郝褔星，鄭玲敏，周澤偉，陳秀云，張雨梅，3（.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州225009；2江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學院，江蘇泰州225300；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州225009）

?

甜味劑萊鮑迪苷A的致突變作用試驗

郝褔星1，2，鄭玲敏1，周澤偉1，陳秀云1，張雨梅1，3
（1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州225009；2江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學院，江蘇泰州225300；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州225009）

摘要：為了評價甜菊糖苷中的主要成分之一萊鮑迪苷A的致突變作用，在2 500～4 μg /皿范圍內(nèi)，對萊鮑迪苷A（含量≥97%）進行了Ames試驗，滅菌水作為陰性對照；以5.0 g/kg體重、2.5 g/kg體重和1.25 g/kg體重劑量進行了小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗，以40 mg/kg環(huán)磷酰胺為陽性對照，生理鹽水為陰性對照。結(jié)果Ames試驗中，萊鮑迪苷A對TA97、TA98、TA100和TA102菌株的回變菌落數(shù)均小于陰性對照組的兩倍，且未見劑量-反應關(guān)系，Ames試驗陰性；小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗均為陰性。表明萊鮑迪苷A在試驗劑量下無致突變作用。

關(guān)鍵詞：萊鮑迪苷A；Ames試驗；微核試驗；精子畸形試驗

甜菊糖是從原產(chǎn)南美巴拉圭東北部的菊科小灌木甜葉菊（stevia rebaudiana bertoni）的葉子中提取出的一類天然的低熱量的高倍甜味劑，其甜度是蔗糖的250～300倍，熱量僅為蔗糖的1/250左右[1-2]。目前為止，已從甜葉菊中分離得到8種不同甜度的糖苷[3-4]分別為：甜菊糖苷（stevioside）、甜菊醇雙糖苷（steriolbioside）、萊鮑迪苷A（rebaudioside A）、萊鮑迪苷B（rebaudioside B）、萊鮑迪苷C（rebaudioside C）、萊鮑迪苷D（rebaudioside D）、萊鮑迪苷E（rebaudiosideE）、杜爾可苷A（dulcoside A）。其中甜菊糖苷是主要成分，占60%～70%，甜度為蔗糖的300倍；其次是萊鮑迪苷A，占15%～20%，甜度為蔗糖的450倍，甜味較純正，且甜味最接近蔗糖，其他組分含量都較少。甜菊糖苷類高甜度低熱量的特點，作為蔗糖的替代品在食品中應用越來越多，在飼料中作為甜味劑也有應用。

由于甜菊糖苷類的規(guī)格資料不足，代謝物甜菊醇體外實驗中表現(xiàn)出致突變性[5-6]，對其應用安全性存在著爭議[7]。至2008年，在聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）、世界衛(wèi)生組織食品添加劑專家委員會（JECFA）第69屆會議上，確定了甜菊糖苷每日允許攝入量（ADIS）為0～4 mg/kg體重（以甜菊醇表示）[8]。同年，美國藥品食品管理局（FDA）批準允許在食品中使用甜葉菊提取物萊鮑迪苷A。2012年，法國成為歐盟第一個批準在食品和飲料產(chǎn)品內(nèi)使用高純度萊鮑迪苷A（97%）的國家[9]。但目前國內(nèi)對萊鮑迪苷A的深入研究和其在食品中的應用還相對較少。本文通過鼠傷寒沙門菌回復突變試驗（Ames試驗）、小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗，研究萊鮑迪苷A在體內(nèi)體外的致突變作用，為萊鮑迪苷A作為天然甜味劑在食品或飼料中的應用的安全性評價積累資料。

1　材料與方法

1.1受試物及試劑萊鮑迪苷A，含量≥97%，批號2012-002P，由某生物技術(shù)公司生產(chǎn)。

2-氨基芴（2-AF），純度＞99%，日本東京化成工業(yè)株式會社；敵克松，純度98.8%，美國DIMA技術(shù)有限公司；4-硝基喹啉-N-氧化物、甲基磺酸甲酯，純度均大于98%，美國Amresco公司；多氯聯(lián)苯（Aroclor1254），美國Crescent Chemical有限公司。

