羅蘭云

四川省人民醫(yī)院肝膽脾胰外科和細胞移植中心，四川成都610072

microRNA?122抑制肝腫瘤細胞HepG2的增殖研究

羅蘭云

四川省人民醫(yī)院肝膽脾胰外科和細胞移植中心，四川成都610072

目的 探究microRNA?122（miR?122）對肝腫瘤細胞HepG2增殖的抑制效應(yīng)。方法 培養(yǎng)肝腫瘤細胞HepG2并隨機分為miR?122組、陰性對照組（NC組）、空白對照組，miR?122組使用LipofectamineTM2000試劑轉(zhuǎn)染肝癌細胞株HepG2細胞，NC組將陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞，空白對照組只加胎牛血清RPMI?1640培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h后，采用MTS試劑盒測定細胞活力，計算細胞增殖抑制率，采用熒光定量PCR測定細胞中凋亡抑制蛋白（XIAP）、細胞周期素D1（CyclinD1）、細胞周期蛋白依賴激酶2（CDK2）、細胞周期蛋白依賴激酶4（CDK4）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、VEGFR1、VEGFR2、肝細胞生長因子（HGF）的mRNA含量。結(jié)果 干預(yù)后24 h，miR?122組細胞的吸光值（OD）明顯低于空白對照組、NC組，細胞增殖抑制率明顯高于NC組（t＝9.43、19.475、P＜0.05），miR?122組細胞中XIAP、CyclinD1、CDK2、CDK4 mRNA含量明顯低于空白對照組、NC組（t＝8.135、7.542、11.740、5.937，P＜0.05），VEGF、VEGFR1、VEGFR2、HGF mRNA含量明顯低于空白對照組、NC組（t＝7.741、13.002、6.347、6.662，P＜0.05）。結(jié)論miR?122能夠抑制肝腫瘤細胞HepG2的增殖，靶向抑制細胞周期相關(guān)分子、血管新生相關(guān)分子的表達是miR?122發(fā)揮增殖抑制效應(yīng)的可能機制。

肝癌；microRNA?122；細胞周期；增殖；血管新生

肝癌是一類惡性程度較高、預(yù)后較差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，肝臟組織血供豐富、癌細胞增殖十分活躍，手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率高。盡管介入栓塞、射頻消融等治療手段的發(fā)展在一定程度上改善了肝癌患者的預(yù)后，但肝癌的生存率仍較低。無限增殖是肝癌細胞重要的生物學(xué)特征，抑制癌細胞增殖也是臨床上治療肝癌的重要靶點［1］。microRNA是一類長度18～25 bp的小分子非編碼RNA，通過抑制基因的表達來調(diào)節(jié)細胞的生物學(xué)行為［2?3］。miRNA?122（miR?122）是一類具有抑癌活性的miRNA，且肝癌組織中miR?122的表達量顯著降低，miR?122預(yù)期能夠抑制肝癌細胞的增殖［4］。本研究中，我們分析了miR?122對肝腫瘤細胞HepG2增殖的抑制效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 肝腫瘤細胞HepG2購自中國科學(xué)院上海細胞研究所；miR?122購自德國QI AGEN公司；細胞培養(yǎng)所用RPMI 1640、胎牛血清、胰蛋白酶均購自Hyclone公司；Trizol裂解液及轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒購自Promega公司，PCR所用引物由上海生工公司合成；顯微鏡購自日本Olympus公司；低溫高速離心機購自法國BIO?RAD公司；紫外分析儀購自上海天能科技有限公司（UV?2000）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及干預(yù)：肝腫瘤細胞HepG2復(fù)蘇后用含有10%胎牛血清的RPMI 1640進行培養(yǎng)，每2～3 d換液一次，待細胞密度生長至80%～90%后進行消化傳代，消化所用胰蛋白酶的濃度為0.25%，消化后的細胞分別接種在培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板中，培養(yǎng)瓶中的細胞用于繼續(xù)消化傳代，培養(yǎng)板中的細胞用于處理，根據(jù)處理條件不同分為miR?122組、陰性對照組（NC組）、空白對照組。miR?122組使用LipofectamineTM2000試劑轉(zhuǎn)染肝癌細胞株HepG2細胞，NC組將陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞（轉(zhuǎn)染時間為24 h）；空白對照組只加含10%胎牛血清RPMI?1640培養(yǎng)基。

