錢鶴平，林家曉

1.海門市人民醫(yī)院ICU，江蘇海門226100；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院胃肝病科

MDA?7／IL?24基因聯(lián)合阿霉素對(duì)肝癌模型裸鼠金屬基質(zhì)蛋白酶及血管內(nèi)皮生長因子的影響

錢鶴平，林家曉

1.海門市人民醫(yī)院ICU，江蘇海門226100；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院胃肝病科

目的 探討MDA?7／IL?24基因聯(lián)合阿霉素對(duì)肝癌模型裸鼠金屬基質(zhì)蛋白酶及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的影響。方法 建立肝癌移植瘤模型裸鼠后分為模型組（A組）、阿霉素組（B組）、MDA?7／IL?24組（C組）、聯(lián)合干預(yù)組（D組），并給予不同條件干預(yù)。干預(yù)后2周、6周時(shí)，測(cè)定腫瘤體積和重量、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）、VEGF表達(dá)量。結(jié)果 干預(yù)2周、6周時(shí)，B、C、D組小鼠腫瘤體積和重量均明顯低于A組（P＜0.05），D組小鼠腫瘤的體積和重量顯著低于B組和C組（P＜0.05），B、C、D組小鼠腫瘤組織中MMP3、MMP mRNA含量明顯低于A組（P＜0.05），D組小鼠腫瘤組織中MMP3、MMP9 mRNA含量顯著低于B組和C組（P＜0.05），B、C、D組小鼠腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2 mRNA含量明顯低于A組（P＜0.05），D組小鼠腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2 mRNA含量顯著低于B組和C組（P＜0.05）。結(jié)論 MDA?7／IL?24基因聯(lián)合阿霉素能夠有效地抑制肝癌模型裸鼠的腫瘤生長，減少M(fèi)MP和VEGF的表達(dá)量。

肝癌；黑色素瘤分化相關(guān)抗原7；白細(xì)胞介素?24；基質(zhì)金屬蛋白酶；血管內(nèi)皮生長因子

肝癌是消化系統(tǒng)惡性程度較高的一類惡性腫瘤，腫瘤組織血供豐富、癌細(xì)胞增殖活力極強(qiáng)，患者的生存率較低且轉(zhuǎn)移率、復(fù)發(fā)率較高，整體預(yù)后較差［1］。阿霉素是肝癌常用的化療藥物，對(duì)癌細(xì)胞具有一定殺傷效應(yīng)，但不能徹底殺死癌細(xì)胞，治療后復(fù)發(fā)率較高。黑素瘤分化相關(guān)基因?7（melanomadifferentiation associated gene?7，MDA?7）是從黑素瘤細(xì)胞中提取具有抑癌作用的基因，根據(jù)生物學(xué)特性與染色體定位命名IL?24。研究［2］表明，MDA?7／IL?24基因具有選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，且對(duì)正常細(xì)胞無任何效應(yīng)。本文通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討MDA?7／IL?24基因聯(lián)合阿霉素對(duì)肝癌模型裸鼠金屬基質(zhì)蛋白酶及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為BALB／c小鼠64只，購于東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)20151015），4～6周齡，雄性，體質(zhì)量20～24 g，平均（22.02±1.12）g，本次研究報(bào)請(qǐng)東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；重組腺病毒MDA?7／IL?24由吉?jiǎng)P公司合成；阿霉素注射液：山西普德藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H14023143，規(guī)格10 mg；肝癌細(xì)胞中HepG2購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基、新生小牛血清、胰蛋白酶均購于Gibco公司；酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購于上海西唐生物公司，RNA抽提及檢測(cè)試劑盒購于北京康為世紀(jì)公司。

1.2 肝癌移植瘤模型建立方法 取HepG2細(xì)胞株，培養(yǎng)在含有10%新生小牛血清的培養(yǎng)基中，每2天換液1次，待細(xì)胞貼壁長滿后用胰酶消化傳代，傳代后取胰酶消化后的細(xì)胞，用PBS重懸并調(diào)節(jié)密度至2×106／ml，將0.2 ml細(xì)胞懸液注射于小鼠背部皮下。待腫瘤生長，挑選瘤體直徑4～5 mm的移植瘤模型鼠用于藥物干預(yù)。

1.3 動(dòng)物分組及藥物干預(yù) 移植瘤模型建立成功后，將模型鼠分為模型組（A組）、阿霉素組（B組）、MDA? 7／IL?24組（C組）、聯(lián)合干預(yù)組（D組）。A組小鼠給予相同劑量的生理鹽水瘤內(nèi)注射；B組小鼠給予1.00 mg／kg的阿霉素腹腔注射；C組小鼠給予重組腺病毒MDA?7／IL?24瘤內(nèi)單點(diǎn)注射，劑量為2×106PFU／μl；D組小鼠給予1.00 mg／kg的阿霉素及2×106PFU／μl的重組腺病毒MDA?7／IL?24瘤內(nèi)單點(diǎn)注射。

