張小東，沈　怡，劉子琦，徐　偉，單　華，姜　北（大理大學(xué)藥物研究所，云南大理　671000）

?

滇西地區(qū)29種藥用植物抗氧化活性研究

張小東，沈怡，劉子琦，徐偉，單華，姜北*
（大理大學(xué)藥物研究所，云南大理671000）

［摘要］目的：研究滇西地區(qū)29種藥用植物提取物體外抗氧化活性。方法：將植物樣品用75%乙醇和水依次進(jìn)行提取，采用DPPH法測定各供試樣品清除自由基的能力，以IC50值評價其活性。結(jié)果：在29種藥用植物樣品中，臭靈丹、滇白珠、反瓣老鸛草、午香草、昆明山海棠、大紅袍、朝天罐、腫柄菊、滇黃芩等9種植物相關(guān)供試樣品具有很好的抗氧化活性，其中反瓣老鸛草地下部分醇提物活性極好，IC50值僅為（4.1±0.1）μg/mL，好于陽性對照物維生素C。結(jié)論：反瓣老鸛草等9種植物顯示出較好的抗氧化活性，具有進(jìn)一步研究開發(fā)潛力與抗氧化藥用價值。

［關(guān)鍵詞］藥用植物；抗氧化；DPPH；粗提物

［DOI］10.3969/j.issn.1672-2345.2016.02.001

云南地貌復(fù)雜、地理位置特殊，既處于泛北極植物區(qū)和熱帶植物區(qū)的過渡區(qū)，又處于中國—喜馬拉雅森林植物亞區(qū)和中國—日本森林植物亞區(qū)的過渡區(qū)〔1〕，使得該地區(qū)尤其是云南西部藥用植物資源異常豐富，其中很多植物有著不可忽視的藥用價值，且多未進(jìn)行過系統(tǒng)的研究或活性測試〔2-3〕?，F(xiàn)代研究已證實，自由基清除劑及天然抗氧化劑，對于機體保護、防止老化，以及多種疾病的防治等均有十分重要的作用，因此近年來相關(guān)研究備受關(guān)注〔4-7〕。為深入了解滇西地區(qū)藥用植物的價值，本實驗采用DPPH法，對云南滇西地區(qū)29種藥用植物不同極性溶劑的提取物進(jìn)行抗氧化活性研究，以期為深入研究相關(guān)機制提供依據(jù)，為合理開發(fā)利用該地區(qū)藥用植物提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1植物樣品益母草Leonurus japonicus、臭靈丹Laggera pterodonta、土牛膝Achyranthes aspera、滇白珠Gaultheria leucocarpa var. yunnanensis、刺花蓮子草Alternanthera pungens、金蕎麥Fagopyrum dibotrys、鳳仙花Impatiens balsamina、苦參Sophora flavescens、馬尾黃連Thalictrum finetii、秧草Juncus setchuensis、云南繁縷Stellaria vestita、大王馬先蒿Pedicularis rex、匍匐風(fēng)輪菜Clinopodium repens、茜草Rubia cordifolia、腫柄菊Tithonia diversifolia、拔毒散Sida szechuensis、高河菜Megacarpaea delavayi、竹葉柴胡Bupleurum marginatum、滇黃芩Scutellaria amoena、反瓣老鸛草Geranium refractum、西南蠅子草Silene delavayi、午香草Anaphalis bulleyana、昆明山海棠Tripterygium hypoglaucum、犁頭尖Typhonium di?varicatum、朝天罐Osbeckia opipara、大紅袍Campylot?ropis hirtella、橢圓葉花錨Halenia elliptica、鐘花韭Al?lium kingdonii、曲苞芋Gonatanthus pumilus等29種藥用植物于2013—2014年間采自云南大理、臨滄、麗江等地區(qū)，由大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院姜北教授、張德全博士鑒定；植物標(biāo)本存放于大理大學(xué)藥化學(xué)院姜北教授研究組。植物樣品相關(guān)信息。見表1。

