成 楊，楊 陽，劉 振，趙 洋，楊培迪（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，國家茶樹改良中心 湖南分中心，湖南 長沙 410125）

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雙價抗蟲基因轉(zhuǎn)化對茶籽生長發(fā)育影響的研究初探

成 楊，楊 陽，劉 振，趙 洋，楊培迪
（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，國家茶樹改良中心 湖南分中心，湖南 長沙 410125）

摘要：以保存本所茶樹資源圃的黃葉峒茶和牛皮茶為研究對象，進(jìn)行花粉管通道法轉(zhuǎn)基因操作研究，觀察其結(jié)實(shí)率和發(fā)芽率，初步探明了雙價抗蟲基因轉(zhuǎn)化對茶籽生長發(fā)育的影響。

關(guān)鍵詞：花粉管通道法；轉(zhuǎn)基因；茶籽；生長發(fā)育

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgene technology），是目前世界各國現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)研究的重點(diǎn)。通過轉(zhuǎn)基因方法使茶樹獲得抗蟲基因，可以很好的解決茶樹蟲害問題，同時解決茶樹農(nóng)藥殘留和農(nóng)藥使用對茶園生態(tài)環(huán)境造成的破壞和污染問題。在茶樹轉(zhuǎn)基因的研究上，已經(jīng)有了很多的研究成果，但是真正獲得擁有穩(wěn)定轉(zhuǎn)入基因的植株很少［1，2］。

花粉管通道法操作簡便、直接，直接將部分DNA片段轉(zhuǎn)入受體基因組，性狀容易穩(wěn)定；且在試驗(yàn)過程中不需要經(jīng)過愈傷組織階段，繞過了茶樹轉(zhuǎn)基因操作上的一大難題［3］?；ǚ酃芡ǖ婪ㄊ且环N較早出現(xiàn)也較成熟的轉(zhuǎn)基因方法，在多種作物的轉(zhuǎn)基因研究上尤其是轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花上取得了非常良好的效果［4］。然而花粉管通道法轉(zhuǎn)化成功率低，且轉(zhuǎn)化操作會影響結(jié)實(shí)率和萌發(fā)率［5，6］，因此在轉(zhuǎn)化成果的鑒定上，存在一定難度。本研究連續(xù)三年開展Bt和Cpti雙價抗蟲基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)對茶籽生長發(fā)育情況的影響研究，以便為茶樹花粉管通道法轉(zhuǎn)基因研究提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

選取種植于湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所（湖南省茶葉研究所）種質(zhì)資源圃中處于盛花期的黃葉峒茶（第一年受體）和牛皮茶（第二年增加的受體）為受體材料。菌株為天根生物科技有限公司提供的E.coil DH5α 感受態(tài)菌株。質(zhì)粒為上海生工生物工程有限公司合成的含有Bt 和Cpti 抗蟲基因序列的卡那霉素抗性T載體質(zhì)粒。

1.1.2儀器

培英科技有限公司生產(chǎn)的HZC-250恒溫振蕩培養(yǎng)箱、上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)的XMTD-204數(shù)顯式恒溫水浴鍋、德國eppendorf公司生產(chǎn)的Mastercycler PCR儀以及Cenrrifuge5417R冷凍高速離心機(jī)、北京市六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-7C型電泳儀。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增

將T 載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coil DH5α 感受態(tài)菌株當(dāng)中，將轉(zhuǎn)化后的菌株制成4 個不同濃度梯度的菌液，分別涂在加入了50 mg/L 的卡那霉素作為抗原的LB 固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37℃恒溫培養(yǎng)16 h，挑取單菌株加入到裝有100 mL的LB 液體培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL）當(dāng)中，37℃下150 r/min 的恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)20h［7］。

1.2.2DNA 的制備

SDS 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA［8］，制成低密度DNA 提取液并進(jìn)行檢測。

1.2.3花粉管通道法轉(zhuǎn)化

開花后1～2 h內(nèi)進(jìn)行人工授粉，授粉1 h 后去除花冠，沿與柱頭成45°左右切除約1/3 柱頭，將5μL DNA 提取液滴于柱頭上。掛牌標(biāo)記并摘去其所在枝上其他未經(jīng)處理的茶花，次日重復(fù)滴注1 次，自然成熟后收獲茶籽。

1.2.4 花發(fā)育情況和茶籽發(fā)芽率的統(tǒng)計

自茶花接受過轉(zhuǎn)化處理后，每個月觀察一次，通過觀察茶花子房的顏色和飽滿度，來判斷其是否正常發(fā)育，第二年10月份霜降前后收取茶籽并統(tǒng)計結(jié)實(shí)率。與前兩年的結(jié)實(shí)率進(jìn)行對比。

