陳鵬輝楊濤1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院耳科學(xué)研究所3上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室

?

TBC1D24基因的致聾機制研究進展

陳鵬輝1，2，3楊濤1，2，3
1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科
2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院耳科學(xué)研究所
3上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室

【摘要】TBC1D24基因編碼含TBC結(jié)構(gòu)域和TLDc結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。該基因具有基因多效性，所涉及的基因型-表型關(guān)聯(lián)復(fù)雜，不同突變可分別導(dǎo)致重度-極重度先天性耳聾、遲發(fā)性/漸進性耳聾等不同聽力表型及在神經(jīng)、骨骼等系統(tǒng)的不同發(fā)育障礙。在內(nèi)耳中，TBC1D24表達(dá)于螺旋神經(jīng)節(jié)及毛細(xì)胞靜纖毛，具有特異的表達(dá)位置和表達(dá)時間。對該基因的功能學(xué)研究有助于人們了解聽覺及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及相關(guān)遺傳性疾病的分子發(fā)病機制。

【關(guān)鍵詞】TBC1D24；螺旋神經(jīng)節(jié)；靜纖毛；耳聾基因

TBC1D24基因編碼含TBC結(jié)構(gòu)域和TLDc結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。該基因具有基因多效性，所涉及的基因型-表型關(guān)聯(lián)復(fù)雜，不同突變可分別導(dǎo)致重度-極重度先天性耳聾、遲發(fā)性/漸進性耳聾等不同聽力表型及在神經(jīng)、骨骼等系統(tǒng)的不同發(fā)育障礙。在內(nèi)耳中，TBC1D24表達(dá)于螺旋神經(jīng)節(jié)及毛細(xì)胞靜纖毛，具有特異的表達(dá)位置和表達(dá)時間。對該基因的功能學(xué)研究有助于人們了解聽覺及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及相關(guān)遺傳性疾病的分子發(fā)病機制。

1　TBC1D24基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)

TBC1D24（MIM #613577）是TBC1結(jié)構(gòu)域基因家族的第24成員，位于染色體16p13.3位置。該基因包含8個外顯子，其中最長的mRNA編碼一個559氨基酸的多肽［1］，第47至262位和第368至554位氨基酸分別編碼TBC和TLDc兩個保守結(jié)構(gòu)域。

TBC（Tre2/Bub2/Cdc16）結(jié)構(gòu)域蛋白家族是一類Rab GTP酶激活蛋白（Rab-GAP），能夠催化特定Rab GTP酶（Rab-GTPase）的GTP水解為GDP［2］，進而調(diào)控與GTP和GAP緊密相關(guān)的Rab-GTPase的激活與失活狀態(tài)。Rab-GAPs通過調(diào)節(jié)Rab-GTPase活性參與調(diào)控了眾多質(zhì)膜轉(zhuǎn)運以及囊泡分選過程［3］。TBC1D24基因的第二外顯子編碼TBC結(jié)構(gòu)域，目前TBC1D24直接靶向作用的Rab-GTPase還未見報道，其蛋白晶體結(jié)構(gòu)仍未知。鑒于大部分TBC1D24基因的致聾病突變位點位于TBC結(jié)構(gòu)域，我們猜測該結(jié)構(gòu)域可能與TBC1D24蛋白在內(nèi)耳的聽覺功能直接有關(guān)。

表1　TBC1D24基因突變及其疾病臨床表型Table 1 TBC1D24 Mutations and Associated Phenotypes

TLDc結(jié)構(gòu)域蛋白與氧化應(yīng)激抵抗性相關(guān)，且有接觸反應(yīng)活性，但其作用底物尚不清楚［4］。人類存在其他四種含TLDc結(jié)構(gòu)域的蛋白，包括NCOA7和OXR1，這兩者均有保護細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)敲除了OXR1基因的小鼠可產(chǎn)生氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)變性［4］。TBC1D24是唯一一個含有TLDc結(jié)構(gòu)域的TBC/Rab-GAP家族成員。因此人們推測TBC1D24的另一個作用有可能為保護神經(jīng)元細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激。

