唐　明， 汪　超， 譚韻雅， 李　群

( 四川師范大學 生命科學學院， 成都 610101 )

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不同種類無機鹽對灰氈毛忍冬“渝蕾1號”懸浮培養(yǎng)體系中細胞生長和綠原酸含量的影響

唐明， 汪超， 譚韻雅， 李群*

( 四川師范大學 生命科學學院， 成都 610101 )

摘要：為提高灰氈毛忍冬“渝蕾1號”懸浮培養(yǎng)體系中綠原酸的含量，該研究探討了B5培養(yǎng)基中不同濃度的無機鹽對灰氈毛忍冬“渝蕾1號”懸浮培養(yǎng)細胞生物量及綠原酸含量的影響，通過在懸浮培養(yǎng)體系中添加不同濃度的無機鹽，采用重量法測定灰氈毛忍冬“渝蕾1號”懸浮培養(yǎng)細胞的生物量及采用高效液相色譜法測定綠原酸的含量。結果表明：當硝態(tài)氮和銨態(tài)氮配比與B5培養(yǎng)基中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮配比一致時，即NO3-/NH4+摩爾比值為13∶1時，培養(yǎng)體系有利于細胞的生長和綠原酸的積累。當KNO3濃度為3.5 g·L-1時，細胞生物量達到最大，為19.26 g·L-1；當KNO3在較低濃度(0.5 g·L-1和1.5 g·L-1)時，積累較多的綠原酸。NO3-的兩項研究結果均與對照濃度(2.5g·L-1)有一定的差異。另外，對 (NH4)2SO4來說，在高于對照濃度0.134 g·L-1，即濃度為0.268 g·L-1時，生物量和綠原酸含量都達到了最大。P、Ca、Mg三種礦質元素的研究結果表明，當NaH2PO4·2H2O濃度為0.10 g·L-1、CaCl2的濃度為0.20 g·L-1時，細胞的生長和綠原酸的積累均可達到最大值；而對Mg2+來說，低濃度促進細胞的生長，高濃度促進綠原酸的積累。兼顧細胞生物量和綠原酸含量兩個指標，需選擇適中的濃度。這些結果均與對照濃度有一定的差異。這說明灰氈毛忍冬“渝蕾1號”懸浮細胞所需無機鹽的濃度與B5培養(yǎng)基無機鹽的濃度有一定的差異，選擇適宜的濃度可促進其懸浮細胞的生長及次生代謝產物綠原酸的積累。該研究結果為綠原酸的工業(yè)化生產打下了基礎。

關鍵詞：灰氈毛忍冬“渝蕾1號”， 懸浮培養(yǎng)， 綠原酸， 高效液相色譜， 無機鹽

金銀花(FlosLonicerajaponicae) 為忍冬科植物忍冬的花蕾以及它們初開的花(徐曉蘭等，2013)。金銀花為中醫(yī)臨床使用的傳統(tǒng)中藥材，藥用歷史悠久(倪付勇等，2015)?；覛置潭坝謇?號”(LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.‘Yulei 1’)是以灰氈毛忍冬為砧木嫁接而成，經(jīng)重慶市有關專家審定的重慶首個藥用植物新品種(黃昌銀，2009)。同時，該品種具有高產量、高品質、整個花期不開花等優(yōu)點(姜法強，2013)，同時，該品種的主要次生代謝產物綠原酸含量較高。因此，自從該品種被發(fā)現(xiàn)以來，得到了重慶市政府的足夠重視。眾所周知，綠原酸具有清除自由基、抗菌(王世寬等，2010)等多種功能，且綠原酸在醫(yī)藥和食品方面也有著廣泛的應用(Ilaiyaraja et al, 2015; 馬烽等，2010；王利等，2009)，加之我國目前對于綠原酸的開發(fā)利用水平遠低于發(fā)達國家(鄧良等，2005)，因此綠原酸供需缺口會持續(xù)相當長的時間。