前一年收取的茶樹種子在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)，選取處理后種子30粒，未處理種子60粒，進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)。用溫水浸3～4 h，水溫20℃～25℃。事先做好發(fā)芽盤，盤底要鉆些漏水的小孔，以免積水。盤內(nèi)底層先墊一層吸水紙，紙上鋪1.5 cm厚的干凈細(xì)沙。然后將溫水浸好后的茶籽，取出平攤在沙上，再在攤好的茶籽上蓋一層薄沙，灑水濕潤，放入恒溫培養(yǎng)箱中加溫催芽。箱內(nèi)溫度保持在25℃～30℃之間，發(fā)芽盤的細(xì)沙要保持濕潤，每天加水通氣兩、三次［9］。

2　結(jié)果與分析

2.1接種后的茶樹結(jié)實(shí)率

對2012～2014年連續(xù)三年接種后花的發(fā)育與結(jié)實(shí)率情況進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果表明，三年間花朵正常發(fā)育率平均為33.93%，結(jié)實(shí)率為16.25%（表1）。

表1　2012～2014年接種茶花發(fā)育和結(jié)實(shí)情況Table 1 The inoculated tea fower seeding rate in 2012～2014

2.2接種后茶籽發(fā)芽情況

將2013年接種后的茶籽與普通茶籽進(jìn)行沙培，并對發(fā)芽情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明：接種后所收獲茶籽的發(fā)芽率（16.7%）要遠(yuǎn)低于對照普通茶籽的發(fā)芽率（33.3%和40.0%），說明茶樹Bt和Cpti雙價抗蟲基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)對茶籽的生長發(fā)育有著明顯的負(fù)面影響。

表2　接種后茶籽與普通茶籽發(fā)芽情況Table 2 The germination rate of inoculated tea seeds and common tea seads

3　討論

綜合觀察三年的接種茶花發(fā)育情況，在進(jìn)行花粉管通道法的操作之后，結(jié)實(shí)率最高沒有超過20%，最低的一年只有12.5%。而對比2012年［10］和2013年實(shí)驗(yàn)的茶籽發(fā)芽率來看，進(jìn)行了轉(zhuǎn)化操作的茶籽發(fā)芽（出苗）率為普通茶籽的一半左右。

綜上所述，花粉管通道法對茶籽發(fā)芽（出苗）率的負(fù)面影響是非常明顯的，這一點(diǎn)與許珺然等所做的實(shí)驗(yàn)結(jié)論基本一致［6，11］。由于茶樹雜交后結(jié)實(shí)率的范圍非常廣泛［12］，因此實(shí)驗(yàn)當(dāng)中茶樹結(jié)實(shí)率雖然略偏低，但基本在正常范圍內(nèi)，這一點(diǎn)與許珺然等和李興林、王曉娟的實(shí)驗(yàn)有一定差距［5， 6， 11］。一方面可能是因?yàn)榻臃N時間對作物的影響，在許珺然的實(shí)驗(yàn)中，就明確提出進(jìn)行轉(zhuǎn)化時間越靠后，結(jié)實(shí)率越高［11］；另一方面也可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中所用外源DNA濃度僅有許珺然等人實(shí)驗(yàn)的一半［6］，濃度相對偏低。除此之外，茶樹極長的結(jié)實(shí)周期也可能有一定的影響。這一方面的研究將在下一階段中具體進(jìn)行。

由此可見，花粉管通道法本身成功率較低，必須依靠大量的實(shí)驗(yàn)樣本來提高取得轉(zhuǎn)化成功樣本的概率，同時做好實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)操作，盡量提高茶籽的發(fā)芽率［9］。

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The effect of the Transformation of the Dual Resistance Gene on the Growth of Tea Seeds

CHENG Yang，YANG Yang，LIU Zhen，ZHAO Yang，YANG Pei-di
（Tea Research Institute of Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha， 410125， China）

Abstract：The experiment studied the effect of the transformation of the Dual Resistance Gene on the growth of tea seeds by observation of seed rate and germination rate. The tea cultivars used in this experiment are Huangyetongcha and Niupicha planted in the Tea Germplasm Garden of Hunan Tea Research Institute. And the gene transformation method is Pollen Tube Pathway.

Key words：Pollen Tube Pathway， Gene transformation， Tea seed， Germination rate

中圖分類號：S571.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-525X（2016）01-35-37

收稿日期：2015-12-22

修訂日期：2016-01-13

基金項(xiàng)目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-23）、湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)

作者簡介：成楊（1985-），男，江蘇南通人，助理研究員，主要從事茶樹育種研究。