巴合提江·托克吉各特　阿依恒·曲庫爾汗新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科（新疆830054）

?

MicroRNA在中耳膽脂瘤發(fā)病機制研究進展

巴合提江·托克吉各特阿依恒·曲庫爾汗
新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科（新疆830054）

【摘要】微小RNA（MicroRNA）是生物體內(nèi)小分子RNA，參與細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、能量代謝、生長發(fā)育、增殖等多生物學(xué)功能，是人體內(nèi)細胞基因調(diào)控中的重要調(diào)節(jié)分子。近年來大量膽脂瘤發(fā)生、發(fā)展中的分子生物學(xué)研究取得了新進展，其中miRNA在膽脂瘤的研究中開辟了新的研究領(lǐng)域。近來大量報道認為miR-21可能與膽脂瘤的發(fā)病機制有關(guān)，并且在膽脂瘤生長調(diào)節(jié)和擴散中具有潛在作用。本文針對miR-21在細胞信號通路間及相互作用對于中耳膽脂瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機制進行了綜述。

【關(guān)鍵詞】中耳膽脂瘤微小RNAs發(fā)病機制

Project supported by the natural science foundation of the Xinjiang Uygur Autonomous Region（201321 1A098）.

The authors claim that there is no conflict of interest.

1　中耳膽脂瘤（cholesteatoma of middle ear）

中耳膽脂瘤是一種上皮的良性病變，通常病程較長且易破壞中耳骨性結(jié)構(gòu)，有時也累及至內(nèi)耳。角質(zhì)化的鱗狀上皮細胞在中耳及乳突內(nèi)增生引起相應(yīng)病變［1］。常見的癥狀包括耳痛、有惡臭的耳漏、聽力損失等，而潛在的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥是致命性的（例如腦膿腫、腦膜炎）。膽脂瘤的形成多因為內(nèi)部分子生物學(xué)失調(diào)和外部刺激相互作用，這其中存在一種學(xué)說認為上皮細胞增殖、角質(zhì)細胞形成、分化、成熟、細胞凋亡和自凈機制之間的不平衡以及由此引起的惡性循環(huán)，導(dǎo)致破骨細胞、細胞外骨基質(zhì)細胞的增殖、退化，破骨細胞的激活造成骨質(zhì)破壞，導(dǎo)致疾病的進一步發(fā)展［2］。盡管已經(jīng)進行了大量中耳膽脂瘤相關(guān)的生物學(xué)研究，但是仍有許多問題尚未解決。該病的分子生物學(xué)研究方法是揭示膽脂瘤發(fā)生、發(fā)展過程的重要手段。

2　MicroRNAs分子

MicroRNA（miRNA）廣泛存在于多種生物的基因組中，在基因表達轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)揮著強大的生物作用。細胞信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)外界刺激進而引發(fā)一系列生理和病理效應(yīng)，決定著細胞的功能和生物學(xué)行為。MicroRNAs是非編碼小RNA分子（包含22 - 24核苷酸），miRNAs通過與其目標mRNA分子3'端非編碼區(qū)域互補匹配造成該mRNA分子的翻譯受到抑制，從而控制靶基因表達，使其在細胞增殖、分化、抗凋亡等多種生物學(xué)進程中起到重要作用［3］。雖然MicroRNAs早在1989年發(fā)現(xiàn)，但直到2000年左右才被確認為對其互補的MRNA表達水平具有的生物調(diào)節(jié)和保存功能［4］。人類基因組內(nèi)已鑒定1000余個miRNA，而這些miRNA調(diào)控約30％的蛋白質(zhì)編碼基因［25，26］，同時對靶mRNA降解或翻譯抑制等過程起作用。盡管自身不能表達成相關(guān)蛋白，但與相應(yīng)的mRNA結(jié)合參與蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控［5］。