工業(yè)化生產中，要獲得大量植物次生代謝產物，植物細胞培養(yǎng)技術是繼微生物發(fā)展技術之后的重要發(fā)展領域(李冬杰等，2003)。本研究希望通過細胞懸浮培養(yǎng)的方法，優(yōu)化培養(yǎng)條件以獲得灰氈毛忍冬“渝蕾1號”的主要次生代謝產物綠原酸。在優(yōu)化培養(yǎng)條件過程中，大多研究均是報道優(yōu)化培養(yǎng)過程中的基礎條件如pH、接種量、糖的種類或濃度、培養(yǎng)中激素組合等(Nagella et al,2010；李蕤等，2011)，也有不少的文章研究培養(yǎng)基的成分對代謝產物的影響。對灰氈毛忍冬“渝蕾1號”來說，基礎條件方面的優(yōu)化已經(jīng)研究過，本研究旨在前期研究的基礎上，進一步研究培養(yǎng)基成分，探究培養(yǎng)基中無機鹽成分對灰氈毛忍冬“渝蕾1號”懸浮培養(yǎng)體系中細胞生長和綠原酸積累的影響，為進一步提高綠原酸的含量提供相關的理論依據(jù)。由于灰氈毛忍冬“渝蕾1號”為新品種，以上研究沒有相關報道。

1材料與方法

1.1 材料

采自原產地重慶秀山縣苗圃園，經(jīng)宜賓學院魏琴教授鑒定為灰氈毛忍冬“渝蕾1號” (LoniceramacranthoidesHand.-Mazz. ‘Yulei 1’)。

1.2方法

1.2.1 懸浮培養(yǎng)體系的建立取灰氈毛忍冬“渝蕾1號”的幼嫩葉片為外植體，先將外植體用自來水連續(xù)沖洗1 h后，移至超凈工作臺，然后將外植體用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗2次，再用0.1%升汞溶液浸泡4 min，無菌水清洗4次，最后放置超凈工作臺上備用。接下來將材料用自來水連續(xù)接種到添加有2.0 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1NAA，pH為5.8的B5培養(yǎng)基中，25 ℃條件下自然光照培養(yǎng)。1月左右，將誘導出的愈傷組織進行多次繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)，直至愈傷組織比較松散。選取松散的愈傷組織作為懸浮培養(yǎng)的起始材料。經(jīng)過幾次懸浮培養(yǎng)后，建立了合適的懸浮培養(yǎng)體系。在培養(yǎng)體系中，準確稱取2.00 g懸浮培養(yǎng)細胞，接種于40 mL B5培養(yǎng)基中，最后轉移至(25±1)℃，16 h光周期，110 r·min-1搖床中震蕩培養(yǎng)。

1.2.2 B5培養(yǎng)基中主要礦質元素對“渝蕾1號”懸浮培養(yǎng)體系中細胞生長和綠原酸含量的影響首先考察不同NO3-/NH4+摩爾比值對細胞生長和綠原酸含量的影響。設計如下：保持總N量不變(27 mmol·L-1)，在去除無機氮源的B5+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA的懸浮培養(yǎng)體系中添加不同NO3-/NH4+摩爾比值(14∶0、13∶1、10∶4、5∶9、0∶14)，其中13∶1為B5培養(yǎng)基中的NO3-/NH4+摩爾比值，也為本實驗的對照。在2.1建立的懸浮培養(yǎng)體系中培養(yǎng)25 d后，檢測其生物量和綠原酸的含量。其次，考察單一添加NO3-或NH4+氮源對細胞生長和綠原酸含量的影響。設計如下：分別各自在去除無機氮源的B5+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA的懸浮培養(yǎng)基中添加不同濃度的(NH4)2SO4(0.033 5 g·L-1，0.067 g·L-1，0.134 g·L-1，0.268 g·L-1和0.536 g·L-1)和KNO3(0.5 g·L-1，1.5 g·L-1，2.5 g·L-1，5.0 g·L-1和8.0 g·L-1)，其中0.134 g·L-1(NH4)2SO4與2.5 g·L-1KNO3為B5培養(yǎng)基中各自的濃度，為本實驗的對照，在2.1建立的懸浮培養(yǎng)體系中培養(yǎng)25 d后檢測其生物量和綠原酸的含量。