1.4 腫瘤組織的重量和體積 干預(yù)后2周、6周時(shí)，每組小鼠各取8只，頸椎脫臼法處死，解剖得到腫瘤組織后用電子天平稱瘤體重量，后用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠移植瘤的長徑a和短徑b，按照下列公式計(jì)算腫瘤體積：V＝0.5×a×b2。

1.5 MMP和VEGF的表達(dá)量 干預(yù)后2周、6周時(shí)，腫瘤組織用于重量和體積測(cè)量后，用生理鹽水清洗3～5遍，采用RNA抽提試劑盒提取組織中的RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成RNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一鏈，而后用PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增目的基因MMP3、MMP9、VEGFC、VEGFR2及內(nèi)參基因β?actin。根據(jù)擴(kuò)增曲線后計(jì)算MMP3、MMP9、VEGFC、VEGFR2 mRNA含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用x ±s表示，多組間計(jì)量資料的分析采用方差分析，兩兩比較采用LSD?t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤體積和重量 干預(yù)后6周時(shí)，各組小鼠的腫瘤體積和重量均明顯高于干預(yù)后2周時(shí)（P＜0.05）；干預(yù)2周時(shí)、6周時(shí)，B、C、D組小鼠腫瘤體積和重量均明顯低于A組（P＜0.05），D組小鼠腫瘤的體積和重量顯著低于B組和C組（P＜0.05），B組和C組小鼠腫瘤的體積和重量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

表1 四組小鼠的腫瘤體積和重量比較（x ±s）Tab 1 Comparison of tumor volume and weight in 4 groups of mice（x ±s）

2.2 腫瘤組織中MMP3、MMP9 mRNA的表達(dá)量干預(yù)后2周、6周時(shí)，A組小鼠腫瘤組織中MMP3、MMP9 mRNA含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與干預(yù)后2周比較，6周時(shí)B、C、D組小鼠腫瘤組織中MMP3、MMP9 mRNA含量均明顯降低（P＜0.05）；B、C、 D組小鼠腫瘤組織中MMP3、MMP9 mRNA含量明顯低于A組（P＜0.05），D組小鼠腫瘤組織中MMP3、MMP9 mRNA含量顯著低于B組和C組（P＜0.05），B組和C組小鼠腫瘤腫瘤組織中MMP3、MMP9 mRNA含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。

表2 四組小鼠中腫瘤組織中MMP3、MMP9 mRNA表達(dá)量的比較（x ±s）Tab 2 Comparison of expressions of MMP3 and MMP9 mRNA in tumor tissues of 4 groups of mice（x ±s）

2.3 腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2 mRNA的表達(dá)量 干預(yù)后2周、6周時(shí)，A組小鼠腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2的mRNA含量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與干預(yù)后2周比較6周時(shí)B、C、D組小鼠腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2 mRNA含量明顯降低（P＜0.05），B、C、D組小鼠腫瘤腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2 mRNA含量明顯低于A組（P＜0.05），D組小鼠腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2 mRNA含量顯著低于B組和C組（P＜0.05），B組和C組小鼠腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2 mRNA含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表3）。

表3 四組小鼠腫瘤組織中VEGF?C、VEGFR2 mRNA表達(dá)量的比較（x ±s）Tab 3 Comparison of expressions of VEGF?C and VEGFR2 mRNA in tumor tissues of 4 groups of mice（x ±s）

3 討論

肝癌目前仍缺乏有效的靶向治療藥物，患者的臨床預(yù)后較差。阿霉素是臨床上常用的化療藥物，被用于多種惡性腫瘤的治療，對(duì)增殖期的癌細(xì)胞具有殺傷作用，對(duì)腫瘤的發(fā)展具有抑制和緩解作用［3］。但是單獨(dú)應(yīng)用阿霉素治療肝癌并不能徹底清除癌細(xì)胞，需要聯(lián)合使用不同的藥物以更有效地抑制肝癌病情發(fā)展［4］。MDA?7基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類抑癌基因，所表達(dá)的產(chǎn)物IL?24屬于IL?10家族［5］。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，IL?24對(duì)多種癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移均具有抑制作用，同時(shí)也能誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡［6?7］。國內(nèi)張翔等［8］研究顯示，腺病毒過表達(dá)MDA?7能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

