袁夢嬌　商正玲　馬亞萍　吳家紅

(貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，貴陽550025)

小鼠ANA-1巨噬細(xì)胞不同極化狀態(tài)下補(bǔ)體組分mRNA動態(tài)分析①

袁夢嬌商正玲馬亞萍吳家紅②

(貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，貴陽550025)

[摘要]目的：觀察小鼠ANA-1巨噬細(xì)胞不同極化狀態(tài)下補(bǔ)體相關(guān)組分的mRNA動態(tài)變化。方法：分別以LPS(1 μg/ml)、IL-4(20 ng/ml)體外刺激小鼠ANA-1細(xì)胞，于刺激后3、8、12及24 h時間點收獲細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用實時熒光定量PCR法檢測IL-1β、CCL2、Arg-1的表達(dá)，判斷細(xì)胞極化情況，檢測胞內(nèi)C3、CfB、CRIg、C1q補(bǔ)體分子mRNA的動態(tài)表達(dá)。結(jié)果：細(xì)胞極化情況：刺激3 h后LPS組IL-1β、CCL2 的mRNA表達(dá)上調(diào)，12 h達(dá)高峰(2-△△Ct分別為297.0±31.0和19.9±3.3)；在IL-4組中以Arg-1mRNA表達(dá)上調(diào)顯著，于24 h達(dá)高峰(2-△△Ct：27.3±9.1)，提示LPS組細(xì)胞向M1方向極化，IL-4組向M2方向極化。細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)體mRNA的動態(tài)：兩極化組的相應(yīng)補(bǔ)體組分均表現(xiàn)為不同程度的上調(diào)，其中：C1q、C3在M2極化組刺激8 h后顯著上調(diào)，刺激12 h時達(dá)高峰(2-△△Ct分別為94.9±12.9和11.3±2.4)；CfB因子在M1極化組中顯著上調(diào)，以刺激12 h表達(dá)上調(diào)達(dá)高峰(2-△△Ct為61.4±6.2)；CRIg在兩組中均在24 h時表達(dá)上調(diào)且具有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論：LPS/IL-4刺激3 h后，ANA-1細(xì)胞分別向M1、M2方向極化；不同補(bǔ)體組分mRNA的表達(dá)在兩組中均上調(diào)但表達(dá)譜不同，其中C1q、C3和CRIg在M2極化組中上調(diào)更為顯著，而CfB因子在M1極化組中顯著上調(diào)；除CRIg外，C1q、C3及CfB因子均在刺激12 h時上調(diào)達(dá)高峰，上述結(jié)果提示補(bǔ)體組分的變化可能與極化的巨噬細(xì)胞功能有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]ANA-1；巨噬細(xì)胞極化；補(bǔ)體組分mRNA

在脊椎動物體內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)由30多種蛋白組成，通常以無活性的形式廣泛存在于血液、組織液和細(xì)胞膜表面，是機(jī)體固有免疫的重要組成成分[1]。除血液中的補(bǔ)體成分主要由肝細(xì)胞合成分泌外，機(jī)體局部組織中的肝外補(bǔ)體主要來自活化的巨噬細(xì)胞。近年來，不同微環(huán)境造成巨噬細(xì)胞的極化而導(dǎo)致不同的免疫結(jié)局成為研究的熱點問題。Th1型細(xì)胞因子(如IFN-γ)、TLR配體(如LPS)和一些危險信號可刺激巨噬細(xì)胞向M1方向極化，導(dǎo)致IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL2、活性氮和氧中間體的分泌釋放增多，MHCⅠ和MHCⅡ的表達(dá)增高，細(xì)胞具有較強(qiáng)的促炎作用、抗原提呈能力和殺微生物的特點。而IL-4、IL-13等Th2型細(xì)胞因子，可刺激巨噬細(xì)胞向M2方向極化，細(xì)胞以IL-10、Arg-1高表達(dá)和IL-12低表達(dá)為特征，參與抗寄生蟲免疫、局部組織修復(fù)，炎癥抑制等作用[2]。

巨噬細(xì)胞和補(bǔ)體系統(tǒng)同屬機(jī)體固有免疫的重要代表，然而人們對不同極化狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞表達(dá)補(bǔ)體的差異及規(guī)律認(rèn)識不足[3]，故本研究以LPS和IL-4分別刺激小鼠巨噬細(xì)胞ANA-1建立細(xì)胞極化模型后，檢測細(xì)胞內(nèi)不同補(bǔ)體成分mRNA的變化，為探究不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞表達(dá)補(bǔ)體組分的差異和規(guī)律提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基、100 U/ml青-鏈霉素、胰蛋白酶(HyClone公司)；Trizol Reagent(Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa Biotechnology公司)；胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)；IL-4(eBioscience 公司)；LPS(Sigma公司)。