萊鮑迪甙A試液配制：稱取適量溶于水，臨用前用無菌蒸餾水配制并梯度稀釋至所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。陽性對照物均用二甲基亞砜（DMSO）配制。

1.2實驗菌株TA97、TA98、TA100和TA102菌株，由江蘇省疾病控制中心提供，-80℃保存。試驗菌株生物學特性按GB 15193.4-2003標準方法鑒定符合試驗要求。

1.3實驗動物ICR小鼠，體重24～28 g；Wistar大鼠，體重180～200 g，由揚州大學比較醫(yī)學中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2012-0004，使用許可證號：SYXK（蘇）2012-0029。飼喂經(jīng)60Co照射飼料，24±2℃，濕度60±20%，自由采食和飲水，飲水為符合城市飲用水標準的自來水。試驗前在實驗環(huán)境中適應3 d，灌胃前停食12 h，不限制飲水。

1.4Ames試驗

1.4.1大鼠肝微粒體酶的誘導和S9的制備選擇健康雄性成年Wistar大鼠2只，采用多氯聯(lián)苯（Aroclor1254）（200 mg/mL玉米油溶液，按500 mg/ kg體重）腹腔注射作為誘導劑。按GB 15193.4-2003方法制備S9，生物活性鑒定合格后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2平板摻入法Ames試驗以鼠傷寒沙門菌突變株TA97、TA98、TA100和TA102菌株為試驗菌。采用平板摻入法進行試驗。根據(jù)預試驗結(jié)果，受試物萊鮑迪苷A的劑量設(shè)置分別為：2500 μg /皿、500 μg /皿、100 μg /皿、20 μg /皿、4 μg /皿；另設(shè)陰性（溶劑）對照組和陽性對照組，每個處理組分加S9（+S9）和不加S9（-S9）兩個系列，每個系列設(shè)3個平行平皿。陽性對照：加S9時四菌株均用2-氨基芴（2-AF），濃度為100 μg/mL（10 μg/100 μL·皿）；不加S9時TA97、TA98用敵克松，濃度為0.5 mg/mL（50 μg/100 μL·皿），TA100用4-硝基喹啉-N-氧化物，濃度為5 μg/mL（0.5 μg/ 100 μL·皿），TA102用甲基磺酸甲酯，濃度為10 μg /mL（1.0 μg/100 μL·皿）。

雙盲法記錄每皿回變菌落數(shù)。按GB 15193.4-2003法規(guī)定的標準判定Ames試驗結(jié)果為陰性或陽性。

1.5小鼠骨髓細胞微核試驗萊鮑迪苷A配制成各試驗濃度的水溶液。采用灌胃染毒，灌胃體積為0.2 mL/10 g。

瑞鮑迪苷A分為5.0 g/kg體重、2.5 g/kg體重和1.25 g/kg體重3個劑量組；另以40 mg/kg體重環(huán)磷酰胺腹腔注射為陽性對照和蒸餾水為陰性對照。每組10只小鼠，雌雄各半。各組染毒二次，時間間隔24 h。于第二次給予受試物后6 h處死小鼠，骨髓制片。按農(nóng)業(yè)部1147號公告“獸藥小鼠骨髓細胞微核試驗指導原則”進行微核率的檢查并判定微核試驗的結(jié)果。

1.6小鼠精子畸形試驗萊鮑迪苷A精子畸形試驗劑量組同微核試驗。每組10只雄性ICR小鼠，每天染毒1次，連續(xù)5 d。于第1次給予受試物后35天脫頸椎處死小鼠，按農(nóng)業(yè)部1147號公告“獸藥小鼠精子畸形試驗指導原則”進行精子畸形檢查。每只小鼠檢查1 000個精子，計數(shù)畸形精子數(shù)并進行分類。