1.2.3 H2PO4-、Ca2+、Mg2+分別在去除H2PO4-、Ca2+、Mg2+的B5+2.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA的懸浮培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaH2PO4·2H2O(0.05 g·L-1，0.10 g·L-1，0.15 g·L-1，0.20 g·L-1和0.25 g·L-1)、CaCl2(0.05 g·L-1，0.10 g·L-1，0.15 g·L-1，0.20 g·L-1和0.25 g·L-1)和MgSO4·7H2O(0.05 g·L-1，0.15 g·L-1，0.25 g·L-1，0.35 g·L-1和0.50 g·L-1)，值得指出的是，本實驗是以B5培養(yǎng)基中各自的濃度為對照(即0.15 g·L-1NaH2PO4·2H2O、0.15 g·L-1CaCl2以及0.25 g·L-1MgSO4·7H2O)，再分別在2.1建立的懸浮培養(yǎng)體系中培養(yǎng)25 d后檢測其生物量和綠原酸的含量。

1.3 生物量測定和綠原酸提取

25 d后將收獲的鮮重細胞于50 ℃烘箱中烘干至恒重，稱重并計算其生物量。將烘干的愈傷細胞粉碎過60目篩，精密稱取其中0.10 g于10 mL 60%的甲醇試管中并稱重，放入超聲波清洗儀中超聲萃取30 min，再用60%的甲醇補足其重量，取其上清液用于HPLC檢測綠原酸的含量。

1.4 HPLC檢測

HPLC檢測：Alltech C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm)；流動相甲醇∶醋酸水=22∶78(pH=2.6)；檢測波長328 nm；柱溫35 ℃；流速1 mL·min-1；進樣量10 μL。

1.5 數(shù)據(jù)分析

以上試驗3次平行，2次重復，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對所得試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差Duncan分析(P≤0.05)

2結果與分析

2.1 “渝蕾1號”愈傷組織和懸浮培養(yǎng)體系的建立

圖1:a為成功誘導的愈傷組織，從圖1:a可以看出，愈傷組織呈翠綠淡黃色，其長勢旺盛，比較松散，適宜作為懸浮的材料。圖1:b為在添加有2.0 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1NAA的 B5培養(yǎng)基中建立的懸浮體系，從圖1：b可以看出細胞呈淡黃色，且生長旺盛。

2.2 HPLC條件的建立

圖2表示HPLC檢測所獲得的色譜圖，圖2：a為樣品色譜圖；圖2：b為綠原酸標品色譜圖。從圖2：b可看出，主峰保留時間為6.29 min，標記為CA。通過比較，圖2：a和圖2：b主峰出峰時間是一致的，表明樣品中的主峰即為CA綠原酸。根據(jù)以上標準曲線，即可計算出樣品中綠原酸的含量。Wu(2007)曾報道過用高效液相色譜對杜仲懸浮體系中綠原酸含量定性以及定量， 測得的保留時間為13.97 min，這與我們的結果不太一致，可能是植物材料、不同的流動相和色譜柱長度不一致有關。

圖 1　“渝雷1號”愈傷組織與懸浮培養(yǎng)體系　a. 誘導出的愈傷組織； b. 建立的懸浮培養(yǎng)體系。Fig. 1　Induced callus and cell suspension cultures of “Yulei 1”　a. Induced callus; b. Established cell suspension cultures.

圖 2　綠原酸HPLC分析　a. 樣品HPLC色譜分析圖； b. 綠原酸標準品HPLC色譜分析圖。Fig. 2　 HPLC analysis of chlorogenic acid　a. Representative HPLC chromatogram of chlorogenic acid extracted from Lonicera macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei1” cell suspension culture； b. Representative HPLC chromatogram of chlorogenic acid standard.

