詹　妮, 黃烈健

( 中國林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所， 廣州 510520 )

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馬占相思花粉離體萌發(fā)研究

詹妮, 黃烈健*

( 中國林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所， 廣州 510520 )

摘要：馬占相思(Acacia mangium)是含羞草科(Mimosaceae)金合歡屬(Acacia Mill.)樹種，在我國的廣東、廣西、福建以及海南等省(區(qū))大面積種植推廣。馬占相思用途廣泛，其雜交育種工作近年來逐漸受到重視，馬占相思花粉研究對其雜交育種成敗具有重要影響。該研究以新鮮的馬占相思花粉為供試材料，開展不同蔗糖濃度(50、100、150、200、250和300 g·L-1)、不同硼酸濃度(100、200和300 mg·L-1)以及不同培養(yǎng)溫度(26、28和30 ℃)對馬占相思花粉離體萌發(fā)影響的研究，同時使用篩選出的馬占相思花粉離體萌發(fā)的最佳處理，開展對另外3株與初試的馬占相思生長發(fā)育狀況接近的馬占相思的花粉活力檢測研究，并觀察記錄馬占相思花粉離體萌發(fā)特征。結(jié)果表明：將剛開放的馬占相思花序采回室內(nèi)陰干，于次日10:00后，用毛筆刷法成功收集大量馬占相思花粉，經(jīng)顯微鏡觀察檢測，花粉純度較高，可以保證后續(xù)研究備用；馬占相思花粉離體萌發(fā)的最佳處理為200 g·L-1蔗糖、100 mg·L-1硼酸、28 ℃培養(yǎng)溫度；馬占相思花粉在培養(yǎng)24 h之后，花粉萌發(fā)率最高(為94.28%)，花粉管最長(為6.0 D)；檢測3株馬占相思的花粉萌發(fā)率分別為90.11%、82.31%、85.67%，具有顯著差異。該研究結(jié)果為今后進(jìn)一步開展人工控制授粉、選育優(yōu)良的相思雜交新品種提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：馬占相思， 花粉收集， 培養(yǎng)溫度， 萌發(fā)率， 花粉管長度

馬占相思(Acaciamangium)是含羞草科(Mimosaceae)金合歡屬(AcaciaMill.)的速生豐產(chǎn)樹種，原產(chǎn)于昆士蘭北部、巴布亞新幾內(nèi)亞西部、伊里安島以及印度尼西亞的魯古群島(Doran et al，1982)。馬占相思的用途廣泛，其木材可用作建筑、紙漿、家具材料等；其根系具有根瘤菌，可以增加土壤肥力，是荒山造林的優(yōu)良樹種。馬占相思自1979年引入中國之后，已在我國的廣東、廣西、福建以及海南等省區(qū)大面積種植推廣。

目前，馬占相思的雜交育種工作越來越受到重視，關(guān)于馬占相思花粉的研究則是影響其雜交育種成敗的關(guān)鍵因素，而開展花粉收集和花粉活力檢測是開展雜交育種的前提工作。已有研究表明馬占相思花粉顆粒極小、難收集(黃烈健等, 2014)，因此花粉收集是開展其雜交育種必須解決的問題?；ǚ刍盍z測方法有染色法、受精力測定法以及離體萌發(fā)測定法等(王欽麗等, 2002)。對于花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基組分研究，已有對桂花(Osmanthusfragrans) (張洪偉等, 2014)、刺槐(Blacklocust)(戴麗等, 2012)、柚木(Tectonagrandis)(黃桂華等, 2011)、有斑百合(Liliumconcolorvar.buschianum)(李晶等, 2011)、杏花(apricot)(安曉芹等,2011)以及小黑楊(Populossimonii×P.nigra)(趙麗娟等, 2011)等的花粉培養(yǎng)基組分以及對花粉活力試驗研究，均認(rèn)為蔗糖濃度和硼酸是影響花粉萌發(fā)的主要因素。國內(nèi)外有關(guān)馬占相思花粉、其離體萌發(fā)體系以及培養(yǎng)溫度篩選的研究均較少。本文旨在研究馬占相思花粉收集、離體萌發(fā)的最佳處理以及最佳培養(yǎng)溫度，為馬占相思人工輔助授粉和雜交育種提供了理論與實踐依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

供試材料取自廣東省江門市國家重點相思良種基地，該基地位于江門市新會區(qū)沙堆鎮(zhèn)南坑林場(113°08′ E，22°18′ N)，屬亞熱帶季風(fēng)性氣候。馬占相思種子園于1998年1月建立，面積共4.2 hm2，園內(nèi)植株的株行距為5 m × 8 m。