1.1TBC1D24基因突變的臨床表型

TBC1D24在腦、耳蝸、睪丸、骨骼肌、心臟、腎臟、肺和肝臟等許多器官都有表達(dá)，具有基因多效性和復(fù)雜的突變基因型-表型關(guān)聯(lián)。該基因不同類型的突變可以分別導(dǎo)致癲癇、智力障礙、神經(jīng)細(xì)胞變性等神經(jīng)系統(tǒng)疾病、指（趾）甲發(fā)育不良、骨發(fā)育不良及感音神經(jīng)性耳聾。表1總結(jié)了目前國內(nèi)外研究中已報道的十幾種TBC1D24基因突變及其所導(dǎo)致的疾病臨床表型。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，既往研究分別在一個患有家族性嬰兒肌陣攣性癲癇?。∕IM #605021）的常染色體隱性遺傳家系中發(fā)現(xiàn)了兩個復(fù)合雜合的錯義突變（p.Asp147His and p.Ala509Val）［5］，在一個患有局灶性癲癇、構(gòu)音障礙和輕中度智力障礙綜合征（MIM #605021）的家系中發(fā)現(xiàn)了純合的p.Phe251Leu突變［6］，在一個患有家族性嬰兒惡性部分性遷移驚厥發(fā)作的家系中發(fā)現(xiàn)了復(fù)合雜合突變p.Cys156X和p.Phe229Ser［7］，在一個患有嚴(yán)重致死性癲癇性腦?。∕IM #615338）的家系中發(fā)現(xiàn)了純合的雙堿基缺失移碼突變p.Ser324Thrfs*3［1］。

新近研究發(fā)現(xiàn)TBC1D24基因突變也可以造成非綜合征性和綜合征性感音神經(jīng)性耳聾。Rehman等在三個非綜合征性隱性耳聾（DFNB86）的家系中分別發(fā)現(xiàn)了兩個不同的純合突變p.Asp70Tyr和p.Arg293Pro［8］。另外，一項針對DOORS綜合征（耳聾、指（趾）甲變形、骨營養(yǎng)不良、智力發(fā)育遲緩、驚厥綜合征）的多中心研究選取了來自17個國家的26個患病家系作為研究對象，發(fā)現(xiàn)了該綜合征與8個純合或復(fù)合雜合的隱性TBC1D24基因突變有關(guān)，相關(guān)突變包括c.724C＞T（Arg242Cys），c.118C＞T（Arg40Cys），c.1008delT（His336GlnfsTer12*），c.1206 + 5G＞A （Splicing），c.58C＞G（Gln20Glu），c.119G＞T（Arg40Leu），c.328G＞A（Gly110Ser），c.999G＞T（Leu333Phe）［9］。

既往報道的TBC1D24基因突變均為常染色體隱性遺傳模式。與之不同的是筆者研究團隊新近在一來自中國的顯性遺傳性的非綜合征性耳聾大家系中運用連鎖分析和外顯子測序的方法發(fā)現(xiàn)TBC1D24基因的雜合致病突變p.Ser178Leu（MIM#616044）［10］。有趣的是同一基因突變在同一時間也在另一來自歐美的非綜合征性耳聾顯性家系中被報道［11］，預(yù)示著p.Ser178Leu突變可能為一相對高發(fā)、與致聾作用有特殊聯(lián)系的基因功能性改變。和DFNB86及DOORS綜合征的先天性、重度-極重度耳聾不同，TBC1D24基因p.Ser178Leu突變所導(dǎo)致的顯性遺傳性耳聾起始發(fā)病年齡均在20歲之后，聽力隨年齡增大呈進行性下降且對高頻聽力影響更為明顯［15，16］。