2.3 NO3-/NH4+對“渝蕾1號”懸浮培養(yǎng)體系中細胞的生長和綠原酸含量的影響

從圖3可以看出，對生物量來說，當NO3-/NH4+低于13∶1時，細胞生物量呈現(xiàn)出逐漸遞增的趨勢，且各梯度之間差異性顯著；當NO3-/NH4+為13∶1(對照)時，其細胞生物量達到最大值，為17.93 g·L-1；而當NO3-/NH4+高于13∶1時，細胞生物量呈現(xiàn)出逐漸遞減的趨勢，差異性同樣顯著。這表明NO3-/NH4+的比值為13∶1時最適合懸浮細胞生長，這也正是B5培養(yǎng)基中NO3-/NH4+的比值。對于綠原酸含量來說，總體看來，隨著NO3-/NH4+比值的增加，綠原酸含量逐漸增加。當NO3-/NH4+達到14∶0時，綠原酸的含量達最大，為13.51 mg·g-1DW。當比值超過10∶4以后，綠原酸含量增加較為明顯，保持了較高的綠原酸含量。綜合細胞生物量和綠原酸含量兩個指標，得出NO3-/NH4+為13∶1時有利于積累，這和B5培養(yǎng)基中的含量是一致的。

圖 3　不同NO3- /NH4+比值對細胞生物量和綠原酸含量的影響　數(shù)據(jù)以平均值 ± 標準誤來表示，DW. 細胞生物量; CA. 綠原酸含量。下同。Fig. 3　Effects of different NO3-/ NH4+ ratios on cell biomass and chlorogenic acid production in cell suspension cultures　Data represents means ± SE, DW. Biomass accumulation; CA. Chlorogenic acid production. The same below.

2.4 NO3-對“渝蕾1號”懸浮體系中細胞生長和綠原酸含量的影響

由圖4可知，當KNO3濃度在1.5～5.0 g·L-1時，細胞生物量都維持了較高的生長量，且差異不顯著。當KNO3濃度在3.5 g·L-1時，細胞生物量達到最大值，為19.26 g·L-1。對于綠原酸的含量來說，在KNO3較低濃度(0.5 g·L-1和1.5 g·L-1)時，維持了較高的綠原酸含量，且當KNO3濃度在1.5 g·L-1時，綠原酸的含量達到最大值(18.48 mg·g-1DW)；當KNO3濃度高于1.5 g·L-1時，綠原酸的含量呈現(xiàn)出隨著KNO3濃度的增加而減少的趨勢，但各梯度之間差異性不顯著。可以得出，稍高于對照組濃度(2.5 g·L-1)的NO3-濃度有利于細胞的生長，稍低于對照組濃度的NO3-濃度有利于綠原酸的合成。

圖 4　不同濃度的KNO3對細胞生物量和綠原酸含量的影響Fig. 4　Effects of different concentrations of KNO3 on cell biomass and chlorogenic acid production in cell suspension cultures

2.5 單一無機氮源 NH4+對“渝蕾1號”懸浮體系中細胞生長和綠原酸含量的影響

由圖5可知，隨著 (NH4)2SO4濃度的增加，生物量逐漸增加，當其濃度達到0.268 g·L-1時，細胞生物量達最大值(10.18 g·L-1)，濃度進一步增加時，生物量略有減少，但各濃度梯度間差異不大。對于綠原酸的含量來說，當(NH4)2SO4濃度低于0.134 g·L-1(對照)時，綠原酸含量呈現(xiàn)出逐級遞減的趨勢，各濃度間差異顯著；但當(NH4)2SO4濃度高于0.134 g·L-1(對照)時，綠原酸含量呈現(xiàn)出逐級遞增的趨勢，各濃度間差異亦顯著。當(NH4)2SO4濃度在0.268 g·L-1時，綠原酸含量達到最大值，為9.17 mg·g-1DW。