1.1.2細(xì)胞ANA-1細(xì)胞系來源于C57BL/6小鼠的骨髓單核巨噬細(xì)胞[4]，為四川大學(xué)鮑郎教授惠贈。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞ANA-1用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，2～3 d傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗；

1.2.2LPS/IL-4刺激ANA-1細(xì)胞ANA-1細(xì)胞以106個/孔接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h 后，將LPS(1 μg/ml)、IL-4(20 ng/ml)分別添加到ANA-1細(xì)胞培養(yǎng)基中。以添加等量PBS的細(xì)胞組作為空白對照。于刺激3、8、12、24 h后，PBS洗2次，收集細(xì)胞。

1.2.3Trizol法提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄收集細(xì)胞后用Trizol法提取總RNA：加入Trizol裂解液1 ml裂解細(xì)胞15 min后，加入氯仿200 μl，劇烈震蕩15 s，離心12 000 r/min，4℃，15 min。吸取上層水相，轉(zhuǎn)入新的1.5 ml Ep管，加入等體積異丙醇，混勻，-20℃靜置1 h后離心12 000 r/min，4℃，10 min。棄上清，加入75%乙醇(以DEPC水配制)1 ml洗滌，7 500 r/min，5 min，4℃離心，棄上清，室溫干燥后溶于20 μl DEPC水中并定量。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存。之后用實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)法檢測相關(guān)基因的表達(dá)。

1.2.4Real-Time PCR法檢測相關(guān)基因mRNA的表達(dá)采用SYBR-Green染料法檢測LPS/IL-4刺激細(xì)胞后各基因的表達(dá)水平。引物在上海捷瑞有限公司合成。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，退火31 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因。目的基因mRNA表達(dá)水平采用2-△△Ct公式計算。判斷依據(jù)：2-△△Ct>2認(rèn)為基因表達(dá)增高，2-△△Ct<0.5認(rèn)為基因表達(dá)下調(diào)。引物序列見表1。

表1Real-Time PCR引物序列

Tab.1Sequence of Real-Time PCR primers

Forwardsequence(5'-3')Reversesequence(5'-3')ProductsizeIL-1βTGTGAAATGCCACCTTTTGATGTCCTCATCCTGGAAGGTC240CCL2TTAAGGCATCACAGTCCGAGTGAATGTGAAGTTGACCCGT129Arg-1CAGAAGAATGGAAGAGTCAGCAGATATGCAGGGAGTCACC249C3GCAGGTCATCAAGTCGGCTTAGCTGGTGTTGGGCTTTTC162CRIgGGACGAAGAGACCTGTTGTAGATGAGTGTTCGGACGC278CfBCTCGAACCTGCAGATCCACTCAAAGTCCTGCGGTCGT112C1qTAGAAGCATCACAGAACATAGAAGCAGCAGTAACAG108

2結(jié)果

2.1LPS/IL-4刺激后 ANA-1細(xì)胞的極化結(jié)果顯示：各檢測時間點PBS對照組胞內(nèi)IL-1β、CCL2、Arg-1 mRNA的表達(dá)穩(wěn)定(圖1)。而LPS刺激組3 h后IL-1β mRNA表達(dá)明顯增高，12 h達(dá)高峰(2-△△Ct值達(dá)297.0±31.0)，24 h仍可維持較高水平(2-△△Ct值達(dá)64.0±13.1)；CCL2 mRNA也表現(xiàn)為相似的動態(tài)，于12 h達(dá)高峰(2-△△Ct值達(dá)19.9±3.3)。但Arg-1 mRNA的表達(dá)以IL-4組顯著增加，于24 h達(dá)高峰(2-△△Ct值達(dá)27.3±9.1)，而在LPS組中表達(dá)不明顯。上述結(jié)果表明LPS刺激組ANA-1細(xì)胞向M1方向極化，而IL-4刺激組細(xì)胞向M2方向極化(圖2)。

2.2不同時間點PBS組胞內(nèi)各補(bǔ)體成分mRNA的動態(tài)結(jié)果顯示：各檢測時間點內(nèi)PBS對照組細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)體C1q、C3、CfB、CRIg mRNA動態(tài)均無顯著性差異(圖3)。

