弗氏鏈霉菌tylF基因的克隆及其生物信息學(xué)分析

閆明亮

(中國(guó)人民解放軍海軍工程大學(xué)電氣工程學(xué)院，湖北武漢 430000)

弗氏鏈霉菌tylF基因的克隆及其生物信息學(xué)分析

閆明亮

(中國(guó)人民解放軍海軍工程大學(xué)電氣工程學(xué)院，湖北武漢 430000)

摘要[目的]研究弗氏鏈霉菌tylF基因的克隆及其生物信息學(xué)分析。[方法]利用RT-PCR技術(shù)、巢式PCR技術(shù)和RACE技術(shù)從弗氏鏈霉菌B-62169菌株中克隆獲得tylF基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其生物信息學(xué)進(jìn)行分析。[結(jié)果]經(jīng)Vector NTI 11.0軟件拼接獲得tylF基因全長(zhǎng)cDNA序列長(zhǎng)度為1 245 bp，并帶有19 bp長(zhǎng)的Poly(A)尾巴，包含927 bp的開(kāi)放讀碼框(ORF)，編碼一個(gè)含309個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，tylF基因編碼的酶是大菌素-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，參與分子功能中甲基轉(zhuǎn)移酶活性和生物學(xué)途徑中甲基化過(guò)程。對(duì)tylF基因全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析，證實(shí)該基因編碼TylF蛋白，并具有223個(gè)氨基酸蛋白結(jié)構(gòu)域。[結(jié)論]該研究為闡明泰樂(lè)菌素生物合成過(guò)程中甲基化反應(yīng)機(jī)理，更進(jìn)一步研究大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素生物合成代謝途徑提供生物信息學(xué)數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞tylF；泰樂(lè)菌素；弗氏鏈霉菌；基因克隆

鏈霉菌(Streptomyces)屬于放線(xiàn)菌目鏈霉菌科原核生物，是一類(lèi)具有絲狀分枝細(xì)胞的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[1]。泰樂(lè)菌素[2](Tylosin)，又名泰樂(lè)星，是一類(lèi)16元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)畜禽專(zhuān)用抗生素，其產(chǎn)生菌[2]有弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)、龜裂鏈霉菌(Streptomyces romosus)和吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)，其中弗氏鏈霉菌是泰樂(lè)菌素的主要產(chǎn)生菌，同時(shí)也是工業(yè)化生產(chǎn)泰樂(lè)菌素的工程菌株。泰樂(lè)菌素是一種畜禽專(zhuān)用抗生素，其主要用于飼料添加劑和動(dòng)物治療如豬氣喘病、雞慢性呼吸道病、動(dòng)物消化道疾病、地方性動(dòng)物支氣管炎等，能明顯促進(jìn)禽畜生長(zhǎng)、提高飼料利用率[3]等，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

tylF基因編碼的大菌素-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，催化泰樂(lè)菌素C3位羥基的甲基化反應(yīng)[4]。泰樂(lè)菌素C3位羥基的甲基化反應(yīng)是泰樂(lè)菌素生物合成的最后一步，也是限速反應(yīng)[5]。目前關(guān)于弗氏鏈霉菌tylF基因克隆的研究較少，弗氏鏈霉菌研究主要集中于工程菌株的構(gòu)建和發(fā)酵生產(chǎn)方面，2012年范亮等[6]利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建了具有雙拷貝tylF基因的泰樂(lè)菌素基因工程菌株，結(jié)果比相同條件下未轉(zhuǎn)化菌種生產(chǎn)泰樂(lè)菌素的能力提高了32.7%。但這些研究并未獲得tylF基因全長(zhǎng)cDNA序列，只是根據(jù)NCBI上的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。筆者通過(guò)對(duì)tylF基因全長(zhǎng)序列克隆及其生物信息學(xué)分析，不僅可以從分子角度進(jìn)一步闡明泰樂(lè)菌素的生物合成過(guò)程，還可以更進(jìn)一步研究大環(huán)內(nèi)酯抗生素生物合成過(guò)程的未知代謝機(jī)理，明晰抗生素生物合成代謝途徑中的未知假定。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種和試劑。弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiaeB-62169)購(gòu)于北京微生物菌種保藏中心。RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，RACE克隆試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，pMD18-T載體、RT-PCR以及大腸桿菌E.coliDH5α等相關(guān)試劑購(gòu)自大連寶生物公司。

