史子學，趙曉明，唐賽涌，曹傳閨，肖耀明，莊建萍，卞 益，朱?？?，費瓊慧（.上海市嘉定區(qū)農業(yè)委員會，上海 嘉定 0800；.上海市嘉定區(qū)動物疫病預防控制中心，上海 嘉定 0800）

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應用ISSR-PCR技術鑒別梅山豬肉及其肉制品的研究

史子學1，趙曉明2，唐賽涌2，曹傳閨2，肖耀明2，莊建萍2，卞 益2，朱?？?，費瓊慧1
（1.上海市嘉定區(qū)農業(yè)委員會，上海 嘉定 201800；2.上海市嘉定區(qū)動物疫病預防控制中心，上海 嘉定 201800）

摘 要：為解決涉及梅山豬及其肉制品的假冒銷售糾紛，有效保護梅山豬地方品種的市場地位和品牌形象，研究了ISSR-PCR方法鑒別梅山豬及其肉制品的引物及其方法，通過比較PCR指紋圖譜，能特異性鑒別梅山豬肉。

關鍵詞：ISSR-PCR；梅山豬肉；鑒別；指紋圖譜

梅山豬原產(chǎn)于太湖流域的上海市嘉定、寶山、松江等區(qū)縣和江蘇的昆山、太倉等市縣，是太湖豬中的典型代表，有肉質好、耐粗飼、抗病力強等優(yōu)良特性。嘉定區(qū)的梅山豬品種其肌肉鮮嫩、肌纖維細而密，含水量較少，肌內脂肪豐富，呈大理石狀，俗稱“五花肉”［1，2］。近年來隨著人們生活水平的提高，對畜禽產(chǎn)品的質量要求越來越高，許多以追求高產(chǎn)為目的培育的外三元豬肉不能滿足消費需求，取而代之的是豬肉市場消費追求多樣化、精細化、肉質高品質化。梅山豬因肉質鮮美、香甜濃香而受到上海市民青睞，盡管價格比較高卻供不應求。目前尚沒有鑒定梅山豬肉及其肉制品的方法可以有效地保護正宗梅山豬肉及其肉制品的市場地位和品牌形象。

目前，制定的以活體豬為檢測對象的鑒別梅山豬的地方性標準，對梅山豬宰殺后分割肉及其他肉制品就不能用這種標準進行鑒定了。豬全基因組測序技術雖然可以鑒別不同品種、甚至不同個體的豬，但需要檢測的基因數(shù)目很多，成本大，不能廣泛應用。而若只檢測不同品種豬的個別基因，則不能區(qū)分轉基因和純種豬肉制品。ISSR是Zietkiewicz等［3］于1994創(chuàng)建的一類在PCR反應基礎上的DNA分子標記技術，它和PCR技術聯(lián)合使用具有很高的特異性和靈敏度且準確快速，近年來在品種鑒定、種質資源和遺傳多樣性研究廣泛應用，如ISSR分子技術鑒別陸川豬肉［4］、雁鵝［5］、馬鈴薯［6］、霍亂弧菌［7］和水稻［8］品種等。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

梅山豬、梅杜二元雜豬樣品來源于上海市嘉定區(qū)梅山豬育種中心（國家級梅山豬保種場）；杜長大三元雜豬肉樣品購自樂購超市；金華兩頭烏豬肉樣品購自專賣店；寧鄉(xiāng)花豬樣品購自湖南景倉農業(yè)科技有限公司（寧鄉(xiāng)花豬專賣店）；蘇淮黑豬樣品購自江蘇省蘇食肉品有限公司（蘇淮黑豬專賣店）；陸川豬樣品購自廣西玉林陸川豬養(yǎng)殖戶；羊肉、牛肉購自樂購超市。樣品分裝后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

ISSR隨機引物根據(jù)British Columbia大學公布的序列設計，2×Taq PCR MasterMix購自天根生化科技有限公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）；PCR擴增儀（ABI）；臺式高速冷凍離心機（Eppendorf）；DYY-7型電泳儀（北京市六一儀器廠）等。

2 方法

2.1 基因組DNA提取

分別取約100 mg梅山豬母豬、梅杜二元雜母豬、梅山豬公豬、梅杜二元雜公豬、杜長大三元雜的生鮮肉，放入研磨器加1 000μL蒸餾水，研磨5 min，取100 μL研磨液，加入1 mLDNA提取緩沖液（10 mol/ L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，0.5%SDS），然后再加入25 μL蛋白酶K，使終濃度達到100 μg/mL，混勻，50 ℃水浴3 h。用等體積的酚抽提1次，2 500 r/min離心收集水相，用等體積的酚、氯仿和異戊醇（體積比25：24：1）的混合物抽提1次，2 500 r/min離心收集水相；用等體積的氯仿和異戊醇（體積比24：1）的混合物抽提1次；加入等體積的5 mol/L的LiCl，混勻，冰浴10 min；2 500 r/min，離心10 min。轉移上清加入等體積的異丙醇，室溫10 min；2 500 r/min，離心10 min后棄上清。加入0.1倍體積3 mol/L乙酸鈉（pH5.2）與2倍體積-20℃預冷無水乙醇，-20 ℃靜置20 min。室溫12 000 r/min離心5 min后棄上清。將基因組DNA溶于適量100 μL TE中，作為ISSR-PCR反應的模板DNA。