2.3不同極化狀態(tài)下胞內(nèi)補(bǔ)體C1q mRNA的動態(tài)結(jié)果顯示： M2組(IL-4刺激組)C1q mRNA水平在8 h后顯著高于LPS組， 12 h時達(dá)高峰(2-△△Ct值為94.9±12.9)，24 h時下降(2-△△Ct值為4.1±4.0)。而在M1組(LPS刺激組)中C1q mRNA波動不明顯，僅在12 h瞬時上調(diào)(2-△△Ct值為5.3±0.7)(圖4A)。

2.4不同極化狀態(tài)下胞內(nèi)補(bǔ)體CfB mRNA的動態(tài)結(jié)果顯示： M2組3 h CfB表達(dá)開始上調(diào)，以8 h上調(diào)達(dá)高峰(2-△△Ct值為4.75±1.43)。M1組在刺激8 h時表達(dá)上調(diào)(2-△△Ct值可達(dá)14.4±1.4)，以12 h達(dá)高峰(2-△△Ct值可達(dá)61.4±6.2)，24 h后表達(dá)減弱(2-△△Ct值達(dá)8.6±2.3)。CfB基因表達(dá)以M1組上調(diào)差異顯著(圖4B)。

圖1　PBS作用ANA-1細(xì)胞后胞內(nèi)IL-1β、CCL2、Arg-1 mRNA的表達(dá)Fig.1　Expression of IL-1β,CCL2，Arginase-1 mRNA in ANA-1 cells treated with PBS

圖2　LPS/IL-4刺激ANA-1細(xì)胞后胞內(nèi)IL-1β、CCL2、Arg-1 mRNA相對表達(dá)量(2-△△Ct)Fig.2　Relative expression of IL-1β,CCL2，Arge-1 mRNA in ANA-1 cells treated with LPS and IL-4，respectively(2-△△Ct)Note: The 2-△△Ct of LPS groups compared with IL-4 groups，**.P<0.01；***.P<0.001.

圖3　PBS作用ANA-1細(xì)胞后胞內(nèi)C1q、CfB、CRIg、C3 mRNA的表達(dá)Fig.3　Expression of C1q，CfB，CRIg，C3 mRNA in ANA-1 cells treated with PBS

圖4　LPS/IL-4刺激ANA-1細(xì)胞后胞內(nèi)C1q、CfB、CRIg、C3相對表達(dá)量(2-△△Ct)Fig.4　Relative expression of C1q，CfB，CRIg，C3 mRNA in ANA-1 cells treated with LPS and IL-4，respectively(2-△△Ct)Note: The 2-△△Ct of LPS groups compared with IL-4 groups，*.P<0.05；***.P<0.001.

2.5不同極化狀態(tài)下胞內(nèi)補(bǔ)體CRIg mRNA的動態(tài)結(jié)果顯示：刺激24 h時兩組中該基因表達(dá)均上調(diào)，其中M1組2-△△Ct值達(dá)6.5±1.8，M2組為10.8±3.2，兩組間具有顯著性差異(P<0.05)，見圖4C。

2.6不同極化狀態(tài)下胞內(nèi)補(bǔ)體C3 mRNA的動態(tài)結(jié)果顯示：不同檢測時間點M2組均較M1組表達(dá)明顯增高，8 h時2-△△Ct值達(dá)8.0±1.2，12 h時達(dá)高峰(11.3±2.4)，24 h后下降(7.9±1.3)。M1組中該基因波動不明顯，僅在8～12 h間輕微上調(diào),見圖4D。

3討論

補(bǔ)體是生物體早期進(jìn)化的免疫成分之一，在海膽、文昌魚、七鰓鰻和盲鰻等無脊椎動物體內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)[5]。在補(bǔ)體系統(tǒng)中C1q是參與補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑的第一個成員，MBL是補(bǔ)體MBL途徑的成員代表，CfB因子是補(bǔ)體旁路途徑活化的首要成分之一，而C3是補(bǔ)體系統(tǒng)激活的樞紐成分。補(bǔ)體被激活后參與炎癥、組織器官發(fā)育、腫瘤等許多病理生理過程[6]。