1.2.2 細胞活力檢測：用于細胞周期檢測的細胞接種在6孔培養(yǎng)板中，處理24 h后在培養(yǎng)體系中加入細胞活力檢測液20 μl，繼續(xù)孵育4 h后，在酶標(biāo)儀上讀取450 nm處的吸光值（OD值），計算細胞增殖抑制率（%）＝（空白對照組－處理組）／空白對照組×100%。

1.2.3 分子mRNA含量的檢測：用于mRNA含量檢測的細胞接種在6孔培養(yǎng)板中，處理24 h和48 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌兩遍后將細胞培養(yǎng)板放置在－80℃低溫冰箱保存。檢測時，取出細胞培養(yǎng)板，每孔加入Trizol裂解液1 ml，充分裂解細胞后用三氯甲烷和異丙醇進行萃取、離心，得到RNA斑塊后用75%酒精洗滌2遍，最后用適量DEPC水溶解。取RNA樣本并進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈；取cDNA樣本并用熒光定量PCR試劑盒進行擴增，分別擴增凋亡抑制蛋白（XIAP）、細胞周期素D1（CyclinD1）、細胞周期蛋白依賴激酶2（CDK2）、細胞周期蛋白依賴激酶4（CDK4）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、VEGFR1、VEGFR2、肝細胞生長因子（HGF），以甘油醛?3?磷酸脫氫酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參照，計算上述分子的mRNA含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以x ±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD?t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞活力及抑制率 干預(yù)后24 h，miR?122組細胞的OD值明顯低于空白對照組、NC組，細胞增殖抑制率明顯高于NC組（P＜0.05）；空白對照組和NC組OD值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

表1 三組細胞的活力及抑制率比較（x±s）Tab 1 Comparison of activity and inhibition rate in 3 groups（x±s）

2.2 細胞周期相關(guān)蛋白的mRNA表達量 干預(yù)后24 h，miR?122組細胞中XIAP、CyclinD1、CDK2、CDK4 mRNA含量明顯低于空白對照組、NC組（P＜0.05）；空白對照組與NC組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。

表2 三組細胞中細胞周期相關(guān)蛋白的mRNA表達量比較（x ±s）Tab 2 Expressions of cell cycle related proteins in 3 groups of cells（x ±s）

2.3 血管新生分子的mRNA表達量 干預(yù)后24 h，miR?122組細胞中VEGF、VEGFR1、VEGFR2、HGF mRNA含量明顯低于空白對照組、NC組（P＜0.05）；空白對照組與NC組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表3）。

表3 三組細胞中血管新生分子的mRNA表達量（x ±s）Tab 3 Expressions of angiogenic molecules in 3 groups of cells（x ±s）

注：與空白對照組比較，t＝7.229、11.826、6.636、6.291、?P＜0.05；與NC組比較，t＝7.741、13.002、6.347、6.662，＃P＜0.05。

3 討論

microRNA是近年來新發(fā)現(xiàn)的非編碼小分子RNA，通過與mRNA 3’UTR區(qū)域互補配對抑制靶基因的翻譯［5］。miR?122是在肝臟組織中特異性表達的一類miRNA，對肝細胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)特征均具有調(diào)節(jié)作用［6］。近年來研究證實，miR?122具有抑癌活性，肝癌組織中低表達的miR?122與細胞增殖、細胞周期相關(guān)［7］。但miR?122是否直接調(diào)控肝癌細胞的增殖尚不明確，能否通過轉(zhuǎn)染降低癌變細胞的表達或采用miR?122替代治療肝癌還有很多爭議［8］。本文通過轉(zhuǎn)染miR?122模擬物的方式來增加肝癌細胞中miR?122的表達，而后對細胞活力及抑制率進行分析，結(jié)果表明，miR?122組細胞的OD值明顯低于空白對照組、NC組，抑制率明顯高于NC組，提示miR?122能夠降低肝癌細胞的活力，促進腫瘤細胞的凋亡。

細胞周期相關(guān)蛋白是調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞周期發(fā)展的重要分子。XIAP是體內(nèi)重要的凋亡抑制分子，能夠通過調(diào)節(jié)下游Cyclin／CDK的活性來促進細胞增殖［9］。已有研究證實，XIAP能夠增加細胞周期蛋白CyclinD1及其激酶CDK2、CDK4的表達，進而加速細胞周期進程、促進細胞增殖［10?11］。CyclinD1是細胞周期蛋白家族的重要成員，與CDK2、CDK4形成復(fù)合體后能夠啟動E2F2下游通路、縮短細胞周期、促進細胞增殖［12］。通過對上述細胞周期相關(guān)蛋白表達量的分析，miR?122組細胞中XIAP、CyclinD1、CDK2、CDK4 mRNA含量明顯低于空白對照組、NC組。說明miR?122能夠靶向抑制肝癌細胞中細胞周期相關(guān)蛋白XIAP、CyclinD1、CDK2、CDK4表達。