1.2TBC1D24基因突變的致病機制

如上所述，TBC1D24基因突變可影響人體不同組織和器官，導(dǎo)致具有多樣性臨床表型的不同遺傳性疾病。這種復(fù)雜的基因性-表型關(guān)聯(lián)據(jù)推測應(yīng)與該基因的基因多效性有著密切聯(lián)系：TBC1D24蛋白在神經(jīng)、骨骼和內(nèi)耳等不同細(xì)胞環(huán)境下可能與各系統(tǒng)特異的配體或結(jié)合蛋白相作用，在不同的生物學(xué)通路中執(zhí)行不同的功能。不同類型的TBC1D24基因突變或使蛋白產(chǎn)物功能完全或部分缺失，或使特異的蛋白功能發(fā)生有害的改變，通過影響不同生物學(xué)通路以造成不同組織和系統(tǒng)的功能性障礙。

從突變對基因功能的損失類型劃分，遺傳性疾病基因突變的常見致病機制可分為功能喪失性突變（loss of function）和（有害）功能獲得性突變（gain of function）兩大類型。多數(shù)隱性遺傳突變，如TBC1D24基因所報道的一些截斷性突變p.C156X，p.Ser324Thrfs*3及p.His336Glnfs*12，可導(dǎo)致基因功能喪失［1，7，9］。這些TBC1D24基因截斷性突變的雜合子攜帶者均為正常臨床表型，預(yù)示著該基因顯性突變的分子致病機制可基本排除單倍體不足（haploinsufficiency）的可能性。由此推測，與顯性非綜合征性耳聾相關(guān)的TBC1D24基因p.Ser178Leu突變非常有可能為一功能獲得性基因突變。p.Ser178Leu突變位于TBC1D24基因的TBC結(jié)構(gòu)域，由一疏水性亮氨酸替代親水性的絲氨酸，而這一替換可能通過影響蛋白的折疊或構(gòu)造而使蛋白的功能發(fā)生有害性改變。以上同一基因不同突變分別導(dǎo)致隱性功能缺失性和顯性功能獲得性致病機制的例子在其他耳聾基因中是有先例的，如功能全部或部分缺失型GJB2基因突變可導(dǎo)致常見隱性遺傳性耳聾DFNB1A，而部分可導(dǎo)致顯性遺傳性耳聾DFNA3A和綜合征性耳聾的GJB2顯性突變已被功能學(xué)實驗證實可獲得新的有害性的蛋白功能改變［12，13］。和功能缺失型突變不同，功能獲得性突變在基因治療時無法使用野生型基因置換（gene replacement）的策略，相反一些可以選擇性抑制突變等位基因的基因治療策略，如RNA干擾技術(shù)則更具治療潛力。由此可見，進一步深入研究野生型TBC1D24基因在不同組織和細(xì)胞中的具體功能以及不同TBC1D24基因突變的特異性分子致病機制將對把握和理解TBC1D24基因突變的復(fù)雜的基因型-表型關(guān)系、開發(fā)有針對性的基因治療手段具有重大科學(xué)意義［17，18］。