表1　29種植物樣品抗氧化實驗結(jié)果（±s，n=3）

表1　29種植物樣品抗氧化實驗結(jié)果（±s，n=3）

植物Vit C益母草(全株)臭靈丹(全株)土牛膝(全株)滇白珠(地上)刺花蓮子草(地上)金蕎麥(全株)鳳仙花(全株)苦參(地上)苦參(地下)馬尾黃連(全株)秧草(全株)云南繁縷(地上)大王馬先蒿(全株)匍匐風(fēng)輪菜(全株)朝天罐(全株)大紅袍(根莖)科名唇形{ 菊{(diào) 莧{杜鵑花{ 莧{ 蓼{鳳仙花{ 豆{ 豆{毛茛{燈心草{石竹{玄參{唇形{野牡丹豆粗提物―乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水甲醇甲醇IC50/ (μg/mL) 12.3±0.3 74.3±1.0 347.6±9.4 19.7±0.5 71.0±1.4 363.3±23.4 521.1±42.0 12.4±0.4 63.2±1.2 268.1±18.1 2 040.5±40.0 49.2±0.9 277.8±8.4 97.9±6.5 1 819.0±272.0 103.6±1.2 319.0±4.7 334.9±5.0無活性78.0±1.3 ＞2 500.0 57.9±0.4 442.6±7.1 400.7±21.6 1 950.0±40.0 49.9±3.1 86.3±1.5 69.8±4.2 57.4±1.0 11.5±0.2 10.6±0.1植物Vit C茜草(全株)腫柄菊(地上)拔毒散(全株)高河菜(地上)竹葉柴胡(全株)滇黃芩(地上)滇黃芩(地下)反瓣老鸛草(地上)反瓣老鸛草(地下)西南蠅子草(全株)午香草(地上)昆明山海棠(地上)犁頭尖(全株)曲苞芋(全株)橢圓葉花錨(全株)鐘花韭(全株)科名茜草{ 菊{(diào)錦葵{十字花{傘形{唇形{唇形{牻牛兒苗{牻牛兒苗{石竹{ 菊{(diào)衛(wèi)矛{天南星{天南星{龍膽百合粗提物―乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水乙醇水甲醇甲醇IC50/ (μg/mL) 12.3±0.3 69.5±1.5無活性19.3±0.0 65.5±0.3 58.6±1.8 68.9±0.9 98.0±3.7無活性53.3±1.0 408.0±56.3 18.9±0.5 374.2±8.5 21.0±0.2 81.9 10.2±0.3 18.4±0.4 4.1±0.1 11.5±0.3 89.2±3.4 353.3±18.2 12.3±0.6 59.4±0.2 9.1±0.4 18.0±0.1 66.3±1.1無活性80.7無活性75.2±0.4無活性

1.1.2試劑DPPH（1，1-二苯基-2-苦基苯肼；Al?drich Chem. Co，USA，批號：D21，140-0）；維生素C （Vit C）（AR，上?；瘜W(xué)試劑分裝廠，批號：84-01-10）；甲醇（AR，重慶川江化學(xué)試劑公司）。

1.1.3儀器多功能酶標(biāo)儀（BIO-RAD公司生產(chǎn)，Synergy HT型）；電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)，AL204型）；可調(diào)式混勻儀（大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司生產(chǎn)，MX-S型）；超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，SB-25-12DT型）。

1.2方法

1.2.1植物粗提物干粉的提取取約50 g干燥的植物樣品，粉碎，用75%乙醇回流提取3次，第1次1 h，后兩次1.5 h，每次溶劑約250 mL。將3次提取的溶液合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45℃下除去大部分溶劑，之后轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機上充分干燥。經(jīng)75%乙醇提取過的植物殘渣繼續(xù)用水回流提取，共計3次，時間和溶劑劑量與醇提一致，合并提取液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃下蒸餾近干，之后轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機上充分干燥。

1.2.2供試品及Vit C溶液的配制精確稱取Vit C及各個植物樣品粗提物5 mg左右，溶解在0.5 mL超純水中，然后用超純水按比例（1∶5）稀釋成終濃度為2 500、500、100、20、4、0.8 μg/mL的樣品溶液系列濃度溶液備用，配制過程中使用超聲儀進(jìn)行超聲后，每次加樣前都用渦旋器進(jìn)行混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3DPPH法

1.2.3.1DPPH溶液的配制精密稱量10 mg DPPH，用甲醇溶解后，移入250 mL容量瓶中，定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為40 mg/L的DPPH儲備液，避光置于4℃冰箱備用。