巨噬細(xì)胞具有極大的可塑性，M1極化的細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗原提呈和殺微生物的特點及促炎作用，但過度M1極化會導(dǎo)致炎癥失控，造成組織損傷。而M2極化的細(xì)胞能促組織修復(fù)，抑制炎癥，維持局域組織穩(wěn)態(tài)，成為持續(xù)性感染的原因之一[7]。組織中定居的巨噬細(xì)胞合成分泌補(bǔ)體，是局域免疫的重要成分。本實驗用LPS(1 μg/ml)、IL-4(20 ng/ml)分別刺激小鼠ANA-1巨噬細(xì)胞建立極化模型，探討不同極化的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)補(bǔ)體組分mRNA的動態(tài)變化。結(jié)果顯示：刺激3 h后LPS組IL-1β、CCL2的表達(dá)較IL-4組有明顯增加，說明巨噬細(xì)胞向M1方向極化。而受IL-4刺激后細(xì)胞Arg-1基因高表達(dá)，提示其向M2方向極化。

在此極化模型基礎(chǔ)上，我們首先檢測PBS對照組中胞內(nèi)補(bǔ)體組分mRNA的動態(tài)，發(fā)現(xiàn)不同時間點補(bǔ)體表達(dá)變化不明顯(圖3)。通過對不同極化巨噬細(xì)胞的C1q、CfB、C3及CRIg mRNA的2-△△Ct值分析發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)補(bǔ)體成分在兩組中均有不同程度的上調(diào)：CfB在M1組中顯著上調(diào)，而C3、C1q及CRIg在M2組中顯著上調(diào)；此外，除CRIg外，各組C1q、CfB及C3的表達(dá)均表現(xiàn)相似的時間動態(tài)，在12 h出現(xiàn)高峰表達(dá)，24 h表達(dá)逐漸降低。

C1q是最早被發(fā)現(xiàn)的補(bǔ)體成分，巨噬細(xì)胞是其產(chǎn)生的主要來源[8]。近年來C1q作為一種模式識別受體(PRR)越來越受到關(guān)注，與C-反應(yīng)蛋白、低密度脂蛋白、PTX3以及多種PAMP/DAMP配體結(jié)合后參與補(bǔ)體激活、凋亡細(xì)胞清除等過程。研究顯示，C1q與受體(如C1qR、清道夫受體、甘露糖受體等)結(jié)合后，能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，導(dǎo)致IL-10、IL-27上調(diào)，抑制IL-1β的表達(dá)，參與局域組織修復(fù)及穩(wěn)態(tài)的功能[9]。C1q可抑制攝取oxLDL的Raw264.7巨噬細(xì)胞中NF-κB通路，使IL-1β、IL-6表達(dá)下降，而IL-10增加[10]。本研究數(shù)據(jù)提示IL-4刺激后向M2極化的小鼠ANA-1巨噬細(xì)胞株也出現(xiàn)C1q mRNA的顯著上調(diào)，提示該補(bǔ)體組分參與M2型巨噬細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。

CfB是啟動補(bǔ)體旁路途徑活化的關(guān)鍵過程[11]。本研究結(jié)果顯示M1巨噬細(xì)胞在刺激12 h后B因子的mRNA水平達(dá)高峰(2-△△Ct：61.4±6.2)，而在M2組中變化不明顯，提示CfB因子與M1型巨噬細(xì)胞功能有關(guān)聯(lián)。臨床資料顯示膿毒血癥患者體內(nèi)CfB的表達(dá)明顯增加，腹水和血清中Ba和C3片段顯著增加。在小鼠的敗血癥模型中發(fā)現(xiàn)敲除TLR4(LPS的受體)后CfB表達(dá)降低，表明CfB是LPS-TRL4信號通路的下游靶基因[12，13]。

CRIg是僅表達(dá)于組織中巨噬細(xì)胞的一類補(bǔ)體受體。與配體結(jié)合后，可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對病原體的識別和吞噬能力，參與病原體和凋亡細(xì)胞的清除[14]。本實驗結(jié)果顯示：在刺激24 h后兩組細(xì)胞內(nèi)CRIg mRNA才顯著上調(diào)，滯后于其他補(bǔ)體成分，若需觀察該成分的動態(tài)還需延長檢測時間。