圖 5　不同濃度的 (NH4)2SO4對細胞生物量和綠原酸含量的影響Fig. 5　Effects of different concentrations of (NH4)2SO4 on cell biomass and chlorogenic acid production in cell suspension cultures

圖 6　不同濃度的NaH2PO4·2H2O對細胞生物量和綠原酸含量的影響Fig. 6　Effects of different concentrations of NaH2PO4·2H2O on cell biomass accumulation and chlorogenic acid production in cell suspension cultures

2.6 H2PO4-對“渝蕾1號”懸浮體系中細胞生長和綠原酸含量的影響

由圖6可知，當NaH2PO4·2H2O濃度小于0.10 g·L-1時，細胞生物量隨NaH2PO4·2H2O濃度的增加而增加，且各濃度間差異顯著。當NaH2PO4·2H2O濃度為0.10 g·L-1時，細胞生物量達到最大值，為8.90 g·L-1。當NaH2PO4·2H2O濃度大于0.10 g·L-1時，細胞生物量隨NaH2PO4·2H2O濃度的增加而減少，各濃度間差異不大。對于綠原酸的含量來說，當NaH2PO4·2H2O濃度小于0.10 g·L-1時，綠原酸含量同樣隨NaH2PO4·2H2O濃度的增加而增加，各濃度間差異顯著；當NaH2PO4·2H2O濃度為0.10 g·L-1時，綠原酸含量達最大值，為15.16 mg·g-1DW；當NaH2PO4·2H2O濃度為0.15 g·L-1(對照)時，綠原酸的含量也較大，并和0.10 g·L-1之間沒有顯著差異?？梢缘贸?，當NaH2PO4·2H2O濃度為0.10 g·L-1時，生物量和綠原酸的積累均可達到最大值，是最適的濃度。

2.7 Ca2+對“渝蕾1號”懸浮體系中細胞生長和綠原酸含量的影響

由圖7可知，對于生物量來說，當濃度低于0.10 g·L-1時，細胞生物量隨CaCl2濃度的增加而增加，且差異顯著；當CaCl2濃度為0.10 g·L-1時，細胞生物量達到最大值(8.08 g·L-1)；當濃度高于0.10 g·L-1時，細胞生物量隨CaCl2濃度的增加而減少，除CaCl2濃度在0.10～0.25 g·L-1之間差異不顯著外，其他各濃度間差異均顯著。對于綠原酸的含量，當CaCl2濃度為0.05、0.10 和0.25 g·L-1時，綠原酸含量差異不大。當CaCl2濃度為0.20 g·L-1時，綠原酸含量達到最大值(11.46 mg·g-1DW)，與其它各濃度均保持顯著差異。因此，CaCl2濃度并非在對照濃度即0.15 g·L-1時生物量和綠原酸含量最高，而是稍有偏離。

圖 7　不同濃度的CaCl2對細胞生物量和綠原酸含量的影響Fig. 7　Effects of different concentrations of CaCl2 on cell biomass and chlorogenic acid production in cell suspension cultures

2.8 Mg2+對“渝蕾1號”懸浮體系中細胞生長和綠原酸含量的影響

由圖8可知，生物量和綠原酸的含量趨向于相反的走勢，對于生物量來說，隨著MgSO4·7H2O濃度的增加，生物量逐漸較少，且各梯度間差異基本不大，且在MgSO4·7H2O濃度為0.05 g·L-1時，達到最大值(7.28 g·L-1)；而對于綠原酸的含量，隨著MgSO4·7H2O的增加，綠原酸含量亦在增加，各濃度梯度間差異還是較為顯著，且在MgSO4·7H2O濃度為0.50 g·L-1時，達到最大值(15.92 mg·g-1DW)。特別值得一提的是，在本研究中，對Mg2+來說，低濃度促進生物量的積累，高濃度促進綠原酸的合成。兼顧細胞生物量和綠原酸含量，只能選擇適中的濃度，即與對照組(0.25 g·L-1)相差不大的濃度較為合適。