1.2.3.2DPPH自由基清除率的測定在96孔培養(yǎng)板上依次從低到高加入6個濃度的樣品各50 μL，然后向上述每個孔中快速準(zhǔn)確地加入150 μL DPPH液，混勻，于37℃恒溫箱中放置30 min后，在酶標(biāo)儀517 nm處測定吸光度；同時設(shè)置空白對照（50 μL超純水與150 μL DPPH）及陽性對照（50 μL Vit C與150 μL DPPH）。根據(jù)下面的公式計算供試品和Vit C對DPPH吸光度的百分抑制率〔8-11〕。

I（%）=［（Ablank－Asample）/ Ablank］×100%

1.2.3.3清除50%自由基時供試品濃度（IC50）的計算實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2003進(jìn)行處理，以供試品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，DPPH自由基清除率I（%）為縱坐標(biāo)，繪制散點圖和清除率曲線，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)通過線性回歸分析求得線性回歸方程，根據(jù)回歸方程計算IC50值。

2　結(jié)果

按上述方法對29種植物的粗提物進(jìn)行了抗氧化活性測試。見表1。

根據(jù)DPPH法檢測標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)IC50≤50 μg/mL時說明樣品具有較強的抗氧化活性。29種藥用植物中，臭靈丹（全株）的乙醇提取物、滇白珠（全株）的乙醇提取物、反瓣老鸛草地上與地下提取物、午香草（全株）的乙醇提取物、昆明山海棠提取物、大紅袍（根莖）甲醇提取物、朝天罐（全株）甲醇提取物、腫柄菊（地上）乙醇提取物、滇黃芩地上與地下乙醇提取物等具有較好的DPPH抗氧化活性，其中反瓣老鸛草地下部分的乙醇提取物活性極好，IC50值達(dá)到了（4.1±0.1）μg/mL。用SPSS17.0軟件對反瓣老鸛草（地下）的乙醇提取物的抗氧化活性與陽性對照Vit C進(jìn)行t檢驗，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3　討論

近年來自由基生物學(xué)快速發(fā)展，廣泛觸及生命科學(xué)領(lǐng)域，主要探究自由基的組成、清除和自由基對生物學(xué)系統(tǒng)的損害。目前已明確許多自由基造成的疾病機理，如癌癥、神經(jīng)變性、慢性抑郁癥、動脈粥樣硬化和生理學(xué)衰老等。抗氧化劑具有清除人體自由基及疾病防治的作用〔12-15〕，對人體健康十分有益，已廣泛應(yīng)用于食品、藥品工業(yè)中〔16-18〕。體外評價和篩選樣品抗氧化活性的方法很多，其中DPPH法具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點，已被廣泛用于自由基清除能力的定量分析。

本文利用DPPH方法對滇西地區(qū)29種藥用植物進(jìn)行了體外抗氧化活性研究，發(fā)現(xiàn)了多種藥用植物提取物對DPPH自由基具有很好的清除作用，其中反瓣老鸛草地下部分提取物具有極好的抗氧化能力，是很好的天然抗氧化植物樣品。本研究為進(jìn)一步探討滇西地區(qū)藥用植物抗氧化作用、追蹤活性成分、開發(fā)利用天然抗氧化物質(zhì)提供了依據(jù)。

［參考文獻(xiàn)］

〔1〕邱斌，吳其國，李學(xué)芳，等.云南特有植物姜狀三七的生藥學(xué)研究〔J〕.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，37（2）：34-37.

〔2〕彭朝忠，張麗霞，高愛農(nóng)，等.瀾滄藥用植物資源研究〔J〕.植物遺傳資源學(xué)報，2011，12（4）：557-561.

〔3〕楊再清，熊紹芳.淺論迪慶藥用植物資源的開發(fā)利用〔J〕.云南農(nóng)業(yè)，2008（12）：30-31.

〔4〕TASO R，DENG Z Y. Seperation procedures for naturally occurring antioxidant phytochemicals〔J〕. Journal Chroma?tography B，2004（812）：85-99.

〔5〕呂娜.抗氧化食品的研究進(jìn)展〔J〕.產(chǎn)業(yè)與科技論壇，2014，13（19）：101-102.