肝癌病灶內(nèi)新生血管生成是促進肝癌細胞增殖的重要病理環(huán)節(jié)，新生的血管能夠為細胞增殖提供必需的氧氣及養(yǎng)分［13］。VEGF是目前已知促血管新生效應(yīng)最為明確的細胞因子，通過與血管內(nèi)皮細胞上的受體VEGFR1、VEGFR2結(jié)合促進新生血管的形成［14］。HGF是具有促進血管新生作用的多功能細胞因子，在肝細胞增殖、轉(zhuǎn)移及局部組織血管新生的過程中均發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用［15］。在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，局部組織中高表達的VEGF、HGF能夠促進肝癌的病情進展［16］。本研究同樣證實，miR?122能夠靶向抑制肝癌細胞中促血管新生分子VEGF、VEGFR1、VEG?FR2、HGF的表達。

本研究表明，miR?122能夠抑制肝腫瘤細胞HepG2的增殖，靶向抑制細胞周期相關(guān)分子、血管新生相關(guān)分子的表達是miR?122發(fā)揮增殖抑制效應(yīng)的可能機制。需要指出的是，miR?122抑制肝癌生長的途徑很多，如抗凋亡蛋白Bcl?w的表達等，本研究局限于實驗條件的限制，檢測指標(biāo)相對較少，miR?122抑制肝腫瘤細胞HepG2增殖的作用機制還有待更多的實驗研究去證實。

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（責(zé)任編輯：馬 軍）

Research on microRNA?122 inhibiting the proliferation of hepatocellular carcinoma cells HepG2

LUO Lanyun
Department of Liver，Spleen and Pancreatic Surgery and Cell Transplantation Center，Sichuan Provincial People’s Hos?pital，Chengdu 610072，China

Objective To investigate the inhibiting effect of microRNA?122（miR?122）on the proliferation of hepa?tocellular carcinoma cells HepG2.Methods The hepatocellular carcinoma cells HepG2 were cultured and randomly di?vided into miR?122 group，negative control group（NC group）and blank control group.In miR?122 group，the HepG2 cells were transfected by LipofectamineTM2000 reagent.In NC group，the HepG2 cells were transfected by siRNA.In blank control group，only the fetal bovine serum culture medium RPMI?1640 was added.Twenty?four hours after the transfection，the cell viability was measured by MTS kit，and the cellular proliferation inhibition rate was calculated.Fluorescence quantitative PCR was adopted to measure the mRNA levels of X linked inhibitor of apoptosis protein（XI?AP），CyclinD1，cyclin dependent kinase 2（CDK2），cyclin dependent kinase 4（CDK4），vascular endothelial growth factor（VEGF），VEGFR1，VEGFR2 and hepatocyte growth factor（HGF）.Results Twenty?four hours after the treat?ment，the optical density（OD）of cells in miR?122 group was significantly lower than that in blank control group and NC group，and the cellular proliferation inhibition rate was significantly higher than that in the NC group（t＝9.43，19.475，P＜0.05）.The mRNA levels of XIAP，CyclinD，CDK2 and CDK 4 in miR?122 group were significantly lower than those in blank control group and NC group（t＝8.135，7.542，11.740，5.937，P＜0.05），and the mRNA levels of VEGF，VEGFR1，VEGFR2 and HGF were significantly lower than those in blank control group and NC group（t＝7.741，13.002，6.347，6.662，P＜0.05）.Conclusion microRNA?122 can inhibit the proliferation of hepatocellular car?cinoma cell HepG2，and the possible mechanism is targeted inhibition of the expression of cell cycle relevant molecules and angiogenesis relevant molecules.

Hepatocellular carcinoma；MicroRNA?122；Cell cycle；Proliferation；Angiogenesis

R735.7

A

1006－5709（2016）12－1467－04

2016?02?26

10.3969／j.issn.1006?5709.2016.12.048

羅蘭云，碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：包蟲病和細胞移植。E?mail：54241107＠qq.com