3　與miRNAs分子相互作用的信號通路

3.1miR-21分子

在各類miRNA中，miR-21位于17號染色體，是最早被認為與膽脂瘤發(fā)病機制有關(guān)的miRNA。MiR-21已被證實在多種人類腫瘤和癌癥細胞系中異常表達，這些腫瘤或癌包括膠質(zhì)母細胞瘤、頭頸部癌、卵巢癌、B細胞淋巴瘤、肝細胞癌、宮頸癌和肺癌等［6］。目前，張力蛋白同族體（PTEN）、程序化細胞死亡4（PDCD4）、BTG2等是miR-21的目標基因已被確定，在腫瘤發(fā)病中有著重要的作用［7］。miRNA通過抑制目標基因的表達來顯示其生物學(xué)作用，因此，miR-21對目標基因的作用是在腫瘤生長中表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。2009年，F(xiàn)riedland［8］等人第一次報道了miRNAs在成人膽脂瘤生長調(diào)節(jié)和擴散中具有潛在作用，發(fā)現(xiàn)與正常的外耳道皮膚相比膽脂瘤中的miR-21水平增加，但磷酸酶及PTEN和PDCD4的水平降低。

3.1.1MiR-21分子與PTEN和PDCD4

PTEN和PDCD4的作用被認為是通過細胞凋亡、增殖、入侵和遷移等途徑有效抑制腫瘤。Friedland［8］等人推測miR-21的負轉(zhuǎn)錄調(diào)控，可能導(dǎo)致PTEN和PDCD4的抑制，從而引起角化細胞增殖、遷移、增長。隨后的一些研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因在膽脂瘤組織和正常皮膚組織上表達具有差異性，這種差異在膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展中進一步被證明可能有不可缺少的作用。Liu D，Ma X［9］等人利用免疫組化方法對40例膽脂瘤標本和15例正常皮膚組織進行了PTEN基因水平及基因位點的檢測，并用蛋白質(zhì)印跡方法對20例膽脂瘤組織和10例正常皮膚組織進行了其蛋白表達水平的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膽脂瘤組織中PTEN水平遠低于正常皮膚組織（P＜0.01），而蛋白質(zhì)印跡方法比較膽脂瘤和正常皮膚組織中該基因表達水平，也顯示膽脂瘤中PTEN表達遠低于正常皮膚組織，驗證了PTEN基因的異常表達，可能與膽脂瘤的抗凋亡和增殖密切相關(guān)。同樣Yune TY［10］等人通過免疫組化及蛋白印跡法對膽脂瘤上皮和正常皮膚組織PTEN表達水平進行了比較，發(fā)現(xiàn)膽脂瘤中PTEN的表達明顯低于正常皮膚（P＜0.05），而且膽脂瘤上皮細胞核中觀察到PTEN的弱免疫反應(yīng)性，但在正常皮膚細胞核中檢測到了PTEN的強免疫反應(yīng)性。Chen［11］等人在另一個miRNAs膽脂瘤的發(fā)病機制研究中發(fā)現(xiàn)，與正常的皮膚相比，在膽脂瘤組織中miR-21水平越高，PTEN和PDCD4蛋白水平越低，尤其在兒童患者中更明顯，且角化細胞增殖水平兒童患者更高。進一步比較了膽脂瘤和正常組織細胞的miRNA-let-7基因水平及其靶蛋白AT-hook 2（HMGA2）的表達水平（HMGA2是一種公認的致癌基因），通過與正常外耳道皮膚組織比較后發(fā)現(xiàn)膽脂瘤上皮中miRNA-let-7a的過表達引起HMGA2的下調(diào)，由此認為miRNA-let-7a可能抑制HMGA2的表達，從而影響膽脂瘤細胞增殖和角化細胞凋亡。細胞因子誘導(dǎo)的miR-21表達通過信號通路影響細胞的存活，miR-21刺激效應(yīng)細胞增殖作用和miRNA-let-7a對效應(yīng)細胞抗增殖效果的動態(tài)平衡可能對膽脂瘤侵犯性與膽脂瘤非腫瘤性生物學(xué)行為有關(guān)。

