yīng)用[J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 2008, 27(3): 297-300.

Zhang Z D, Wang S F, Cao Y F. DGGE technique and its application in study on microbial diversity in marine environment[J]. Marine environmental science, 2008, 27(3): 297-300.

[14]傅蓮英. 蝦蟹混養(yǎng)池細(xì)菌多樣性的研究[D]. 廈門(mén)： 廈門(mén)大學(xué), 2006.

Fu L Y. Study of Bacterial diversity in Shrimp and Crab Mixed-Cultured ponds[D].Xiamen: Xiamen University, 2006.

[15]Petr I R, Mhoff J F. Genetic analysis of sea-ice bacterial communities of the western Baltic sea using an improved double gradient method[J]. Polar Biology, 2001, 24(4): 252-257.

[16]李德尚, 楊紅生, 王吉橋, 等. 一種池塘陸基實(shí)驗(yàn)圍隔[J]. 青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 1998, 28(2) : 199-204.

Li D S, Yang H S, Wang J Q, et al. A device of land-based experimental enclosure used in ponds[J]. Journal of Ocean University of Qingdao, 1998, 28(2) : 199-204.

[17]Sun J, Liu D Y. The application of diversity indices in marine phytoplankton studiesActaOceanologicaSinica, 2002, 26(1): 62-75.

[18]梁英娟, 羅湘南, 付紅霞. PCR-DGGE技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用[J]. 生物學(xué)雜志, 2007, 24(6): 58-60.

Liang Y J, Luo X N, Fu H X. Application of PCR-DGGE in microbial ecology[J]. Journal of Biology, 2007, 24(6): 58-60.

[19]Fu D Y, Yu X T, Wang F. The effects of compound microorganisms on the growth and water quality in carps[J]. Feed Res, 2005(8): 43-45.

[20]羅鵬, 胡超群, 張呂平, 等. 凡納濱對(duì)蝦海水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)細(xì)菌群落的PCR-DGGE分析[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2009, 16(1): 31-38.

Luo P, Hu C Q, Zhang L P, et al PCR-DGGE analysis of bacterial communities in marine Litopenaeus vannamei culture system[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2009, 16(1): 21-38.

[21]夏耘, 邱立疆, 郁二蒙， 等. 生物絮團(tuán)培養(yǎng)過(guò)程中養(yǎng)殖水體水質(zhì)因子及原核與真核微生物的動(dòng)態(tài)變化[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2014, 21(1): 75-83.

Xia Y, Qiu L J, Yu E M, et al. Dynamic changes of water quality factors and composition of pro- karyotic and eukaryotic microorganisms during culturing of bio-floc[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2014, 21(1): 75-83.

[22]Stevens H, Stobner M, Simon M, et al. Phylogeny of Proteobacteria and Bacteroidetes from oxic habitats of a tidal flat ecosystem [J]. FEMS Microbiol Eco1, 2005, 54: 351-365.

[23]趙培. 生物絮團(tuán)在海水養(yǎng)殖中的研究與應(yīng)用[D]. 上海： 上海海洋大學(xué), 2011.

Zhao P. The study and application of bioflocs technology in seawater aquaculture[D]. Shanghai： Shanghai Ocean University, 2011.

[24]Goldman J C, Caron D A， Dennett M R, et al. Regulation of gross growth efficiency and ammonium regeneration in bacteria by substrate C: N ratio[J]. Limnology and Oceanograply, 1987, 32(6): 1239-1252.

[25]劉瑞娟. 蟹蝦貝混養(yǎng)系統(tǒng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與功能多樣性初步研究[D]. 青島： 中國(guó)海洋大學(xué), 2014.

Liu R J. Preliminary study on variation of microbe quantity and community composition in polyculture ecosystem of crab, shrimp and clam[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2014.

[26]鄧吉朋, 黃建華, 江世貴, 等. 生物絮團(tuán)在斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中的形成條件及作用效果[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2014, 10(3): 29-37.