1.2 方法

1.2.1 馬占相思花粉收集方法清晨采集當(dāng)天開放的新鮮馬占相思花穗裝入硫酸紙袋中，放入25～30 ℃室內(nèi)陰干，待次日用毛筆收集花粉，并過篩，裝入加有干燥硅膠的小玻璃瓶中，抽真空待用。

1.2.2 培養(yǎng)基成分篩選選取種子園中1株馬占相思花粉為試驗材料，設(shè)計6個蔗糖濃度50、100、150、200、250、300 g·L-1和3個硼酸濃度100、200、300 mg·L-1，共18個培養(yǎng)基，每個處理3次重復(fù)。

1.2.3 培養(yǎng)溫度篩選設(shè)計3個培養(yǎng)溫度梯度，為26、28、30 ℃，培養(yǎng)24 h。

1.2.4 不同單株花粉萌發(fā)差異根據(jù)對蔗糖濃度和硼酸濃度以及培養(yǎng)溫度的篩選結(jié)果，選擇出馬占相思花粉最適宜的處理，對另外3株與初試單株生長發(fā)育狀況接近的馬占相思的花粉進(jìn)行活力檢測，進(jìn)行花粉萌發(fā)過程及花粉萌發(fā)差異等研究。

1.2.5 培養(yǎng)方法在載玻片的凹槽上滴加培養(yǎng)液1～2滴，將收集好的新鮮的馬占相思花粉撣在培養(yǎng)液上，將載玻片放入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)皿中放入2張濕潤濾紙。

1.2.6 觀測方法馬占相思花粉在培養(yǎng)3、6、9、12、24 h時，用光學(xué)顯微鏡觀察花粉的萌發(fā)情況，并進(jìn)行記錄，隨機選取2個視野，進(jìn)行3次重復(fù)，保證每個處理統(tǒng)計觀察的花粉粒不少于200粒。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析計算每個視野的馬占相思花粉萌發(fā)率和最長花粉管長度(本研究花粉管長度以單顆復(fù)合花粉粒長度為計數(shù)單位，1 D)，采用Excel和SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析，用鄧肯(Duncan)多重比較評價差異的顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1 馬占相思花粉收集

在早上9:00之前，采當(dāng)天開放的馬占相思花穗，帶回室內(nèi)陰干，待次日10:00花藥大量爆裂之后收集花粉。用毛筆反復(fù)輕刷馬占相思花穗5～6次，200目篩子過篩，裝入加有干燥硅膠的小玻璃瓶中，蓋上蓋，抽真空待用。用此方法收集到的馬占相思花粉(圖1)，可用作花粉活力檢測及貯藏研究。

圖 1　收集的馬占相思花粉　(20 × 10倍顯微鏡下觀測)Fig. 1　Collected pollen of Acacia mangium　(20 × 10 microscope)

2.2 馬占相思花粉萌發(fā)的最佳處理及培養(yǎng)溫度篩選

馬占相思花粉在26 ℃恒溫下培養(yǎng)(表1)。表1顯示，當(dāng)蔗糖濃度為150 g·L-1、硼酸濃度為200 mg·L-1時，花粉萌發(fā)率最高(86.14%)，顯著高于其他處理；花粉管長度最長(6.0 D)。

馬占相思花粉在28 ℃恒溫下培養(yǎng)(表2)。表2顯示，當(dāng)蔗糖濃度為200 g·L-1、硼酸濃度為100 mg·L-1時，花粉萌發(fā)率最高(為94.28%)，顯著高于其他處理；花粉管長度最長(為6.0 D)。

馬占相思花粉在30℃恒溫下培養(yǎng)(表3)。表3顯示，200 g·L-1蔗糖濃度和100 mg·L-1硼酸濃度的處理，花粉萌發(fā)率最高(為57.68%)；150 g·L-1蔗糖濃度和200 mg·L-1硼酸濃度的處理，花粉萌發(fā)率為52.48%；250 g·L-1蔗糖濃度和100 mg·L-1硼酸濃度的處理，花粉萌發(fā)率為52.46%，其花粉萌發(fā)率顯著高于其他處理。在蔗糖濃度200 g·L-1和硼酸濃度200 mg·L-1處理下，花粉管長度最長。

這說明不同的蔗糖濃度和硼酸濃度以及不同培養(yǎng)溫度的處理之間，馬占相思花粉萌發(fā)率、花粉管長度差異顯著。當(dāng)蔗糖濃度到達(dá)200 g·L-1時，隨著其濃度的增加對馬占相思花粉生長起到抑制作用。在26、28、30 ℃培養(yǎng)下的花粉，最高萌發(fā)率分別為86.14%、94.28%、57.68%。

表 1　在26 ℃下馬占相思花粉不同處理

注： 每列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercases among treatments in the same row indicate significant differences (P<0.05). The same below.

