陳鴻 史荔 張俊 趙道洪 史磊陸秦楠 張啟 段祺輝 舒嵩華

1昆明市第一人民醫(yī)院運動醫(yī)學關(guān)節(jié)外科（昆明650000）

2中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所

3昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院骨科

中國漢族人群前交叉韌帶損傷與β-fib基因多態(tài)性的相關(guān)性

陳鴻1史荔2張俊3趙道洪3史磊2陸秦楠1張啟1段祺輝1舒嵩華1

1昆明市第一人民醫(yī)院運動醫(yī)學關(guān)節(jié)外科（昆明650000）

2中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所

3昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院骨科

目的：探索β-fib基因多態(tài)性與中國漢族人群前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷發(fā)生的關(guān)系。方法：收集105名ACL損傷的漢族患者，以110名無ACL損傷史的漢族個體作為對照，通過限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析、測序技術(shù)對β-fib基因啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）進行檢測并分型，開展病例對照關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果：β-fib基因啟動子區(qū)共檢出6個SNPs，包括;β-148C/T（rs1800787）、β-249C/T（rs1800788）、β-455G/ A（rs1800790）、β-854G/A（rs1800791）、β-933G/A（rs2227389）、β-1420G/A（rs1800789），其中rs1800790、rs1800788和rs1800787的AG、CT和CT基因表型頻率在病例組中高于對照組 （P＜0.05）。rs2227389-rs1800791-rs1800790單倍型C G A*、T G A*、T G G*在病例組和對照組中也顯示統(tǒng)計學差異。結(jié)論：在中國漢族人群，β-fib基因啟動子區(qū)rs1800790、rs1800788和rs1800787及其單倍型可能與ACL損傷的發(fā)生相關(guān)。

前交叉韌帶損傷；β-fib基因多態(tài)性；病例對照研究

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是人體膝關(guān)節(jié)中重要的靜力性穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，ACL損傷在膝關(guān)節(jié)的損傷中較為常見，是引起膝關(guān)節(jié)功能障礙的常見因素之一[1]。 ACL損傷常使患者健康水平下降，將出現(xiàn)脛骨前移并導致膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，繼而出現(xiàn)半月板損傷，尤其內(nèi)側(cè)半月板損傷多見[2]，且ACL損傷時間越久，關(guān)節(jié)軟骨退變的范圍和程度越大[3]，結(jié)果會進一步加速膝關(guān)節(jié)的退行性改變和骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[4]。大量研究表明ACL損傷的患者關(guān)節(jié)炎發(fā)生的概率遠高于無損傷的患者[5，6]。明確ACL損傷的原因?qū)⒂兄陬A(yù)防膝關(guān)節(jié)損傷，但目前ACL損傷發(fā)生的病因尚不清楚，Bahr等[7]認為內(nèi)部因素和外部因素共同作用導致ACL損傷，而作為內(nèi)部危險因素之一的遺傳因素逐漸受到人們的重視[8]。研究表明，在ACL損傷的發(fā)生過程中以及手術(shù)后，常常伴隨著纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)g）水平的顯著升高[9-11]。而β-fib基因決定纖維蛋白β多肽鏈的合成進而影響血漿纖維蛋白原水平的大部分變化。由于不同人種或不同地區(qū)的人群存在基因異質(zhì)性，在中國人群中β-fib基因多態(tài)性是否與ACL損傷相關(guān)呢？本研究探討β-fib基因啟動子區(qū)的基因多態(tài)性與中國漢族人群ACL損傷發(fā)生的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1研究對象

納入標準：（1）體格檢查膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)、磁共振（MRI）與關(guān)節(jié)鏡檢查明確ACL損傷；（2）除ACL損傷，不合并有膝關(guān)節(jié)其他部位的韌帶損傷。