1.7統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS12.0，顯著性比較采用χ2分析。

表1　萊鮑迪苷A鼠傷寒沙門菌回復突變試驗?。ā繱D）

表1　萊鮑迪苷A鼠傷寒沙門菌回復突變試驗?。ā繱D）

TA97TA98TA100TA102組別　-S9　+S9　-S9　+S9　-S9　+S9　-S9　+S9 2500 μg /皿　125.36±6.74　128.00±4.28　40.02±4.36　42.25±5.32　160.36±6.52　170.00±8.28　248.22±11.32　252.98±21.02 500 μg /皿　125.05±6.13　127.67±6.42　40.00±4.27　43.33±1.05　162.22±10.00　172.55±11.32　249.25±6.36　248.58±22.31 100 μg /皿　126.00±5.28　128.00±6.24　39.84±6.12　41.19±1.25　168.37±3.65　180.58±12.55　247.89±13.62　249.98±21.08 20 μg /皿　124.31±3.98　127.32±6.23　39.84±4.41　38.88±8.29　161.18±12.08　181.66±5.55　253.36±10.02　250.39±10.00 4.0 μg /皿　125.30±3.08　122.89±3.58　38.17±5.00　38.59±5.68　161.22±3.55　169.66±6.99　250.36±7.49　250.28±14.58滅菌水　124.50±5.20　130.00±3.51　40.00±7.19　43.32±3.28　160.55±7.18　177.22±14.01　248.88±12.25　248.39±11.03 DMSO　131.00±3.28　128.43±5.05　38.18±3.56　41.38±4.15　165.49±5.00　178.21±8.00　250.91±7.29　254.69±22.05 ＞850?。?00?。?00?。?00?。?80　＞400?。?50　＞550陽性對照　敵克松　2-AF　敵克松　2-AF　4-硝基喹啉-　2-AF　甲基磺酸甲酯　2-AF （50 μg）?。?0 μg）?。?0 μg）?。?0 μg）　N-氧化物（0.5 μg）（10 μg）?。?.0 μg）　（10 μg）

表2　萊鮑迪苷A小鼠骨髓細胞微核試驗及精子畸形試驗結(jié)果?。ā繱D）

表2　萊鮑迪苷A小鼠骨髓細胞微核試驗及精子畸形試驗結(jié)果　（±SD）

注：與陰性對照比較，*：P<0.05；**：P<0.01

各類畸形精子率/ %劑量組　動物數(shù)　微核率（‰）　檢查精子數(shù)　精子畸形率/ %　無鉤　香蕉形　無定形　胖頭　尾折疊　雙頭　雙尾陰性對照　10　3.82±1.07　1000×10　2.55±0.09　35.29　15.29　34.90　10.20　3.92　0.00　0.39 1.25g/kg b.w.　10　3.79±0.60*　1000×10　2.53±0.16*　35.57　15.41　32.41　10.67　4.74　0.39　0.79 2.5 g/kg b.w.　10　3.64±0.66*　1000×10　2.80±0.10*　35.36　15.00　32.14　10.71　5.36　0.36　1.07 5.0 g/kg b.w.　10　4.55±1.34*　1000×10　3.15±0.20*　35.56　15.24　30.16　11.11　6.03　0.63　1.27陽性對照　10　21.32±4.15**　1000×10　11.01±0.24**　37.60　13.71　30.43　10.08　4.72　1.91　1.54

2　結(jié)果

2.1Ames試驗實驗中4種試驗用鼠傷寒沙門菌株菌苔生長正常，陽性對照試驗各菌株反應合格。萊鮑迪苷A每皿劑量在2 500 μg～4.0 μg范圍內(nèi)，有或無S9時，平均回變菌落數(shù)均小于陰性（溶劑）對照組的兩倍，未見劑量-反應關(guān)系（見表1），且兩次重復試驗結(jié)果一致。表明萊鮑迪苷A的Ames試驗結(jié)果為陰性。

2.2小鼠骨髓細胞微核試驗萊鮑迪苷A小鼠骨髓細胞微核試驗微核率見表2。各試驗組PCE/ NCE比值在正常范圍內(nèi)。陽性對照組的微核率與陰性對照組比較差異極顯著（P<0.01）。萊鮑迪苷A高、中、低劑量組與陰性對照組相比，均無顯著性差異（P>0.05），且各試驗組微核率之間無劑量-反應關(guān)系?？膳卸ㄈR鮑迪苷A的小鼠骨髓細胞微核試驗結(jié)果為陰性。