1.3TBC1D24基因在神經(jīng)發(fā)育方面的功能學(xué)研究

由于TBC1D24基因突變所導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)現(xiàn)在前，目前階段對于該基因及突變的功能學(xué)研究主要集中于其在神經(jīng)發(fā)育方面的影響。Falace等在COS7細(xì)胞系中外源表達(dá)TBC1D24及ARF6，利用熒光標(biāo)記共定位及免疫共沉淀實驗證明TBC1D24與ARF6存在直接相互作用［5］。ARF6是一類調(diào)控細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運、肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)重建、細(xì)胞質(zhì)膜胞吐胞吞作用的小GTP酶ADP核糖基化因子，其在神經(jīng)元的主要功能包括抑制樹突的分支和軸突的伸長。TBC1D24基因在這方面的功能則與ARF6正好相反：在原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞中過表達(dá)野生型TBC1D24可顯著地增加神經(jīng)元突起的長度和分支數(shù)量，而過表達(dá)p.D147H和p.A509V突變型TBC1D24則無此影響［5］。類似結(jié)果在原代培養(yǎng)的小鼠海馬神經(jīng)元中也有報道［6］。以上結(jié)果提示TBC1D24可能通過與ARF6的結(jié)合而對后者對神經(jīng)發(fā)育的調(diào)控起拮抗作用。這一猜測在隨后的在體研究中得到進一步證實：通過對胚胎期大鼠TBC1D24基因的RNA干擾沉默，F(xiàn)alace等發(fā)現(xiàn)實驗動物大腦皮層發(fā)育過程中神經(jīng)元從多極向雙極的轉(zhuǎn)變過程受到影響，放射狀遷移被延遲，且其形態(tài)和功能保留了一些發(fā)育不成熟階段的特征，包括樹突分支和興奮性突觸形成方面的減弱；而過表達(dá)帶有顯性負(fù)效應(yīng)（dominant negative）突變的ARF6基因可以扭轉(zhuǎn)TBC1D24沉默所導(dǎo)致的大腦皮層神經(jīng)元遷移和成熟過程中的缺陷［14］。這些結(jié)果說明TBC1D24通過調(diào)控ARF6依賴的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運通路在神經(jīng)元的遷移和成熟中起到了重要作用，其作用機理可解釋部分TBC1D24基因突變所導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的分子發(fā)病機制［14］。

1.4TBC1D24基因在聽覺系統(tǒng)中的表達(dá)及功能預(yù)測

2014年以來的數(shù)篇論文連續(xù)報道了TBC1D24基因突變所導(dǎo)致的顯性、隱性非綜合征性耳聾及綜合征性耳聾，提示該基因在聽覺系統(tǒng)中具有重要作用［8-11］。有關(guān)TBC1D24基因在聽覺系統(tǒng)的作用及致聾機制研究目前尚處在初步階段，已發(fā)表的研究成果多在于確定該基因在內(nèi)耳的具體表達(dá)位置和細(xì)胞類型。鑒于聽覺系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和內(nèi)耳不同類型細(xì)胞所執(zhí)行功能的特異性，有關(guān)TBC1D24基因在內(nèi)耳表達(dá)方面的信息對推斷該基因在聽覺系統(tǒng)的功能及可能存在的發(fā)病機制具有非常重要的價值。在這方面，Rehman等通過成年小鼠耳蝸冰凍切片的免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)TBC1D24蛋白表達(dá)在出生后第30天小鼠的內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)，并在螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的細(xì)胞體和軸突均有分布［8］。根據(jù)此結(jié)果作者推測TBC1D24基因突變所導(dǎo)致的DFNB86耳聾有可能是一種聽神經(jīng)病譜系障礙（auditory neuropathy spectrum disorder，ANSD）。聽神經(jīng)病譜系障礙是一種外毛細(xì)胞功能正常，而聽神經(jīng)、內(nèi)毛細(xì)胞或內(nèi)毛細(xì)胞神經(jīng)突觸等聽覺傳入通路的損害而導(dǎo)致的聽功能障礙性疾病，其發(fā)病之初的臨床聽力學(xué)特點可表現(xiàn)為耳聲發(fā)射（OAE）正常而聽覺腦干反應(yīng)（ABR）波形或波峰間距異常，隨后由于缺乏傳入刺激，殘留的毛細(xì)胞和柯替氏器最終會發(fā)生繼發(fā)性消亡。然而在其他三篇關(guān)于TBC1D24基因突變致聾的論文中研究者均未能提供病人發(fā)病之初的OAE資料以證實聽神經(jīng)病譜系障礙的假設(shè)，本研究團隊所報道的一個具有TBC1D24基因顯性突變的遲發(fā)性、漸行性耳聾家系中部分病人耳聲發(fā)射結(jié)果異常，但這些病人接受聽力學(xué)檢測時年齡偏大，已過發(fā)病年齡多年，尚不能完全排除聽神經(jīng)病譜系障礙的可能性。這一問題最終可借助TBC1D24基因敲除或敲入小鼠模型來得到回答。