圖 8　不同濃度的MgSO4·7H2O對細胞生物量和綠原酸含量的影響Fig. 8　Effects of different concentrations of MgSO4·7H2O on cell biomass and chlorogenic acid production in cell suspension cultures

3討論

植物細胞培養(yǎng)中常用培養(yǎng)基成分區(qū)別主要在于無機鹽的種類和含量，而培養(yǎng)基成分又與植物細胞生長和次生代謝產物的形成有密切的關系，因此，在選擇培養(yǎng)基時，既要考慮培養(yǎng)基的種類，更要注重無機鹽的種類及含量，尤其是總氮水平、氮源種類及比例，還有K、P、Ca、Mg等大量元素的含量等(李玉平等，2010)。本研究從無機總氮水平、無機氮源種類及比例、P、Ca、Mg濃度等方面，探究其對灰氈毛忍冬“渝蕾1號”懸浮培養(yǎng)體系中生物量和綠原酸含量的影響，旨在優(yōu)化培養(yǎng)條件，為工業(yè)化生產其次生代謝產物——綠原酸打下基礎。實驗結果表明，在總氮源方面，保持總N量27 mmol·L-1不變，NO3-/NH4+摩爾比值為B5培養(yǎng)基中NO3-/NH4+摩爾比值13∶1(即對照)時，即NO3-遠多余NH4+，細胞的生物量和綠原酸含量都比較高，原因可能如李莉等(2006)研究一樣。李莉等(2006)研究表明，當過量的氨存在以及在較高pH條件下，苯丙氨酸解氨酶(PAL)能逆向催化代謝，不利于植物綠原酸代謝體系的進行，這或許就是較低濃度的NH4+比較適合目標產物綠原酸合成的原因。高日等(2011)研究發(fā)現(xiàn)，在MS培養(yǎng)基中硝態(tài)氮比銨態(tài)氮更有益于人參細胞皂苷的合成，這與本研究結果基本一致。Yin et al(2013)發(fā)現(xiàn)，保持60 mmol·L-1總無機氮源不變，當 NO3-/NH4+為2∶1時，有利于柳錢屬植物細胞的生長和三萜類化合物的積累，這與本研究結果稍有差異，可能與物種有關。單一氮源的研究中，對硝態(tài)氮來說，NO3-濃度稍高于對照組(2.5 g·L-1)時有利于細胞的生長，稍低于對照組時有利于綠原酸的合成。對銨態(tài)氮來說，當(NH4)2SO4濃度高于0.134 g·L-1(對照)時，綠原酸含量呈現(xiàn)出逐級遞增的趨勢。可見單一氮源和復合氮源之間的結果差異較大。對于P、Ca、Mg離子濃度的選擇，本研究表明均應考慮適中濃度(即0.1 g·L-1NaH2PO4·2H2O、0.20 g·L-1CaCl2與0.25 g·L-1MgSO4·7H2O)。李玉平等(2010)報道，適中濃度的H2PO4-(5 mmol·L-1)有利于大花金挖耳細胞生長和黃酮的合成；Yin et al(2013)也報道，適中濃度的KH2PO4(1.25 mmol·L-1)、CaCl2(2 mmol·L-1)均有利于柳錢屬植物細胞的生長和三萜類化合物的積累，這與本研究結果一致。但也有不同的研究結果，如Remya et al(2013)研究表明，在地錢細胞懸浮培養(yǎng)產黃酮的體系中，加入不同濃度的Ca或Mg都不能使細胞生物量和黃酮產量有顯著變化。另外，高永超等(2003)在大量元素對牛角蘚愈傷組織懸浮細胞的研究中指出，大量元素明顯促進細胞的生長發(fā)育，大量元素濃度越高，促進作用越明顯。以上結果表明不同植物對于Ca或Mg的吸收有差異，從而造成次生代謝產物積累有所不同?？傊?，植物在生長發(fā)育過程中，無機鹽是必不可少的一大營養(yǎng)成分，對于不同的植物材料，需要進行具體的研究，得到的結果也千差萬別。本研究對灰氈毛忍冬“渝蕾1號”懸浮培養(yǎng)體系中的主要無機元素進行了探索，旨在獲得更高產量的綠原酸，為綠原酸的生產化打下基礎。