2.3小鼠精子畸形試驗萊鮑迪苷A小鼠精子畸形試驗結(jié)果見表2。陽性對照組精子畸形率顯著高于陰性對照組（P<0.01)。受試物3個劑量組的精子畸形率與陰性對照組比較，無顯著性差異（P>0.05）。精子畸形類別以無鉤、無定形較多，香蕉形、胖頭次之，尾折疊較少，雙頭和雙尾的則更少。萊鮑迪苷A小鼠精子畸形試驗結(jié)果為陰性，表明對小鼠的生殖細胞無致突變性。

3　結(jié)論與討論

在試驗條件下，萊鮑迪苷A的鼠傷寒沙門菌突變試驗結(jié)果為陰性；對小鼠骨髓細胞微核試驗及對小鼠精子畸形試驗均為陰性，說明該受試物在試驗劑量范圍內(nèi)無致突變作用。

雖然歷史上對甜菊糖的安全性存在過爭議，但隨著對甜菊糖的毒理研究深入，加上JECFA已制定了甜菊糖的的每日允許攝入量為4mg/kg，F(xiàn)DA及法國等允許萊鮑迪苷A用于食品，說明萊鮑迪苷A在低于ADI的濃度下食用是安全的。

萊鮑迪苷A在甜菊糖苷中含量較高，一般占混合糖苷的30 %～70 %，經(jīng)過純化處理去除了帶異味的其他糖苷的影響，使其甜度高、味質(zhì)好，可作為甜菊糖的精加工高端產(chǎn)品，是較理想的天然甜味劑，可較完全地替代蔗糖，甜度成本也比蔗糖低，使用中配比方便，因此在食品工業(yè)中將得到越來越廣泛的應用。此外，這種低熱量的甜味劑更適合肥胖癥和糖尿病患者等對甜品的需求，

符合現(xiàn)代食品的發(fā)展方向。萊鮑迪苷等甜菊糖苷作為飼料添加劑在乳豬料等中添加，也具有較低的甜度成本，作為飼料添加劑應用具有潛在的廣闊市場。

參考文獻：

[1]胡獻麗，董文賓，鄭丹，等.甜菊及甜菊糖研究進展[J].食品研究與開發(fā)，2005，26（1）：36-38.

[2]孫傳范，李進偉.甜菊糖苷研究進展[J].食品科學，2010，31 （9）：338-340.

[3] Brahmachari G，Mandal L C，Roy R，et al.Stevioside and related compounds-molecules of pharmaceutical promise：a critical over?view [J].Archiv der Pharmazie，2011，344（1）：5-19.

[4] Lemus-Mondaca R，Vega-Gálvez A，Zura-Bravo L，et al.Stevia rebaudiana Bertoni，source of a high-potency natural sweetener：A comprehensive review on the biochemical，nutritional and func?tional aspects [J].Food Chemistry，2012，132（3）：1121-1132.

[5] Suttajit M，Vinitketkaumnuen U，Meevatee U，et al.Mutagenicity and human chromosomal effect of stevioside，a sweetener from ste?via rebaudiana bertoni [J] . Environ Health Perspectives，1993，101：53-561.

[6] Matsui M，Matsui K，Kawasaki Y，et al.Evaluation of the genotox?icity of stevioside and steviol using six in vitro and one in vivo mutagenicity assays[J].Mutagenesis，1996，11：573.

[7]李曉瑜.甜菊糖苷的安全性研究進展.中國食品添加劑，2003，3：5-11.

[8] JECFA/69/SC，Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Addi?tives Sixty-ninth meeting，Summary and conclusion Rome，Italy，2008.

[9]法國提高食品中添加甜菊糖苷的限量[J].飼料工業(yè)，2010，13（2）：6.

中圖分類號：TS201.7

文獻標志碼：B

文章編號：0529-6005（2015）05-0104-03

收稿日期：2014-04-03

基金項目：江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程項目資助；揚州大學“新世紀人才工程”資助

作者簡介：郝褔星（1982-），男，講師，碩士，從事獸醫(yī)臨床教學及農(nóng)技推廣工作，E-mail：330848219@ qq.com

通訊作者：張雨梅，E-mail：zym@yzu.edu.cn