Deng J P, Huang J H, Jiang S G, et al. Conditions for bio-floc formation and its effects onPenaeusmonodonculture system[J]. South China Fisheries Science, 2014, 10(3): 29-37.

[27]Rosenberry B. Meet the Flockers: What Is Bio-loc Shrimp Farming and How Does It Work? [EB/OL]. [2011-04-11]. http: //www. shrimpnews. com/FreeReports Folder/MeetFlnekers. html.

[28]Hari B, Madhusoodana Kurup B, Varghese J T, et al. The effect of carbohydrate addition on water quality and the nitrogen budget in extensive shrimp culture systems[J]. Aquaculture, 2006, 252(2-4): 248-263.

[29]Yang Y H, Yao J. Effect of pesticide pollution against functional microbial diversity in soil [J]. Journal of Microbiology， 2000, 20(2): 23-25.

[30]劉東艷, 孫軍, 張利永. 膠州灣浮游植物水華期群落結(jié)構(gòu)特征[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2003, 14(11): 1963 -1966.

Liu D Y, Sun J, Zhang L Y. Structural characteristics of phytoplankton community during harmful algae bloom in Jiaozhou Bay[J]. Journal of Applied Ecology, 2003, 14(11): 1963-1966.

[31]馮勝, 秦伯強(qiáng), 高光. 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)水體富營(yíng)養(yǎng)化的響應(yīng)[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 27 (11): 1823-1829.

Feng S, Qin B Q, Gao G. Response of bacterial communities to eutrophic water in Lake Taihu[J]. Acta Scientiae Circum stantiae, 2007, 27(11): 1823-1829.

[32]有小娟, 李秋芬, 張艷，等. 象山港內(nèi)西滬港海域沉積環(huán)境細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的時(shí)空變化及其主要環(huán)境影響因子[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2013, 19(5): 742-749.

You X J, Li Q F, Zhang Y, et al. Spatial and temporal variation of bacterial community structures and their main environmental influencing factors in sediment environment of Xihu Area in Xiangshan Bay[J]. Chinese Journal of Applied & Environmental Biology, 2013, 19(5): 742-749.

[33]Schneider J, Sereti V, Machiels M A M, et al. The potential of producing heterotrophic bacteria biomass on aquaculture waste[J]. Water Research, 2006, 40(14): 2684-2694.

[34]羅佳, 韓士群, 羅海榮, 等. 外加碳源對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化水體生物脫氮效果及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 28(6): 1312-1317.

Luo J, Han S Q, Luo H R, et al. Effect of exogenus carbon resource on biological denitrification and bacte-rial community structure of eutrophic waters[J]. Jiangsu Journal of Agriculture Sciences, 2012, 28(6): 1312-1317.

[35]Gast R J, Dennett M R, Caron D A, et al. Charaterization of protistan assemblages in the Ross Sea，Antarctic by denaturing gradient gel electrophoresis[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 4: 2028-2037.

[36]Kent A D, Smith D J, Benson B J, et al. Web-based phylogenetic assignment in tool for analysis of terminal restriction fragment length polymorphism profiles of microbial communities[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(11): 6768-6776.

[37]馮勝, 李定龍, 秦伯強(qiáng). 太湖水華過(guò)程中微生物群落的動(dòng)態(tài)變化[D]. 寧波：寧波大學(xué)學(xué)報(bào), 2010.

Feng S, Li D L, Qi B Q. Dynamic Changes of Bacteria Community in Algale Blooming in Taihu Lake[D].Ningbo： Journal of Ningbo University, 2010.

[38]Melissa A R, Laura G L. Nutrients and other abiothic factors affecting bacterial communities in an Ohi River(USA)[J]. Microbial Ecology, 2007, 54(2): 374-383.