1.1.2培養(yǎng)基。大腸桿菌的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，弗氏鏈霉菌的固體培養(yǎng)基為AS-2(Yeasteztract)培養(yǎng)基，弗氏鏈霉菌的液體培養(yǎng)基為T(mén)SB(Tryptonesoyabroth)培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1弗氏鏈霉菌總RNA的提取。將弗氏鏈霉菌在AS-2平板上活化培養(yǎng)，再?gòu)腁S-2平板上挑取單菌落接種至含有25mLTSB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在培養(yǎng)溫度37 ℃、搖床220r/min下振蕩培養(yǎng)10～12h后，將三角瓶靜止放置10min，然后在12 000r/min下離心10min收集菌體細(xì)胞。按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取弗氏鏈霉菌總RNA，電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，并將其保存，為下一步反轉(zhuǎn)錄備用。

1.2.2tylF基因的克隆。

1.2.2.1cDNA第一條鏈合成。參考Bio-Rad公司RevertAidTMfirststrandcDNASynthesisKit反轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成，在42 ℃下反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束后在70 ℃下處理5min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2RT-PCR反應(yīng)體系。根據(jù)GenBank中tylF基因的氨基酸保守序列設(shè)計(jì)該基因簡(jiǎn)并引物PF和PR，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系25.0μL：2.0μL模板cDNA，2.5μL10×TaqDNAPolymerasBuffer，0.9μL10mmol/LdNTPs，1.0μL引物F1，1.0μl引物R1，0.3μLTaqDNAPolymeras，ddH2O補(bǔ)齊至25.0μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性40s，59 ℃退火60s，72 ℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10min。

表1　弗氏鏈霉菌tylF基因克隆的引物

1.2.2.33′-RACE克隆。按照RACE克隆試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RACE克隆。利用試劑盒合成3′-ReadycDNA并根據(jù)RT-PCR獲得的已知序列設(shè)計(jì)2條反向嵌套PCR引物PF1、PR2(表1)。正向引物為試劑盒中所帶UMP。用引物UMP和PF1配對(duì)3′-ReadycDNA進(jìn)行第1輪PCR；并取第一輪PCR產(chǎn)物1.0μL為模板，用引物UMP和PR2配對(duì)進(jìn)行第2輪PCR。

1.2.2.45′-RACE克隆。按照RACE克隆試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RACE克隆。利用試劑盒合成5′-ReadycDNA并根據(jù)RT-PCR獲得的已知序列設(shè)計(jì)2條反向嵌套PCR引物PF3、PR4(表1)。正向引物為試劑盒中所帶UMP。用引物UMP和PF3配對(duì)5′-ReadycDNA進(jìn)行第1輪PCR；并取第一輪PCR產(chǎn)物1.0μL為模板，用引物UMP和PR4配對(duì)進(jìn)行第2輪PCR。

1.2.2.5全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增。將3′-RACE和5′-RACE擴(kuò)增獲得的3′端和5′端cDNA序列在軟件VectorNTI11.0上進(jìn)行序列拼接，通過(guò)軟件拼接獲得全長(zhǎng)cDNA序列，并利用獲得的序列設(shè)計(jì)兩端引物PF5、PR6(表1)擴(kuò)增tylF基因全長(zhǎng)的cDNA序列。PCR反應(yīng)體系25.0μL：2.0μL模板cDNA，2.5μL10×TaqDNAPolymerasBuffer，0.9μL10mmol/LdNTPs，1.0μL引物F1，1.0μL引物R1，0.5μLTaqDNAPolymeras，ddH2O補(bǔ)齊至25.0μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性40s，60 ℃退火60s，72 ℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10min。

1.2.2.6測(cè)序及序列生物信息學(xué)分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切下目的條帶，采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收后，將純化回收的目的基因片段與pMD18-T載體連接。將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將驗(yàn)證成功轉(zhuǎn)化感受態(tài)的菌液應(yīng)用M13通用引物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。