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Effects of different species of inorganic salt on the chlorogenic acid content and the growth of cell in suspension cultures ofLoniceramacranthoidesHand.-Mazz. “Yulei 1”

TANG Ming， WANG Chao， TAN Yun-Ya， LI Qun*

(CollegeofLifeSciences，SichuanNormalUniversity, Chengdu 610101， China )

Abstract:In order to improve the content of chlorogenic acid in cell suspension cultures of Lonicera macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei 1”, this paper discussed that the different species of inorganic salt had many effects on the chlorogenic acid content and growth of cell in suspension cultures of L. macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei 1”. We weighed the biomass of the L. macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei 1” cells and analyzed the content of chlrogenic acid by HPLC through the additions of different concentrations of inorganic salt in cell suspension cultures of L. macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei 1”. The result showed that the optimal NO3-/NH4+ratio was consisted with NO3-/NH4+(nitrate nitrogen/ammonium nitrogen) ratio in B5medium. In other words, the suspension culture would be benefitial for the accumulation of chlorogenicacid and growth of cell when NO3-/NH4+(nitrate nitrogen/ ammonium nitrogen) ratio was 13∶1. When single N source was added, the biomass of callus reached the maximum (19.26 g·L-1) in 3.5 g·L-1KNO3. However, when KNO3 concentration was at relatively low levels (0.5 and 1.5 g·L-1), high chlorogenic acid production was accumulated. The two studies of NO3-had some differences from the control concentration (2.5 g·L-1). What’s more, while (NH4)2SO4 concentration (0.268 g·L-1) exceeded control concentration (0.134 g·L-1), the highest growth of biomass of the L. macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei 1” and the high chlorogenic acid production were observed. In the same way, different species and different concentrations of P, Ca and Mg might have different impacts on the chlorogenic acid content and growth of cell. The result showed that when the highest growth of biomass and the high chlorogenic acid production were accumulated, when NaH2PO4·2H2O concentration was 0.10 g·L-1. In addition, when the highest growth of biomass and the high chlorogenic acid production were accumulated, when CaCl2concentration was 0.20 g·L-1. So far as Mg2+was concerned, a low MgSO4·7H2O concentration could promote the growth of cell, while excessive MgSO4·7H2O concentration would promote the accumulation of chlorogenic acid. Taking the biomass growth and chlorogenic acid production into consideration, the optimal concentration of Mg was moderate. These results had some differences from the control. Our study demonstrated that inorganic salt concentration had some differences from inorganic salt concentration of B5 in suspension cultures of L. macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei 1”. This study suggested that the optimized conditions could improve biomass accumulation and chlorogenic acid production through the addition of moderate concentration of inorganic salt in cell suspension cultures of L. macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei 1”. These results lays a foundation for large-scale production of chlorogenic acid by using the cell suspension cultures of L. macranthoides Hand.-Mazz. “Yulei 1”. This study also has practical significance to large-scale productions of chlorogenic acid.

Key words:Lonicera macranthoides Hand. -Mazz. “Yulei 1”, suspension culture, chlorogenic acid, HPLC, inorganic salt

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201412035

收稿日期:2014-12-23修回日期： 2015-01-15

基金項目：四川省教育廳成果培育項目(12ZZ009)[Supported by the Achievement Cultivation Program of Education Office of Sichuan Province(12ZZ009)]。

作者簡介：唐明(1988- )，男，甘肅人，在讀碩士研究生，主要從事細胞生物學研究，(E-mail)1326665453@qq.com。*通訊作者： 李群，博士，副教授，研究生導師，主要從事植物細胞工程方面的研究，(E-mail)Liqun01234@163.com。

中圖分類號：Q943.1

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)05-0582-07

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