表 2　在28 ℃下馬占相思花粉不同處理花粉

表 3　在30 ℃下馬占相思花粉不同處理花粉

表 4　3株馬占相思花粉萌發(fā)率比較分析

綜合以上分析，馬占相思花粉離體萌發(fā)的最佳處理組合為200 g·L-1蔗糖、100 mg·L-1硼酸、28 ℃培養(yǎng)溫度，花粉萌發(fā)率為94.28%。

2.3 馬占相思花粉離體萌發(fā)特征

用最佳處理培養(yǎng)馬占相思花粉，培養(yǎng)3 h，花粉開始萌發(fā)；培養(yǎng)6 h，花粉管生長到復(fù)合花粉粒長度的3～4倍(圖2：A)；培養(yǎng)9 h，花粉管數(shù)量為4～5條，花粉管前端開始膨大(圖2：B)；培養(yǎng)24 h，花粉管為6～7倍復(fù)合花粉粒的長度，有6～7條花粉管(圖2：C)；再繼續(xù)培養(yǎng)，花粉管基本停止生長。

2.4 馬占相思不同單株花粉萌發(fā)差異

在馬占相思種子園中選取3株馬占相思，用花粉離體萌發(fā)的最佳處理組合(蔗糖濃度200 g·L-1、硼酸濃度100 mg·L-1、培養(yǎng)溫度28 ℃)進(jìn)行花粉離體萌發(fā)檢測。培養(yǎng)3 h后，花粉開始萌發(fā)，最長花粉管長度為3.0 D。

圖 2　馬占相思花粉培養(yǎng)萌發(fā)情況　A. 培養(yǎng)6 h； B. 培養(yǎng)9 h； C. 培養(yǎng)24 h。Fig. 2　State of Acacia mangium pollen germination 　A. Cultured for 6 h; B. Cultured for 9 h; C. Cultured for 24 h.

圖 3　3株馬占相思花粉萌發(fā)率隨培養(yǎng)時間的變化過程Fig. 3　Pollen germination rate changing of 3 plants of Acacia mangium during the culture time

圖 4　3株馬占相思花粉管長度隨培養(yǎng)時間的變化過程Fig. 4　Lengths of pollen tube changing of 3 plants of Acacia mangium during the culture time

3株馬占相思的花粉萌發(fā)率之間存在顯著差異(表4)。其中，1號馬占相思單株萌發(fā)率最高，為90.11%；2號馬占相思單株的萌發(fā)率為82.31%，是3株中最低的。從圖3可以看出，隨著培養(yǎng)時間增加，3株馬占相思的花粉萌發(fā)趨勢相似，近乎線性上升。

由圖4可知，馬占相思3個單株的花粉，其花粉管的長度隨時間的變化趨勢相近。1號、3號單株的花粉培養(yǎng)3 h后，花粉管長度可達(dá)3 D；培養(yǎng)24 h后，花粉管長度趨于穩(wěn)定，2號、3號單株的花粉管長度為6 D。

3討論與結(jié)論

黃烈健等(2014)對馬占相思開花生物學(xué)特征的研究表明，馬占相思花藥在開花當(dāng)天9:00-12:00開裂散粉。本研究跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，采摘之后的馬占相思花穗在室內(nèi)陰干，其花藥在開花次日10:00大量開裂散粉。故本研究在開花當(dāng)天9:00之前完成對新鮮花穗的采集，放入室內(nèi)陰干，次日早晨10:00后收集花粉。

Kato et al(2012a)的研究表明馬占相思花粉顆粒小、難收集，采用聚乙烯塑料管可收集少量花粉，但采用該方法收集的馬占相思花粉，受花藥開裂的時間限制，收集花粉數(shù)量十分有限。本研究采用毛筆刷法，進(jìn)行馬占相思花粉收集，根據(jù)顯微鏡的觀察結(jié)果表明，所收集的馬占相思花粉數(shù)量大、純度較高，適用于后續(xù)相關(guān)研究，是一種簡便的相思花粉收集方法。

在花粉離體萌發(fā)過程中，蔗糖可以提供花粉管形成所需的滲透壓和能量，硼酸可以促進(jìn)花粉管頂端細(xì)胞壁形成，從而促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管伸長(Hedhly et al, 2005)。開展不同樹種的花粉離體萌發(fā)研究時，需要根據(jù)其樹種的不同，進(jìn)行其相應(yīng)的花粉萌發(fā)研究。盡管 Kato et al (2012b)曾開展了馬占相思花粉的離體萌發(fā)研究，但其并沒有經(jīng)過系統(tǒng)的試驗設(shè)計來研究建立馬占相思的花粉離體萌發(fā)體系，只是直接采用200 g·L-1蔗糖+1%瓊脂，23 ℃培養(yǎng)48 h，來研究不同馬占相思無性系之間的萌發(fā)率等的差異。該研究結(jié)果并不能為本研究提供直接有用的參考和借鑒。本研究通過對不同蔗糖濃度、硼酸濃度以及培養(yǎng)溫度對馬占相思花粉離體萌發(fā)的影響研究，篩選出馬占相思花粉最佳離體萌發(fā)處理：蔗糖濃度為200 g·L-1、硼酸濃度為100 mg·L-1，培養(yǎng)溫度為28 ℃，最高萌發(fā)率為94.28%。在本研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)花粉培養(yǎng)的時間超過24 h，開始出現(xiàn)真菌的污染，培養(yǎng)時間越長，真菌污染越嚴(yán)重。Beck-Pay(2012)的研究也得出同樣的結(jié)論。因此，本研究將馬占相思花粉的培養(yǎng)時間確定為24 h。對馬占相思花粉離體萌發(fā)體系最佳處理研究，將為今后開展相思類其他樹種的花粉相關(guān)研究提供參考。