相關(guān)研究表明，MDA?7／IL?24基因在黑色素瘤細(xì)胞中呈明顯低表達(dá)，將其轉(zhuǎn)入惡性黑色素瘤細(xì)胞中，具有阻滯生長、促進(jìn)凋亡、促進(jìn)分化的作用，而與細(xì)胞中P53、P16、P21、RB、Ras、Bax等狀態(tài)無關(guān)，說明MDA?7／IL?24基因具備惡性腫瘤選擇性，且對(duì)正常細(xì)胞無毒性作用［9］。我們構(gòu)建了MDA?7／IL?24基因的腺病毒載體，通過腺病毒瘤內(nèi)注射的方式來增加肝癌移植瘤組織中MDA?7／IL?24的表達(dá)，聯(lián)合阿霉素腹腔注射后對(duì)腫瘤的生長情況進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，干預(yù)組小鼠腫瘤的體積和重量均明顯小于模型組，D組小鼠腫瘤的體積和重量顯著低于B組和C組。國內(nèi)外學(xué)者也有類似的文獻(xiàn)報(bào)道［10?11］，提示MDA?7／IL?24基因的腺病毒及阿霉素均能抑制肝癌的生長，腺病毒和阿霉素具有協(xié)同作用、聯(lián)合使用能更有效地抑制肝癌的生長。

肝癌組織的生長依賴于新生血管所提供的養(yǎng)分及細(xì)胞向周圍的浸潤和侵襲［12］。VEGF是一類特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有不同亞型，通過與相應(yīng)受體結(jié)合來促進(jìn)腫瘤血管的形成。VEGFC是新生血管的主要誘導(dǎo)物，主要通過與VEGFR2結(jié)合來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤組織中新生血管的生成［13］。MMP家族分子是促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤性生長的重要分子。由癌細(xì)胞合成和分泌的MMP3和MMP9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅴ、Ⅵ型膠原及層黏連蛋白等多種成分，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)的限制并向鄰近組織浸潤性生長［14］。本研究中，干預(yù)組小鼠腫瘤組織中MMP3、MMP9、VEGFC、VEGFR1 mRNA含量顯著低于模型組，聯(lián)合組小鼠腫瘤組織中MMP3、MMP9、VEGFC、VEGFR1 mRNA含量明顯低于阿霉素組、MDA?7／IL?24組。說明MDA?7／IL?24基因的腺病毒及阿霉素均能抑制肝癌組織中VEGF和MMP的表達(dá)，腺病毒和阿霉素具有協(xié)同作用，聯(lián)合使用能有效地抑制VEGF和MMP的表達(dá)。

本研究表明，MDA?7／IL?24基因聯(lián)合阿霉素能夠有效地抑制肝癌模型裸鼠的腫瘤生長，減少M(fèi)MP和VEGF的表達(dá)量，這或許可以為肝癌治療提供一種新的途徑，其應(yīng)用價(jià)值仍有待于更多基礎(chǔ)研究與臨床研究求證。

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（責(zé)任編輯：馬 軍）

EffectofMDA?7／IL?24genecombinedwithAdriamycinonmatrix metalloproteinase and vascular endothelial growth factor of hepatocarcinoma model nude mice

QIAN Heping，LIN Jiaxiao
1.Department of ICU，Haimen People’s Hospital，Haimen 226100；2.Department of Stomach and Liver Disease，Zhongda Hospital of Southeast University，China

Objective To investigate the effect of MDA?7／IL?24 gene combined with adriamycin on matrix metallo?proteinase and vascular endothelial growth factor（VEGF）of hepatocarcinoma model nude mice.Methods The model nude mice with transplanted hepatocellular carcinoma were constructed and divided into model group（group A），Adria?mycin group（group B），MDA?7／IL?24 group（group C）and combined intervention group（group D）.The groups were given different interventions.At 2 weeks and 6 weeks after the interventions，the gross tumor volume，weight，the ex?pression quantities of matrix metalloproteinases（MMP）and VEGF were measured.Results At 2 weeks and 6 weeks af?ter the interventions，the gross tumor volume and weight of mice in group B，C and D were significantly lower than those in group A（P＜0.05），the gross tumor volume and weight of mice in group D were significantly lower than those in group B and group C（P＜0.05），the mRNA levels of MMP3 and MMP9 in tumor tissues of mice in group B，C and D were significantly lower than those in group A（P＜0.05），the mRNA levels of MMP3 and MMP9 in tumor tissues of mice in group D were significantly lower than those in group B and group C（P＜0.05），the mRNA levels of VEGF?C and VEGFR2 in tumor tissues of mice in group B，C and D were significantly lower than those in group A（P＜0.05），and the mRNA levels of VEGF?C and VEGFR2 in tumor tissues of mice in group D were significantly lower than those in group B and group C（P＜0.05）.Conclusion MDA?7／IL?24 gene in combination with Adriamycin can effectively inhibit the tumor growth and reduce the expression quantities of MMP and VEGF in hepatocarcinoma model nude mice.

Hepatocarcinoma；Melanoma differentiated antigen?7；Interleukin?24；Matrix metalloproteinase；Vascu?lar endothelial growth factor

R735.7

A

1006－5709（2016）12－1471－04

2016?01?11

10.3969／j.issn.1006?5709.2016.12.049

江蘇省衛(wèi)生科研項(xiàng)目（P200911）

錢鶴平，研究方向：重癥醫(yī)學(xué)。E?mail：54241107＠qq.com