2.2 ISSR-PCR反應體系與擴增程序

ISSR-PCR反應體系為25 μL體系：模板DNA 1μL、引物0.4 μmol/L、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O補足25 μL；擴增程序：設置梯度PCR擴增程序。95 ℃預變性 2 min，95 ℃變性30 s，退火30s，72℃延伸1 min，循環(huán)40次，72 ℃再延伸10 min。

2.3 電泳檢測

將擴增產(chǎn)物5μL進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，1×TAE緩沖液，電壓100 V下電泳0.5 h，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

3 結果與分析

3.1 供試樣品ISSR-PCR擴增結果

選擇ISSR隨機引物：5’-ATG ATGATGATGATGATGA-3’，經(jīng)梯度PCR優(yōu)化確定的退火溫度為54.6℃，模板加入量50～100 mg。對梅山豬母豬、梅杜二元雜母豬、梅山豬公豬、梅杜二元雜公豬、杜長大三元雜的生鮮肉提取基因組DNA進行ISSR-PCR擴增，電泳圖譜見圖1。對梅山豬母豬、金華兩頭烏、蘇淮黑豬、寧鄉(xiāng)花豬、陸川豬、羊肉、牛肉提取的基因組DNA進行ISSR-PCR擴增，電泳圖譜見圖2。

3.2 擴增條帶圖譜分析

如圖1中箭頭所示，梅杜二元雜母豬、梅杜二元雜公豬、杜長大三元雜樣品均產(chǎn)生1條較清晰的條帶，而梅山豬母豬、梅山豬公豬中無此條帶，多次重復實驗結果一致，并且梅山豬母豬、梅山豬公豬樣品PCR擴增條帶一致。梅山豬有條帶A、B、D、E和F而無條帶B1和C，而梅杜二元雜和杜長大三元雜有條帶A、B、C、D，條帶E和F稍模糊，梅杜二元雜母豬、杜長大三元雜有清晰B1條帶杜梅二元雜公豬B1條帶稍模糊。因此，凡是滿足有且僅有條帶A、B、D、E和F即可鑒定為梅山豬。

圖1 鑒定梅山豬的電泳圖譜

圖2 鑒別梅山豬與其他品種豬及羊肉、牛肉電泳圖譜

如圖2中箭頭所示，金華兩頭烏、蘇淮黑豬、寧鄉(xiāng)花豬、陸川豬樣品均產(chǎn)生一條較清晰的條帶（B1帶，大小為850 bp），而梅山豬中無此條帶，多次重復實驗結果一致，羊肉、牛肉與豬肉圖譜差異較大，很容易區(qū)分。由圖2發(fā)現(xiàn)，梅山豬有條帶A、B、D、E和F而無條帶B1和C，而金華兩頭烏豬、蘇淮黑豬、寧鄉(xiāng)花豬、陸川豬有清晰條帶A、B1、D、E和F，陸川豬還有明顯的C帶。而羊肉與牛肉的DNA指紋圖譜與梅山豬相去甚遠，羊肉具有明顯的條帶C，而牛肉具有極為明亮明顯的條帶B1。因此，凡是滿足有且僅有條帶A、B、D、E和F的樣品可鑒定為梅山豬。

4 討論

ISSR-PCR主要是由單一引物且以重復序列為擴增序列，所以結果的特異性受引物序列、反應體系或退火溫度等影響較大。本研究經(jīng)優(yōu)化建立了基于ISSR-PCR技術梅山豬肉鑒別方法，圖譜擴增帶明亮、穩(wěn)定性及多態(tài)性高，為梅山豬遺傳保種、商業(yè)化推廣提供了技術手段，也為國內其他優(yōu)良地方豬肉品種辨別提供了借鑒。

參考文獻

［1］ 殷方芝，肖耀明，陶軍，等. 近年來我國地方豬種遺傳資源保護與利用［J］. 豬業(yè)科學， 2015，32（10）：132-133.

［2］ 唐賽涌，王勃，陸林根.上海地區(qū)梅山豬的歷史發(fā)展與保種現(xiàn)狀［J］.中國豬業(yè)，2013 （S1）：71-73.

［3］ Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genome fingerprintingby simple sequence repeat（SSR） anchored polymerase chainreaction amplification［J］. Genonics，1994， 20（2）：176-183.

［4］ 何瑜林，黃麗，封毅，等.ISSR分子標記鑒定陸川豬及其肉制品［J］. 肉類研究，2014，28 （10）：10-14.

［5］ 李瑩，梁強，趙華寶，等.雁鵝遺傳多樣性的ISSR分析［J］.農業(yè)生物技術學報， 2009 （6）：63-68.

［6］ 段艷鳳，劉杰，卞春松，等.中國88個馬鈴薯審定品種SSR指紋圖譜構建與遺傳多樣性分析［J］.作物學報，2009，35（8）：1 451-1 457.

［7］ 莫秋華，譚華，王琪，等.霍亂弧菌分子分型和溯源技術ISSR-PCR的改進［J］.中國病原生物學雜志，2014 （9）：33-37.

［8］ 黃亮，李雨馨.常見水稻品種的DNA指紋圖譜構建及其遺傳［J］.糧食與油脂.2014 （10）：29-32.

收稿日期：（2016-01-28）