C3是補(bǔ)體活化的樞紐成分，C3a與C3aR結(jié)合后激活ERK1/2信號通路，促進(jìn)胞內(nèi)ATP的釋放，誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化，IL-1β的成熟和釋放，參與清除循環(huán)免疫復(fù)合物、降低B細(xì)胞活化閾值、調(diào)理吞噬、調(diào)節(jié)Th細(xì)胞分化等多種效應(yīng)[15-17]。已有研究證實M1極化時巨噬細(xì)胞中C3aR1的表達(dá)上調(diào)而在M2細(xì)胞中下調(diào)，均提示C3參與不同極化細(xì)胞的功能[17]。本實驗結(jié)果顯示：M2極化組C3 mRNA表達(dá)較M1組明顯，但相對其他補(bǔ)體組分而言，C3在胞內(nèi)變化幅度較低，這可能與C3基因本身在細(xì)胞中表達(dá)的基值較高有關(guān)。

巨噬細(xì)胞向M1和M2極化不僅是一個動態(tài)可逆的過程[2]，研究顯示補(bǔ)體的不同成分對細(xì)胞的極化調(diào)控不同，如C1q、C3b有助于細(xì)胞向M2方向分化，而C3a、C5a及C5b-9驅(qū)動細(xì)胞向M1方向極化[9，18]。而本實驗探討在細(xì)胞極化后補(bǔ)體不同組分的mRNA動態(tài)，為說明補(bǔ)體與巨噬細(xì)胞功能變化的內(nèi)在關(guān)聯(lián)提供了一定的實驗依據(jù)。

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[收稿2015-12-15修回2016-03-18]

(編輯倪鵬)

Dynamic characteristics of intracellular complement components mRNA in different mouse macrophage ANA-1 polarization

YUAN Meng-Jiao，SHANG Zheng-Ling，MA Ya-Ping，WU Jia-Hong.

The Department of Immunology,Basic Medical School,Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China

[Abstract]Objective:To reveal the dynamic characteristics of the intracellular complement mRNA from mouse macrophage ANA-1 treated with LPS or IL-4.Methods: The polarization models of macrophage ANA-1 were established by treating with LPS(1 μg/ml) and IL-4(20 ng/ml),respectively.After treating at 3,8,12 and 24 h,the total RNA were abstracted by Trizol lysis methods .The macrophage polarization were estimated by the expression of IL-1β,CCL2 and Arg-1 mRNA detected by Real-time fluorescent quantitative PCR.The intracellular complement C1q,C3,CfB and CRIg mRNA were quantitatively analyzed.Results: The mouse macrophage ANA-1 cells treated with LPS was polarized to M1 since the levels of IL-1β and CCL2 mRNA were up-regulated significantly,in which their 2-△△Ctvalue were up to 297.0±31.0 and 19.9±3.3 respectively at 12 h.On the other hand,the ANA-1 cells treated with IL-4 was polarized to M2 because the level of Arg-1 mRNA was obviously higher(the 2-△△Ctvalue of Arg-1 mRNA was up to 27.3±9.1 at 24 h)(P<0.05).The intracellular complement C1q,C3,CfB and CRIg mRNAs all were up-regulated in different polarized macrophages.The intracellular C1q and C3 mRNA in polarized M2 were significantly higher,in which the peak value of C1q and C3 were to 94.9±12.9 and 11.3±2.4 at 12 h，respectively(P<0.05).Reversely,the CfB mRNA in polarized M1 increased obviously,in which its 2-△△Ctwas to 61.4±6.2 at 12 h.In addition,the CRIg mRNA in both groups was only up-regulated at 24 h,in which the 2-△△Ctvalue was 6.5±1.8 in M1 and 10.8±3.2 in M2(P<0.05).Conclusion: The macrophage ANA-1 cell polarization models were successfully established by treated with LPS or IL-4.The intracellular complement C1q,C3 and CRIg mRNA in polarized M2 were transcripted more than in M1.But the intracellular CfB mRNA in polarized M1 was up-regulated significantly.These results suggested that the dynamic characteristic of complement components in different polarized macrophage would be correlated with its funtions.

[Key words]ANA-1;Macrophage polarization;Complement component mRNA

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.003

作者簡介：袁夢嬌(1989年- ),女,醫(yī)學(xué)碩士,主要從事抗感染免疫方面的研究,E-mail:myyuanmengjiao@163.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：商正玲(1974年-),女,醫(yī)學(xué)博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事抗感染免疫方面的研究，E-mail:shangzhengling@126.com。

中圖分類號R392.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)06-0782-05

①本文受貴州省社會發(fā)展合作專項資金項目(黔科合[2010]3155)和貴州省科學(xué)技術(shù)基金(黔科合J字[2008]2156號)資助。

②貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實驗室，貴陽550025。