邢文峰，肖　莉

解放軍第一九八醫(yī)院，湖南 郴州 423000

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*通信作者

HPLC梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定壯血藥酒中4種成分的含量

邢文峰*，肖莉

解放軍第一九八醫(yī)院，湖南 郴州 423000

[摘要]目的建立同時(shí)測(cè)定壯血藥酒中新北美圣草苷、柚皮苷、補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯4個(gè)主要成分含量的高效液相色譜檢測(cè)方法。方法采用依利特C18柱；流動(dòng)相A為乙腈-甲醇(1∶2)，流動(dòng)相B為0.4%冰醋酸溶液，梯度洗脫；流速為1.1 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)λ1=283 nm (新北美圣草苷和柚皮苷)，λ2=222 nm (補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯)。結(jié)果在優(yōu)化的色譜條件下，新北美圣草苷、柚皮苷、補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的線性范圍分別為6.52～130.40 μg/mL (r=0.999 7)、6.61～132.20 μg/mL (r=0.999 3)、6.75～135.00 μg/mL (r=0.999 6)、4.05～81.00 μg/mL (r=0.999 9)；4種成分的平均加樣回收率(n=6)分別為96.94%、99.14%、98.09%、96.87%，RSD分別為0.75%、0.52%、1.18%、1.02%。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便快捷，回收率、重復(fù)性良好，可用于壯血藥酒中新北美圣草苷、柚皮苷、補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的含量分析。

[關(guān)鍵詞]壯血藥酒；新北美圣草苷；柚皮苷；補(bǔ)骨脂素；佛手柑內(nèi)酯

0引言

壯血藥酒是治療貧血、病后體質(zhì)虛弱、腰膝酸痛、婦女帶下、月經(jīng)不調(diào)等癥狀的中藥復(fù)方制劑，現(xiàn)收載于部頒標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第5冊(cè)[1]，由骨碎補(bǔ)、五指毛桃、當(dāng)歸、黑老虎、何首烏(制)、白術(shù)(炒)、雞血藤、甘草(炙)等加工而成，具有補(bǔ)氣血、通經(jīng)絡(luò)、壯筋骨、健脾胃的功效。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)方中當(dāng)歸進(jìn)行了薄層色譜定性，未對(duì)方中任何藥味進(jìn)行定量，經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)對(duì)壯血藥酒中所含成分進(jìn)行定量的報(bào)道，本研究首次對(duì)壯血藥酒藥材骨碎補(bǔ)[2]和五指毛桃[3]中新北美圣草苷、柚皮苷、補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯進(jìn)行定量研究，建立了同時(shí)測(cè)定4種成分的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1儀器與試藥

安捷倫1200型HPLC色譜儀；VS-100UE型恒溫超聲波提取機(jī)；XS205DU型十萬(wàn)分之一電子天平；柚皮苷對(duì)照品(批號(hào)：110722-201312，含量以94.7%計(jì)，常溫干燥、密閉遮光保存，使用前無(wú)需處理)、補(bǔ)骨脂素(批號(hào)：110739-201416，含量以99.9%計(jì)，常溫保存)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；新北美圣草苷對(duì)照品(批號(hào)：13241-32-2，含量以98.0%計(jì))、佛手柑內(nèi)酯(批號(hào)：484-20-8，含量以98.9%計(jì))由上海同田生物技術(shù)股份有限公司提供；壯血藥酒(每瓶裝75 mL；批號(hào)：140235、140276、140291)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)馮了性(佛山)藥業(yè)有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，冰醋酸為分析純，水為重蒸餾水。

2方法

2.1色譜條件采用依利特C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為乙腈-甲醇(1∶2)，流動(dòng)相B為0.4%冰醋酸溶液，按表1進(jìn)行梯度洗脫[4-9]；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～29 min，λ1=283 nm[10-12]，29～50 min，λ2=222 nm[13]；流速采用1.1 mL/min；柱溫采用25 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

表1　流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2對(duì)照品溶液的配制方法

2.2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備分別稱取對(duì)照品新北美圣草苷、柚皮苷、補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯適量，分別加50%乙醇溶解并稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為0.652、0.661、0.675、0.405 mg/mL單一成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2混合對(duì)照品溶液的制備按上述4種對(duì)照

品儲(chǔ)備液順序，分別依次吸取2.5、5.0、1.0、2.0 mL，用50%乙醇溶液稀釋，制成每1 mL分別含新北美圣草苷、柚皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯32.6、66.1、13.5、16.2 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3樣品溶液的制備方法

2.3.1樣品溶液的制備精密吸取壯血藥酒6.0 mL，置于50 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液稀釋至刻度，振搖均勻，微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為樣品溶液備用。

2.3.2陰性對(duì)照溶液的制備按照部頒標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第5冊(cè)壯血藥酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的處方工藝，分別制備不含骨碎補(bǔ)、五指毛桃的樣品，按照文中“2.3.1”項(xiàng)下樣品溶液的制備方法分別制備成骨碎補(bǔ)、五指毛桃空白溶液。

2.4線性關(guān)系考察分別精密吸取上述制備的對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，將其分別置于10 mL量瓶中，用50%乙醇稀釋成系列濃度的混合對(duì)照品溶液，在上述的色譜條件下，分別進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行測(cè)定，記錄新北美圣草苷、柚皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯的峰面積，以峰面積Y為縱坐標(biāo)、對(duì)照品質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程、線性范圍及r值見(jiàn)表2。