Kato et al ( 2012b)研究發(fā)現(xiàn)，馬占相思不同無性系間的花粉活力存在著顯著差異。這就提示我們，在進(jìn)行以馬占相思為父本的雜交工作時，應(yīng)分別檢測所選擇的馬占相思單株的花粉，選擇具有較高萌發(fā)率的單株花粉進(jìn)行授粉，才能保證成功率。因此，本研究在篩選出馬占相思最佳離體萌發(fā)處理之后，對3株不同的馬占相思單株進(jìn)行花粉萌發(fā)率等檢測分析結(jié)果表明，不同馬占相思單株花粉的萌發(fā)率存在顯著差異，1號單株萌發(fā)率為90.11%，2號單株萌發(fā)率為82.31%，3號單株萌發(fā)率為85.67%。本研究結(jié)果也證實了Kato et al (2012b)的結(jié)論。

為了今后能更好地開展馬占相思人工授粉、雜交育種工作，我們除了選擇生長好、材質(zhì)優(yōu)的親本外，還需對其親本進(jìn)行花粉活力測定，擇優(yōu)而用；同時還需開展馬占相思花粉貯藏條件、花粉活力隨貯藏時間變化的研究。本研究結(jié)果為今后開展馬占相思雜交育種研究奠定了重要的基礎(chǔ)。

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Study onAcaciamangiumpollen germinationinvitro

ZHAN Ni, HUANG Lie-Jian*

(ResearchInstituteofTropicalForestry,ChineseAcademyofForestry, Guangzhou 510520, China )

Abstract:Acacia mangium is a number of Mimosaceae Acacia Mill., and it is planted and promoted in Guangdong, Fujian and Hainan provinces and Guangxi Autonomus Region. A. mangium is used widely, and it is hybrid breeding has received great attention. The research on the A. mangium pollen is key to the hybrid breeding. In this study, we studied the effects of the different sucrose concentrations (50, 100, 150, 200, 250 and 300 g·L-1), the different boric acid concentrations (100, 200 and 300 mg·L-1) and different culture temperatures (26, 28 and 30 ℃) on the pollen in vitro germination using the fresh pollen from one plant of A. mangium as experiment materials detected the pollen viability of the other 3 plants of A. mangium using the best A. mangium pollen in vitro germination treatment, whose growths and developments closed to the preliminary A. mangiums and observed and recorded the characteristics of A. mangium pollen in vitro germination. The results showed that the inflorescences of just open of A. mangium were collected and took to the chamber and air dried at room temperature. On the next day after 10:00, a large number of pollen was collected successfully with brush method. The pollen of high purity by microscope detection could ensure the follow-up study in the future. The optimum treatments of pollen germination in vitro of A. mangium were 200 g·L-1sucrose, 100 mg·L-1boric acid and 28 ℃ culture temperature. After A. mangium pollen cultured for 24 h, the pollen germination percentage was the highest (94.28%) and the pollen tube was the longest (6.0 D). The pollen germination percentage of the other 3 plants of A. mangium had significant difference, 90.11%, 82.31%, 85.67%, respectively. This study provide the basis for further development of artificial control pollination and breeding excellent new hybrid of Acacia.

Key words:Acacia mangium, pollen collection, culture temperature, germination percentage, pollen tube length

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201503024

收稿日期:2015-04-16 修回日期： 2015-07-27

基金項目：國家“十二五”科技支撐計劃項目(2012BAD01B0402)[Supported by National Key Technology R & D Program of the Ministry of Science and Technology of China during the “12th Five-Year Plan”(2012BAD01B0402)]。

作者簡介：詹妮(1990-)，女，天津塘沽人，在讀碩士研究生，主要研究方向為相思樹的育種，(E-mail)jennyzn1122@163.com。*通訊作者： 黃烈健，博士，副研究員，主要從事相思樹的育種研究，(E-mail) 13802987948@163.com。

中圖分類號：Q943.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)05-0595-05

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