1.2.3測(cè)序及測(cè)序結(jié)果生物信息學(xué)分析。將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用Blast2go軟件[7-8](http：//www.blast2go.com/b2ghome)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用Pfam在線(xiàn)軟件[9](http：//pfam.xfam.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1弗氏鏈霉菌tylF基因保守序列cDNA克隆與分析以弗氏鏈霉菌的cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)好的引物PF和PR進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果獲得片段約為800bp的目的條帶。將該片段純化后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)中，篩選陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR檢驗(yàn)和測(cè)序分析，結(jié)果表明，RT-PCR獲得的目的片段長(zhǎng)度為821bp(圖1)。將該片段的核苷酸序列與NCBI中的序列進(jìn)行比對(duì)，其結(jié)果與恥垢分枝桿菌和鳥(niǎo)型分枝桿菌中的tylF基因同源性分別達(dá)70%和76%，初步說(shuō)明已經(jīng)成功獲得了tylF基因的部分序列。

注：M.DL2 000 Marker,1.陰性對(duì)照,2.tylF基因保守序列陽(yáng)性克隆。Note：M.DL2 000 Marker, 1.Negative control, 2.Positive clone of tylF gene conserved sequence.圖1　tylF基因保守序列電泳圖譜Fig.1　Agarose gel electrophoretic analysis of tylF gene PCR products

2.2弗氏鏈霉菌tylF基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆與分析由圖2可知，利用3′-RACE技術(shù)克隆獲得cDNA片段長(zhǎng)度為417bp，其中有196bp與已經(jīng)克隆獲得的821bp中間片段具有重疊區(qū)，同時(shí)帶有19bp長(zhǎng)的Poly(A)尾巴。利用5′-RACE技術(shù)克隆獲得cDNA片段長(zhǎng)度為305bp，其中有102bp與已經(jīng)克隆獲得的821bp中間片段具有重疊區(qū)。通過(guò)VectorNTI11.0軟件對(duì)已經(jīng)獲得的3′-RACE片段序列、5′-RACE片段序列以及RT-PCR片段序列進(jìn)行比對(duì)和拼接，從而獲得弗氏鏈霉菌tylF基因全長(zhǎng)cDNA序列。由圖3可知，弗氏鏈霉菌tylF基因全長(zhǎng)cDNA序列全長(zhǎng)為1 245bp，并帶有19bp長(zhǎng)的Poly(A)，tylF基因起始密碼子ATG位于203nt處，終止密碼子TAG位于1 130nt處。全長(zhǎng)1 245bp序列中包含203bp的5′端非翻譯區(qū)(UTR，untranslatedregion)和115bp的3′端非翻譯區(qū)，以及927bp的開(kāi)放讀碼框(ORF)，編碼一個(gè)含309個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，經(jīng)預(yù)測(cè)編碼TylF蛋白。

注：M.DL 2 000 Marker，1.5′-RACE PCR產(chǎn)物，2.3′-RACE PCR產(chǎn)物。Note：M.DL 2 000 Marker，1.5’-RACE PCR products，2.3’-RACE PCR products.圖2　tylF基因RACE擴(kuò)增電泳圖譜Fig.2　Agarose gel electrophoretic analysis of tylF gene RACE PCR products

注：M.DL2 000 Marker，1和2.tylF基因全長(zhǎng)cDNA序列陽(yáng)性克隆，3.陰性對(duì)照。Note：M.DL 2 000 Marker，1 and 2.The cDNA sequence positive cloning of the whole tylF gene，3.Negative control.圖3　tylF基因全長(zhǎng)cDNA序列電泳圖譜Fig.3　Agarose gel electrophoretic analysis of tylF gene cDNA sequence

2.3弗氏鏈霉菌tylF基因全長(zhǎng)cDNA序列生物信息學(xué)分析將已經(jīng)獲得的弗氏鏈霉菌tylF基因全長(zhǎng)序列編輯成fasta格式文件，利用生物信息學(xué)軟件Blast2go對(duì)tylF基因進(jìn)行功能注釋分析和KEGG代謝途徑分析。由圖4可知，tylF基因被功能注釋為大菌素-O-甲基轉(zhuǎn)移酶。同時(shí)GO功能注釋結(jié)果顯示，其被注釋到參與分子功能中甲基轉(zhuǎn)移酶活性和生物學(xué)途徑中甲基化過(guò)程。由圖5可知，tylF基因被注釋上的酶標(biāo)號(hào)為EC2.1.1.101，是大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)衍生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因。由圖6可知，獲得的tylF基因全長(zhǎng)cDNA序列包含了整個(gè)TylF蛋白保守結(jié)構(gòu)域，其長(zhǎng)度為223個(gè)氨基酸。