表2　線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3方法學(xué)考察

3.1專屬性試驗(yàn)分別精密吸取樣品溶液、混合對(duì)照品溶液、骨碎補(bǔ)空白溶液和五指毛桃空白溶液，參照上述色譜條件各進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰。結(jié)果顯示，在該色譜條件下，按保留時(shí)間先后的出峰順序-新北美圣草苷、柚皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯，樣品溶液和混合對(duì)照品溶液所測(cè)的新北美圣草苷、柚皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯的保留時(shí)間一致；空白樣品在對(duì)照品相應(yīng)位置處未呈現(xiàn)吸收峰。結(jié)果表明，處方中其他藥物對(duì)所測(cè)成分的測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

3.2精密度試驗(yàn)精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液20 μL，參照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄新北美圣草苷、柚皮苷、補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，新北美圣草苷為1.25%、柚皮苷為0.67%、補(bǔ)骨脂素為0.84%、佛手柑內(nèi)酯為1.08%。

3.3重復(fù)性試驗(yàn)按壯血藥酒樣品含量測(cè)定方法，對(duì)同一批號(hào)(批號(hào)：140235)的6份壯血藥酒樣品進(jìn)行測(cè)定，記錄新北美圣草苷、柚皮苷、補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果新北美圣草苷、柚皮苷、補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯峰面積的RSD依次為1.46%、0.38%、0.94%、1.13%，表明本研究的檢驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批號(hào)的壯血藥酒樣品(批號(hào)：140235)的同一樣品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示，新北美圣草苷、柚皮苷、補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的RSD分別為0.98%、0.42%、0.87%、1.51%，表明24 h內(nèi)樣品溶液的穩(wěn)定性良好。

圖1　新北美圣草苷、柚皮苷、補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的HPLC

3.5加樣回收率試驗(yàn)取9份已知含量的壯血藥酒(批號(hào)：140235；新北美圣草苷為0.289 mg/mL、柚皮苷為0.561 mg/mL、補(bǔ)骨脂素為0.107 mg/mL、佛手柑內(nèi)酯為0.132 mg/mL)適量，精密量取3.0 mL，置于50 mL容量瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品溶液20、25、30 mL各3份，用50%乙醇溶液稀釋至刻度，振搖均勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為加樣樣品試液。參照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，計(jì)算各組分回收率，結(jié)果上述成分的平均加樣回收率(n=6)分別為96.94%、99.14%、98.09%、96.87%，RSD分別為0.75%、0.52%、1.18%、1.02%。

4樣品測(cè)定

取3個(gè)不同批號(hào)的壯血藥酒樣品，參照“2.3.1”項(xiàng)下制備樣品溶液的處理方法，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析、測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg/mL)

5討論

5.1流動(dòng)相的選擇分別采取乙腈-水[6,13]、甲醇-水[7]、乙腈-0.4%冰醋酸溶液[4]、甲醇-0.2%磷酸溶液[9]、乙腈-甲醇(1∶2)與0.4%冰醋酸溶液不同比例梯度洗脫，通過(guò)對(duì)各色譜峰的保留時(shí)間、峰形和分離度效果的對(duì)比，優(yōu)選出最佳的檢測(cè)用流動(dòng)相，結(jié)果表明，在乙腈-甲醇(1∶2)與0.4%冰醋酸溶液為流動(dòng)相按照文中比例洗脫時(shí)，各色譜峰的分布、峰形和分離度效果最佳，故選取乙腈-甲醇(1∶2)與0.4%冰醋酸溶液為壯血藥酒中新北美圣草苷、柚皮苷、補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯同時(shí)測(cè)定的流動(dòng)相。

5.2多組分同時(shí)測(cè)定中藥制劑的活性成分含量是反映其有效性的重要指標(biāo)，壯血藥酒現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)處方中當(dāng)歸進(jìn)行了薄層色譜定性研究，未對(duì)所含成分進(jìn)行定量測(cè)定，本研究建立的壯血藥酒中新北美圣草苷、柚皮苷、補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯含量測(cè)定方法，可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)處方中多味藥材、多個(gè)指標(biāo)成分的定量測(cè)定，不僅方法簡(jiǎn)便、可靠，且對(duì)其他含類似成分的中成藥質(zhì)量控制也具有借鑒作用。

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High-performance liquid chromatography for simultaneous determination of four components in zhuangxue yaojiu

XING Wen-fen*,XIAO Li

(the People′s Liberation Army 198 Hospital,Chenzhou 423000,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a high-performance liquid chromatography (HPLC) method for the simultaneous determination of four main components (neoeriocitrin,naringin,psoralen and bergapten) in zhuangxue yaojiu.MethodsThe HPLC separation was performed on an Hypersil C18column eluted,with a mobile phase consisting of acetonitrile-methanol (1∶2) as mobile phase A,and 0.4% acetic acid glacial solution as mobile phase B.The flow rate was 1.1 mL/min.The column temperature was at 25 ℃.Neoeriocitrin and naringin were detected at 283 nm,and psoralen and bergapten were detected at 222 nm.ResultsThe chromatographic peaks of 4 main components and the corresponding spectra were ideal under the optimal conditions.Neoeriocitrin,naringin,psoralen and bergapten had good linearity at 6.52～130.40 μg/mL (r=0.999 7),6.61～132.20 μg/mL (r=0.999 3),6.75～135.00 μg/mL (r=0.999 6),4.05～81.00 μg/mL(r=0.999 9),and the average recoveries and RSD were 96.94% (0.75%),99.14% (0.52%),98.09% (1.18%) and 96.87% (1.02%),respectively.ConclusionThe method is simple,economical and accurate with good reproducibility for the determination of neoeriocitrin,naringin,psoralen and bergapten.

Key words：Zhuangxue yaojiu;Neoeriocitrin;Naringin;Psoralen;Bergapten

收稿日期：2015-08-24

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201604025