3.1.2miR-21分子與信號傳導(dǎo)之和轉(zhuǎn)錄激活自-3 （STAT3）

STAT3最初認為是急性反應(yīng)基因表達的調(diào)控因子。眾多實驗證據(jù)顯示STAT3參與多種腫瘤形成和發(fā)展。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族通過κB片段結(jié)合到靶基因序列來調(diào)控基因表達。研究表明STAT3及NF-κB信號通路在miR-21表達中起一定的作用。細菌脂多糖（LPS）識別Toll樣受體并將LPS的刺激信號向細胞內(nèi)傳遞，并上調(diào)miR-21表達。Toll樣受體在上調(diào)miR-21表達中的作用間接表明了這種受體與miRNA相互作用，同時是膽脂瘤組織中miRNA發(fā)揮功能的一個必要的途徑［12］。Hirai［13］等人通過免疫組化法對膽脂瘤組織和正常皮膚組織Toll樣受體2，4表達進行分析，發(fā)現(xiàn)與對照組相比膽脂瘤組織中Toll樣受體2和4顯著上調(diào)，這些結(jié)果表明，Toll樣受體可能在人慢性中耳炎和膽脂瘤中起主要作用。Toll樣受體與miRNA的相互作用也是一種膽脂瘤致病過程中的重要環(huán)節(jié)。另外，STAT3在干擾素（IFN）誘導(dǎo)的miR-21表達中也起重要的作用，STAT3在miR-21啟動子結(jié)合位點的染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)（芯片）分析顯示IFN誘導(dǎo)STAT3結(jié)合到最遠端的結(jié)合位點，這與IL-6誘導(dǎo)STAT3結(jié)合的結(jié)合位點相同。綜上所述，IFN誘導(dǎo)的miR-21表達依賴于STAT3，表明STAT3是在miR-21表達中是不可缺少的因子［16］，而且一些免疫組織化學(xué)研究報告顯示IFN等受體異常表達在膽脂瘤的生長中具有促進作用［17］。IFN激活其受體并引發(fā)STAT3及NFκB介導(dǎo)的miR-21表達增加并引起在靶細胞中的增殖、擴散等效應(yīng)。

3.1.3MiR-21分子與IL-6炎癥因子

IL-6炎癥因子與miR -21在膽脂瘤上皮的表達過程中起到相互影響的生物學(xué)作用。IL-6炎癥因子、細菌脂多糖（LPS）識別Toll樣受體并將LPS的刺激信號向細胞內(nèi)傳遞，這兩種途徑刺激STAT3及NF-κB信號通路，最終影響miR- 21的表達。Liu［14］等人利用免疫組織化學(xué)法對25例膽脂瘤病人膽脂瘤標本和15例正常外耳道皮膚標本進行IL-6，STAT3表達水平檢測，發(fā)現(xiàn)與對照組比較膽脂瘤上皮細胞中顯著表達（P＜0.05）。由此推斷，這種高表達水平在膽脂瘤組織快速增長中起到一定作用。Kuczkowski［15］等人對膽脂瘤組織IL-6蛋白的免疫印跡分析（Western blot analysis）顯示與正常皮膚組織比較，膽脂瘤組織中IL-6蛋白高表達，尤其在伴有骨質(zhì)破壞的標本中更顯著。

3.1.4MiR-21分子與NF-κB

NF-κB作為miRNA表達中的重要因子，在一些研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在病變組織與正常組織間的差異性表達。核周區(qū)域聚集的NF-κB蛋白提示抑制凋亡的機制失活，角化細胞死亡，角蛋白堆積［27］。例如，對中耳手術(shù)中獲得的10例膽脂瘤和6例正常外部道的皮膚組織，通過電泳活性變化分析（EMSA）及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT - PCR）方法分析了兩種組織中NF--κB DNA結(jié)合活性和IL - 6mRNA表達水平及兩者的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，膽脂瘤組織中的NF-κB DNA結(jié)合活性（15.9 +/- 8.2）％）高于正常皮膚組織（1.36 +/- 0.94）％，t = 3.502，P＜0.05），并且IL-6mRNA的表達水平也遠高于正常皮膚組織（t = 2.166，P＜0.05），而且兩者之間存在有顯著的正相關(guān)（r = 0.752，P＜0.05）［18］。