排除標準：（1）除ACL損傷，合并有膝關(guān)節(jié)其他部位的韌帶損傷；（2）既往風濕或類風濕性關(guān)節(jié)炎、化膿性關(guān)節(jié)炎、膝關(guān)節(jié)結(jié)核等膝關(guān)節(jié)疾病患者；（3）既往膝關(guān)節(jié)手術(shù)或外傷患者。

2011年10 月至2015年10月，研究包括105名ACL損傷患者和110名正常對照者：ACL損傷患者男73例、女32例，平均年齡33.62±11.18歲，左ACL損傷41例，右ACL損傷64例；正常對照者男69例、女41例，平均年齡35.57±12.78歲。均為漢族。臨床診斷前交叉韌帶損傷的方法主要包括：臨床膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性體格檢查提示膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，膝關(guān)節(jié)MRI檢查提示ACL異常信號，關(guān)節(jié)鏡檢查明確ACL損傷。本次試驗的ACL損傷病例同時滿足以上三方面的檢查標準，上述三個標準均不滿足者進入對照組。本研究獲得昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院及昆明醫(yī)科大學臨床研究倫理委員會批準通過，經(jīng)患者和正常對照本人及其家屬同意并簽署同意書。

1.2DNA提取、定量

采集ACL損傷病例及對照組外周靜脈血5 ml， EDTA抗凝。使用AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒提取樣本的基因組DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳對樣品DNA進行測定。電泳條件：4V/cm，2%瓊脂糖電泳45分鐘，凝膠成像。使用分光光度計ND-1000測定DNA濃度，調(diào)節(jié)DNA濃度至15 ng/μL～20 ng/μL。

1.3fib啟動子SNP檢測

1.3.1PCR引物設(shè)計

用DNASTAR primerselect設(shè)計引物序列。引物設(shè)計完成后在UCSC上進行PCR確認擴增序列準確性和長度。再將序列輸入NCBI進行BLAST序列比對，再次確認序列準確性和長度；同時確認擴增序列中的限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點是否是待檢測的SNP位點和酶切片段的長度。最后抽取一些樣本進行測序確認。引物序列 （擴增片段 1560bp）為：上游引物 （F）：5’-ACGTCACTAAAATAAAATCCTGTCTA-3’；下游引物（R）：5’-GAAGCTCCAAGAAACCATCC-3’

1.3.2PCR擴增：PCR反應(yīng)體系

10×PCR擴增緩沖液2.0 μL、dNTP1.6 μL、正向引物0.2 μL、反向引物0.2 μL HostStart rTaq聚合酶0.1 μL、模板DNA 1.3 μL，再加入雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)程序 94℃，3 min（94℃，30 s；58.9℃，30 s；72℃，2 min）×30；72℃，10 min，4℃保存。

1.3.3雙向測序

擴增PCR產(chǎn)物經(jīng)生工生物工程（上海）有限公司測序，檢測β-fib基因啟動子區(qū)多態(tài)位點。

1.4統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS17.0進行統(tǒng)計分析。采用Hardy-weinberg遺傳平衡定律檢驗病例組和對照組的基因頻率以及等位基因頻率。運用SHEsis程序[12]（http：//analysis2.bio-x.cn/myAnalysis.php）分析統(tǒng)計β-fib基因啟動子區(qū)的基因型、等位基因及其單倍型頻率。位點的多態(tài)性與ACL損傷風險之間的相關(guān)性用比值比（oddsratio，OR 值 ） 及 其 95% 可 信 區(qū) 間（confidenceintervals，CI）表示。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1β-fib基因啟動子區(qū)SNP檢測

β-fib基因啟動子區(qū)共檢出6個SNPs，包括；β-148C/T（rs1800787），β-249C/T（rs1800788），β-455G/A （rs1800790），β-854G/A（rs1800791），β-933G/A（rs222-7389），β-1420G/A（rs1800789）。測序結(jié)果如圖1。

2.2β-fib基因病例對照分析

2.2.1Hardy-Weinberg平衡檢驗

對照組與感染組等位基因的頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P值均＞0.05），說明人群具有代表性。