和Rehman等對成年鼠的表達(dá)研究不同，本研究團隊同時對新生及成年鼠進行了TBC1D24基因的內(nèi)耳表達(dá)研究。通過不同時期小鼠耳蝸的全組織包埋及冰凍切片免疫熒光實驗，我們發(fā)現(xiàn)TBC1D24基因除了在螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元有持續(xù)性表達(dá)以外，還在新生期表達(dá)于內(nèi)、外毛細(xì)胞的靜纖毛［10］。該基因在靜纖毛上的表達(dá)只在小鼠新生期到出生后第3天左右較為明顯，在出生后第7天及之后即消失，同時具有時間及空間上的特異性。以上TBC1D24基因內(nèi)耳表達(dá)特征在Azaiez等的研究中也得到證實［11］，預(yù)示著該基因可能對毛細(xì)胞靜纖毛的發(fā)育和成熟具有重要作用：在小鼠內(nèi)耳發(fā)育期間，毛細(xì)胞靜纖毛之間在不同時期存在著很多暫時性的側(cè)壁連接結(jié)構(gòu)，如在胚胎17.5天到出生后第2天期間存在的臨時性側(cè)壁連接，在出生后第2到9天期間暫時存在的“踝連接”等。TBC1D24基因產(chǎn)物是否與這些暫時性側(cè)壁連接有關(guān)是一個非常值得關(guān)注的未來研究方向。

參考文獻(xiàn)

1Guven A，Tolun A.TBC1D24 truncating mutation resulting in severe neurodegeneration.Journal of Medical Genetics.2013，50（3）:199-202.

2Choi S，Ko J，Lee J R，et al.ARF6 and EFA6A regulate the development and maintenance of dendritic spines.Journal of Neuroscience.2006，26（18）:4811-4819.

3Hernandez-Deviez D J，Casanova J E，Wilson J M.Regulation of dendritic development by the ARF exchange factor ARNO.Nature Neuroscience.2002，5（7）:623-624.

4Oliver P L，F(xiàn)inelli M J，Edwards B，et al.Oxr1 is essential for protection against oxidative stress-induced neurodegeneration.Plos Genetics.2011，7（10）:e1002338.

5Falace A，F(xiàn)ilipello F，La Padula V，et al.TBC1D24，an ARF6-Interacting Protein，Is Mutated in Familial Infantile Myoclonic Epilepsy.American Journal of Human Genetics.2010，87（3）:365-370.

6Corbett M A，Bahlo M，Jolly L，et al.A focal epilepsy and intellectual disability syndrome is due to a mutation in TBC1D24.American Journal of Human Genetics.2010，87（3）:371-375.

7Milh M，F(xiàn)alace A，Villeneuve N，et al.Novel compound heterozygous mutations in TBC1D24 cause familial malignant migrating partial seizures of infancy.Human Mutation.2013，34（6）:869-872.

8 Rehman A U，Santos-Cortez R L P，Morell R J，et al.Mutations in TBC1D24，a Gene Associated With Epilepsy，Also Cause Nonsyndromic Deafness DFNB86.American Journal of Human Genetics.2014，94:144-152.

9Campeau P M，Kasperaviciute D，Lu J T，et al.The genetic basis of DOORS syndrome:an exome-sequencing study.Lancet Neurology.2014，13（1）:44-58.

10 Zhang L，Hu L，Chai Y，et al.A dominant mutation in the stereocilia-expressing gene TBC1D24 is a probable cause for nonsyndromic hearing impairment.Human Mutation.2014，35（7）:814-818.