圖4　tylF注釋信息Fig.4　tylF gene annotation information

注：紅色框標(biāo)記為tylF基因所參與大環(huán)丙酯類(lèi)衍生物合成的作用位置。Note: The red box was the interaction site of tylF gene participated in macrolide derivatives synthesis. 圖5　大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)衍生物合成途徑Fig.5　Biosynthesis of meberde macrolides

圖6　TylF蛋白保守域分析Fig.6　Analysis protein domain of TyLF gene

3結(jié)論與討論

該研究利用RT-PCR技術(shù)從弗氏鏈霉菌B-62169菌株中克隆獲得tylF基因的保守序列，同時(shí)利用巢式PCR技術(shù)、3′-RACE和5′-RACE技術(shù)獲得tylF基因的全長(zhǎng)cDNA序列。通過(guò)VectorNTI11.0軟件拼接獲得的弗氏鏈霉菌tylF基因全長(zhǎng)cDNA序列全長(zhǎng)為1 245bp，并帶有19bp長(zhǎng)的poly(A)尾巴，該基因起始密碼子ATG位于203nt處，終止密碼子TAG位于1 130nt處，全長(zhǎng)序列中包含203bp的5′端非翻譯區(qū)和115bp的3′端非翻譯區(qū)，以及927bp的開(kāi)放讀碼框(ORF)，編碼一個(gè)含309個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，經(jīng)預(yù)測(cè)編碼TylF蛋白。通過(guò)生物信息學(xué)分析軟件對(duì)該基因進(jìn)行了全面系統(tǒng)的分析，tylF基因編碼的酶是大菌素-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，對(duì)該基因功能注釋結(jié)果顯示其參與分子功能中甲基轉(zhuǎn)移酶活性和生物學(xué)途徑中甲基化過(guò)程。tylF基因在KEGG代謝過(guò)程中被注釋的酶標(biāo)號(hào)為EC2.1.1.101，是大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)衍生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因。將獲得tylF基因全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析，證實(shí)該基因編碼TylF蛋白，并具有223個(gè)氨基酸蛋白結(jié)構(gòu)域。

在NCBI尚未公布有關(guān)弗氏鏈霉菌中tylF基因全長(zhǎng)cDNA序列的信息，僅有恥垢分枝桿菌、鳥(niǎo)型分枝桿菌等分歧桿菌中tylF基因mRNA序列。該研究結(jié)合生物學(xué)知識(shí)和生物信息學(xué)分析，更進(jìn)一步對(duì)tylF基因信息進(jìn)行研究，重點(diǎn)從轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面上解釋了tylF基因參與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)衍生物合成途徑中的關(guān)系，明晰了泰樂(lè)菌素抗生素合成代謝的積累機(jī)制，為今后定向提高大環(huán)內(nèi)酯抗生素的產(chǎn)量提供參考。

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CloningandBioinformaticsAnalysisoftylFGeneinStreptomyces fradiae

YANMing-liang

(CollegeofElectricalEngineering,NavalUniversityofEngineering,PLA,Wuhan,Hubei4300000)

Abstract[Objective] To research the cloning and bioinformatics analysis of tylF gene in Streptomyces fradiae. [Method] The partial cDNA of tylF was cloned from Streptomyces fradiae B-62169 through RT-PCR technique by specific primers designed on the basis of tylF gene in GenBank website. And its bioinformatics analysis was carried out. [Result] A 1245 bp full length cDNA sequence of tylF was obtained using nested PCR and RACE technique. The cloned tylF cDNA contained an open reading frame (ORF) of 927 bp and was predicted to encode a deduced protein with 309 amino acid residues. Bioinformatics analysis results showed that the gene encoding enzymes was macrocin-O-methyl transferase, which participated in the methylation process of methyltransferase activity and biological pathways in molecular function. Full-length cDNA sequence of the tylF structural gene for protein domain analysis confirmed that the gene encoding TylF protein having 223 amino acids was completed and the protein domains. [Conclusion] This research provides data support for the methylation reaction mechanism of tylosin biosynthetic process, and the further researches on biosynthesis and metabolic pathways of macrolides antibiotics.

Key wordstylF; Tylosin; Streptomyces fradiae; Gene cloning

作者簡(jiǎn)介閆明亮(1993- )，男，吉林通化人，本科生，專(zhuān)業(yè)：電氣工程。

收稿日期2016-03-30

中圖分類(lèi)號(hào)Q 81

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)12-126-04