圖1 β-fib基因啟動子區(qū)6個SNPs測序結(jié)果

2.2.26個SNPs在病例組與對照組中等位基因頻率與基因型頻率比較

研究比較了6個SNPs在病例組和對照組中等位基因頻率，以及基因型頻率分布。結(jié)果6個SNPs等位基因頻率在病例組和對照組中未顯示差異 （P值均＞0.05），但 rs1800790、rs1800788和 rs1800787的AG、CT和CT基因表型頻率在病例組中高于對照組，其差異具有顯著性意義，P值分別為0.0045、0.0022和0.010。這提示rs1800790、rs1800788和rs1800787可能與ACL的發(fā)生相關(guān)。結(jié)果見圖2和3。

圖2 β-fib基因6個SNPs等位基因頻率比較

圖3 β-fib基因6個SNPs基因型頻率比較

圖4 β-fib基因6個SNPs連鎖不平衡圖

2.2.36個SNPs連鎖不平衡分析

將β-fib基因6個SNPs進行連鎖不平衡分析，結(jié)果如圖4顯示 ：rs2227389、rs1800791和rs1800790連鎖不平衡較高。其余位點之間連鎖程度較低。

2.2.4單倍型構(gòu)建及病例對照分析

根據(jù)連鎖不平衡分析結(jié)果，構(gòu)建了rs2227389-rs1800791-rs1800790單倍型，并進行對照病例分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C G A*，T G A*，T G G*單倍型顯示差異有統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 rs2227389-rs1800791-rs1800790單倍型ACL病例—對照分析結(jié)果

3 討論

目前，ACL損傷的發(fā)病機制并不十分清楚，內(nèi)外多種因素都可能與ACL損傷的發(fā)生相關(guān)。長期以來，學者們關(guān)注于ACL的三維空間結(jié)構(gòu)、三維力學機制的分析研究。但近年來，多種高風險因子的發(fā)現(xiàn)表明基因與基因、基因與環(huán)境的相互作用在ACL損傷發(fā)生中也起到非常重要的作用。研究表明：性別、家族因素、特殊的遺傳序列變異等也是ACL損傷發(fā)生的高風險因素。ACL損傷在女性的發(fā)生率高于男性，Posthumus對Ⅴ型膠原基因COL5A1基因多態(tài)性進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：女性ACL損傷患者COL5A1 BstUI RFLP CC基因型的頻率顯著高于對照[13]。另外，女性XII型膠原基因COL12A1 AluI RFLP AA型ACL損傷的風險也增高[14]。Khoschnau等觀察到Ⅰ型膠原基因COL1A1 Sp1結(jié)合位點的多態(tài)性與ACL損傷減低相關(guān)[15]。而且ACL損傷患者親屬中ACL損傷的發(fā)生率高于正常，是正常的2倍，患者一級親屬的ACL損傷的發(fā)生率則達到2倍以上[16]。這些數(shù)據(jù)都提示遺傳因素在ACL損傷的發(fā)生中起到一定作用。對遺傳高風險因子的鑒別有利于確定在職業(yè)或非職業(yè)體育活動中，重復(fù)性的機械負荷是否是導致個體損傷增加的因素，而且有助于在未來的治療中，針對不同個體采用最有效的治療方法。同時，遺傳風險因素也是決定損傷預(yù)后的重要因素。因此，ACL損傷的遺傳機制分析越來越受到重視，研究表明除了膠原蛋白（COL1A1，COL5A1，COL12A1）基因，還有基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、血管內(nèi)皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體-2（KDR）、肌原纖蛋白2（FBN2）等基因編碼或表達ACL的結(jié)構(gòu)，并與ACL損傷有關(guān)[17-19]。

纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)g）是肝臟合成的一種血漿球蛋白，由完全相同的兩個亞基組成，每個亞基含有α、β、γ三條肽鏈，主要作為凝血因子Ⅰ 參與凝血，是凝血系統(tǒng)的核心蛋白質(zhì)，它在凝血過程的最后階段被凝血酶切斷纖維蛋白原α鏈N-末端區(qū)域的纖維蛋白肽A和β鏈N-末端區(qū)域的纖維蛋白肽B而生成纖維蛋白單體，最終形成不溶性纖維蛋白凝塊而發(fā)揮血液凝固作用。纖維蛋白原3對多肽鏈分別由3條獨立的基因（α、β、γ）編碼，其中纖維蛋白原Bβ鏈的mRNA合成被認為是控制整個分子合成的限速步驟，所以β-fib基因決定了纖維蛋白β多肽鏈的合成進而影響血漿纖維蛋白原水平的大部分變化。本實驗對β-fib基因啟動子區(qū)的基因多態(tài)性進行初步研究，共檢出6個SNPs：β-148C/T（rs1800787），β-249C/T（rs1800788），β-455G/ A （rs1800790），β-854G/A （rs1800791），β-933G/A （rs2227389），β-1420G/A（rs1800789）。病例對照分析結(jié)果表明：rs1800790，rs1800788和rs1800787的AG、CT 和CT基因表型頻率在病例組中高于對照組，其差異具有顯著性意義，P值分別為0.0045、0.0022和0.010。進一步構(gòu)建的rs2227389-rs1800791-rs1800790單倍型C G A*、T G A*、T G G*在病例組和對照組中也顯示統(tǒng)計學差異。近年來的研究也表明，在ACL損傷的發(fā)生過程中以及手術(shù)后，常常伴隨著纖維蛋白原水平的顯著升高[9-11]。

4 結(jié)論

綜上所述，在中國漢族人群，β-fib基因啟動子區(qū)rs1800790、rs1800788和rs1800787及其單倍型可能與ACL損傷的發(fā)生相關(guān)。

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Association of β-fib gene polymorphisms with ACL injury in Chinese Han Population

Chen Hong1，Shi Li2，Zhang Jun3，Zhao Daohong3，Shi Lei2，Lu Qinnan1，Zhang Qi1，Shu Songhua1
1 Sports Medicine and Joint Surgery，The First People’s Hospital of Kunming，Yunnan 650000，China
2 Institute of Medical Biology，Chinese Medical Sciences Academy，Yunnan 650000，China
3 Department of Orthopedics，The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Yunnan 650000，China

Lu Qinnan，Email：luqinnanyn@163.com

ObjectiveTo investigate the association of polymorphisms of β-fib gene with anterior cruciate ligament（ACL）injury in Chinese Han population.MethodOne hundred and five ACL injury patients were recruited in an experimental group，while 110 healthy counterparts were selected into a controll group.RFLP analysis and genetic sequencing technology were applied to detect and classify the single nucleotide polymorphisms（SNPs）in the β-fib gene promoter region.Then association analysis was conducted.Result In the β-fib gene promoter region，6 SNPs were detected as follow：β-148C/T （rs1800787），β-249C/T （rs1800788），β-455G/A （rs1800790），β-854G/A （rs1800791），β-933G/A （rs2227389），，β-1420G/A （rs1800789））.Moreover，the AG，CT and CT phenotypes of β-fib rs1800790，rs1800788 and rs1800787 gene were found significantly more in the experimental group than the control group （P＜0.05）.Significant differences were also found in the appearance of rs2227389-rs1800791-rs1800790 haplotype CGA*，TGA*，TGG* between the 2 groups.Conclusionβ-fib rs1800790，rs1800788 and rs1800787 genes and their haplotypes were related to ACL injury in Chinese Han population.

ACL injury，β-fib gene polymorphism，association analysis

2016.01.19

云南省科技計劃項目（昆醫(yī)聯(lián)合專項）（40210029）

陸秦楠，Email：luqinnanyn@163.com