責(zé)任編輯朱寶象

Effect of Molasses Addition on Microbial Community Structure in the Polyculture System ofPortunustrituberculatusandLitopenaeusvannamei

LI Jie1, TIAN Xiang-Li1, DONG Shuang-Lin1, GAO Ming-Liang1, ZHANG Kai1,FENG Jie1, BAN Wen-Bo1, ZHANG Qing-Qi2

(1.The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.Marine Fishery Technology Guiding Office, Ganyu, Lianyungang 222100, China)

Abstract：Bacteria are producers and decomposers of the microbial ecosystem, playing a very important role there in the material circulation, energy flow, environmental improvement and prevention of diseases, and being closely related to the diseases outbreaking frequently among the farming and breeding ani-mals. Accordingly, it is very significant to study microbial community composition, structure and function. In the present study, the PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) technology, redundancy analysis (RDA) and the diversity index were employed to characterize the bacterial community structure in the polyculture system of Portunus tritiberculatus and Litopenaeus vannamei to investigate the effect of abiotic factors. In terms of microbiology, the regulation of C/N could be a useful mean of improving aquatic environments; it can promote the growth of P. trituberculatus and L. vannamei in the polyculture system. The group treated with basic feed was used as control(C0). Four other C/N levels (i. e. 10, 15, 20 and 25) were set in this experiment by adding molasses into artificial feed, and the four treatments were represented by C1, C2, C3 and C4 group, respectively. Results from this study demonstrated that the major bacteria included Actinobacteria, Cyanobacteria, Proteobacteria (α, β, γ, δ and ε), Bacteroidetes and Bacillibacteria in seawater of this polyculture system. In this study, the results had significant difference from those of other researches, which may be cause by the different culture of species, breeding patterns, type of aquaculture water and the addition of carbon and feed. Change in community structure of bacteria in water is related to the content and proportion of C and N. A similar bacterial community structure was obtained between treatments of C1, C2, C3 and C4, all being significantly different from C0 group. All treatments had a similar dominant bacterial community and Actinobacteria dominated all aquaculture experiment, while there was a significant difference between treatments in the relative amount of dominant bacterial community. In comparison with the control, the microbial community diversity increased with the aquaculture time. Rather than control group, γ-Proteobacteria was detected in August in other treatments and ε-Proteobacteria and Bacillibacteria in September. These findings illustrated that adding carbon into the aquaculture water appropriately may make contribution to the growth of aquaculture probiotic. CA analysis showed that the difference between the bacterial community compositions is more significant in the later stage of the experiment. When compared with other groups, C2 group has a better bacterial community composition and more stable structure. The diversity index showed a variation trend of increasing firstly and reached the maximum in August and then decreased. No significant change of Pielou index was observed among all treatments, while Shannon-Winener index increased firstly and then decreased, being the highest in C2 group and the lowest in C4 group in September. From the results, it was showed that C/N ratio affected aquatic microbial community diversity. It might inhibit the growth and reproduction of the environmentally sensitive bacteria when C/N level was too high, which will decrease the diversity of the microorganisms. According to RDA analysis, the change in microbial community structure was the synergistic result of multi-abiotic factors, of them TOC > TN > -N > TP > -P > -N in July, TP > -N> P in August and -N > -N> -P > -N > pH > TN > TOC in September. It showed that TOC was an important factor in early experiment. Besides, despite the different specific forms, N and P are the important elements, which could affect the microbial community structure during the entire breeding process. The preliminary experimental results showed that the C/N level of 15 was better for the polyculture system of P. trituberculatus and L. vannamei in seawater purification and in the maintenance of microbial community structure.

Key words:polyculture; water quality; environmental factor; PCR-DGGE; C/N; redundancy analysis; bacterial community; diversity index

基金項(xiàng)目：? 國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD13B03)；山東省杰出青年基金項(xiàng)目(JQ201009)資助

收稿日期：2015-02-04；

修訂日期：2015-12-13

作者簡(jiǎn)介：李杰(1985-)，女，碩士生，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)研究。E-mail：lijiexiaomai@163.com ??通訊作者： E-mail：xianglitian@ouc.edu.cn

中圖法分類(lèi)號(hào)：S917.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-5174(2016)05-038-12

DOI：10.16441/j.cnki.hdxb.20150040

Supported by National Great Project of Scientific and Technical Supporting Programs(2011BAD13B03)；Program for Excellent Youth Foundation of Shandong Province(JQ201009)