〔6〕閔紅巍，劉克敏，顧蕊，等.自由基清除劑預(yù)防創(chuàng)傷性異位骨化的實驗研究〔J〕.中國康復(fù)理論與實踐，2015，21 （4）：422-425.

〔7〕孟成金.自由基清除劑在急性腦出血的應(yīng)用分析〔J〕.心血管病防治知識，2015（1）：30-31.

〔8〕孫麗萍，王大仟，張智武. 11種天然植物提取物對DPPH自由基的清除作用〔J〕.食品科學(xué)，2009，30（1）：45-47.

〔9〕LOCATELLI M，GINDRO R，TRAVAGLIA F，et al. Study of the DPPH scavenging activity：Development of a free software for the correct interpretation of date〔J〕. Food Chemistry，2009，114（3）：889-897.

〔10〕GUIL G J L，MARTINEZ G C，REBOLLOSO F M M，et al. Nutrient composition and antioxidant activity of 10 pepper （Capsicum annuun）varieties〔J〕. European Food Research and Technology，2006，224（1）：1-9.

〔11〕韋獻(xiàn)雅，殷麗琴，鐘成，等. DPPH法評價抗氧化活性研究進(jìn)展〔J〕.食品科學(xué)，2014，35（9）：317-322.

〔12〕郝一文，徐煥明，程大也，等.抗氧化劑在保護造血干細(xì)胞生物學(xué)功能方面的作用〔J〕.中國實驗血液學(xué)雜志，2014，22（1）：142-147.

〔13〕張懿，倪鎏達(dá).抗氧化劑對腫瘤放化療療效的影響〔J〕.肝臟，2014，19（2）：144-146.

〔14〕單孔榮，李林妍.外用抗氧化劑復(fù)合物對人體皮膚光損傷的作用〔J〕.吉林醫(yī)學(xué)，2015，36（11）：2291-2292.

〔15〕崔志勇.外源性抗氧化劑的補充對運動性疲勞的影響〔J〕.科技通報，2015，31（6）：13-15.

〔16〕劉榮，鄭旭煦，殷鐘意.天然抗氧化劑在植物油脂中的應(yīng)用研究進(jìn)展〔J〕.重慶工商大學(xué)學(xué)報，2015，32（10）：43-47.

〔17〕張海霞.天然抗氧化劑茶多酚在食品貯藏保鮮中的應(yīng)用〔J〕.食品安全導(dǎo)刊，2015（30）：137-138.

〔18〕常小潔.碳納米管載藥在提高抗氧化劑療效方面的研究〔D〕.復(fù)旦大學(xué)，2014.

（責(zé)任編輯毛本勇）

Research on Antioxidant Activity of 29 Herbal Medicines from West Yunnan

Zhang Xiaodong, Shen Yi, Liu Ziqi, Xu Wei, Shan Hua, Jiang Bei*
（Institute of Materia Medica, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China）

〔Abstract〕Objective: To evaluate the antioxidant activity of 29 herbal medicines from West Yunnan. Methods: The 29 medicinal plants were extracted with 75% ethanol and water successively. DPPH assay were used to measure the antioxidant activity in vitro, and the results were expressed as IC50values. Results: Nine plants, including Laggera pterodonta, Gaultheria leucocarpa, Geranium refractum, Anaphalis bulleyana, Tripterygium hypoglaucum, Campylotropis hirtella, Osbeckia opipara, Tithonia diversifolia, and Scutellaria amoena, had strong antioxidant activity. Among them, the ethanol extract of the underground part of G. refractum showed significant activity with an IC50value（4.1±0.1）μg/mL which was better than the IC50value of positive control-vitamin C. Conclusion: Nine plants had antioxidant activity and revealed the potential for further study and development with medicinal purpose.

〔Key words〕herbal medicines; antioxidant; DPPH; crude extract

［中圖分類號］R28

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章標(biāo)號］1672-2345（2016）02-0001-04

［基金項目］國家自然科學(xué)基金資助項目（81460532）

［收稿日期］2015-04-28［修回日期］2015-05-26

［作者簡介］張小東，碩士研究生，主要從事藥理學(xué)研究.

*通信作者：姜北，教授，博士.