11 Azaiez H，Booth K T，Bu F，et al.TBC1D24 mutation causes autosomal-dominant nonsyndromic hearing loss.Human Mutation.2014，35（7）:819-823.

12 Mese G，Sellitto C，Li L，et al.The Cx26-G45E mutation displays increased hemichannel activity in a mouse model of the lethal form of keratitis-ichthyosis-deafness syndrome.Molecular Biology of the Cell.2011，22（24）:4776-4786.

13 Mhaske P V，Levit N A，Li L，et al.The human Cx26-D50A and Cx26-A88V mutations causing keratitis-ichthyosis-deafness syndrome display increased hemichannel activity.American Journal of Physiology-cell Physiology.2013，304（12）:C1150-C1158.

14 Falace A，Buhler E，F(xiàn)adda M，et al.TBC1D24 regulates neuronal migration and maturation through modulation of the ARF6-dependent pathway.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2014，111（6）:2337-2342.

15劉金枝，程洪波，楊念，等.一常染色體顯性遺傳性耳聾家系基因的突變篩查及分析.中華耳科學(xué)雜志，2013，11（4）:571-574.LIU Jinzhi，Cheng Hongbo，YANG Nian，et al.Clinical and Genetic Characteristics of A Large Pedigree with Autosomal Dominant In hereditary Non-Syndromic Hearing Impairment［J］.Chinese journal of otology.2013，11（4）:571-571

16朱俊真，曹琴英，葛軍，等.耳聾患者相關(guān)常見致病基因的分子診斷.中華耳科學(xué)雜志，2013，11（4）:575-577.Zhu Junzhen，Cao Qinying，Ge Jun，et al.Molecular Diagnosis of Deafness Patients in Related Pathogenic Gene［J］.Chinese journal of otology，2013，11（4）:575-575.

17王燕飛，程靜，盧宇，等.常染色體顯性遺傳耳聾家系聽力學(xué)及遺傳學(xué)特征分析，2014，12（2）:280-282.Wang Yanfei，Cheng Jing，Lu Yu，et al.Audiological and Genetic Characteristics of A Family with Autosomal Dominant Hereditary Hearing Impairment［J］.Chinese journal of otology，2014，12（2）:280-280

18姜海鷗，全慶麗，胡祥上，等.全外顯子組測序技術(shù)及其在遺傳性耳聾中研究中的應(yīng)用，2015，13（1）:179-182.Jiang Haiou，Quan Qingli，Hu Xiangshang，et al.Whole Exome Sequencing and Its Application in Genetic Hearing Loss Research［J］.Chinese journal of otology，2015，13（1）:179-179.

Research Progress on PathogenicMechanisms of Deafness Caused by TBC1D24 gene

CHEN Penghui，1，2，3YANG Tao1，2，3
1 Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，Xinhua Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai，China，
2 Ear Institute，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai，China，
3 Shanghai Key Laboratory of Translational Medicine on Ear and Nose diseases，Shanghai，China，200092
Corresponding author:YANG TaoEmail:yangtfxl@sina.com

【Abstract】TBC1D24 gene encodes a protein containing TBC domain and TLDc domain.The pleiotropic gene has a complex genotype-phenotype correlation.Different mutations result in severe-profound congenital deafness or delayed/progressive deafness and developmental disorders of nerve and/or skeletal systems.In the inner ear，TBC1D24 is expressed in the spiral ganglion and the hair cell cilia，which has the specific special and temporal expression pattern.The functional study of this gene will help us to understand the development of auditory and neural system and molecular pathogenesis of related diseases.

【Key words】TBC1D24，spiral ganglion，hair cell cilia，deafness gene

【中圖分類號】R764

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1672-2922（2016）02-299-5

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.02.035

作者簡介：陳鵬輝，在讀碩士，研究方向：聾病分子生物學(xué)

通訊作者：楊濤，Email：yangtfxl@sina.com

收稿日期：（2015-10-09審核人：郭維維）