3.1.5miR-21分子與其他因子

miR-21的表達還受細胞內(nèi)另外一些重要物質(zhì)的影響，如IGFBP3和F-box蛋白家族等。miR-21KD系多形性成膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）和對照組RNA標本腫瘤相關(guān)性基因的表達分析顯示一些miR-21KD系膠質(zhì)母細胞瘤細胞中IGFBP3表達上調(diào)，表明它可能是miR-21靶基因［19］。FBXO11屬于F-BOX蛋白家族，是一種腫瘤抑制基因。miR-21作用于不同腫瘤細胞，伴隨FBOX11表達水平的升高，而下降［20］。IGFBP3和F-BOX被確定為新的MiR-21的靶基因，而且發(fā)現(xiàn)在腫瘤活檢標本的相關(guān)實驗室檢測顯示，F(xiàn)-BOX和IGFBP3表達與miR-21的表達呈負相關(guān)。表明miR-21通過抑制腫瘤抑制基因的表達而促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展［21］。IGFBP3和FBX011與對應(yīng)的IGF-IR及BCL6等受miR-21影響，而miR-21作為膽脂瘤發(fā)生、發(fā)展分子生物學(xué)機制中的重要環(huán)節(jié)之一，通過上述各種調(diào)控，從而影響到一系列生命活動的發(fā)生（下圖）。

3.2miR-802

除了miR-21與膽脂瘤發(fā)生有關(guān)外，目前研究發(fā)現(xiàn)，miR-802分子也與膽脂瘤的發(fā)生有關(guān)。在染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)顯示：與臨近正常皮膚組織相比，膽脂瘤組織中NF-κB是顯著激活的。在分子水平上，NFκB的激活引起miR-802表達水平的增加，而miR-802直接影響PTEN 30-UTR。miR - 802過表達促進角化細胞增殖和細胞周期的變化，并直接抑制PTEN的表達。因此這種信號通路在膽脂瘤發(fā)病過程中也起到一定的作用［22］，但目前研究比較少。

4　展望

最新的膽脂瘤分子生物學(xué)研究擴展了對膽脂瘤發(fā)病機制的認識?；虮磉_的研究已經(jīng)顯示出許多生長調(diào)控因子和信號分子以及相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達在膽脂瘤組織細胞生長，增殖，抗凋亡和骨質(zhì)破壞等方面的相互作用。miRNA通過結(jié)合靶mRNA的互補序列，調(diào)控經(jīng)典蛋白表達，參與細胞基本的生物過程，如細胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等。其中miR-21在膽脂瘤組織細胞中的作用是通過一些重要因子的參與來表達，miR-21不僅在膽脂瘤組織中起作用。而且在其他腫瘤致病過程中也有著不可忽視的生物學(xué)作用，比如Armstrong DA［23］等，對膀胱癌組織標本進行miRNA檢測，顯示miR-21存在過度表達。而Zhang C［24］等人研究發(fā)現(xiàn)miR-21在乳腺癌組織中也存在過度表達情況，并且和癌基因一樣抑制STAT3，對乳腺癌的進一步增殖可能起到了作用。miRNA調(diào)控在細胞生物信息中有著不可替代的重要作用，同時開辟了一個嶄新的領(lǐng)域研究膽脂瘤的發(fā)病機制。盡管miRNA的發(fā)現(xiàn)在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用有大量的研究基礎(chǔ)支持，但對于其在細胞生理和病理生理過程中作用的認識僅僅是一個新的起點，今后仍需要進行大量深入的研究。miRNA將會成為膽脂瘤發(fā)病機制中分子生物學(xué)研究的重點，同時對疾病的認識、疾病的診療、預(yù)防等方面均有重要的作用。

參考文獻

1Louw L，Acquired cholesteatoma pathogenesis:stepwise explanations，J Laryngol Otol.2010，124（6）:587-593.

2Juhn SK，Jung MK，Hoffman MD，Drew BR，Preciado DA，Sausen NJ，Jung TT，Kim BH，Park SY，Lin J，Ondrey FG，Mains DR，Huang T，The role of inflammatory mediators in the pathogenesis of otitis media and sequelae，Clin Exp Otorhino-laryngol.2008，1（3）:117-138.

3Rudnicki A，Avraham KB.microRNAs:the art of silencing in the ear.EMBO Mol Med .2012，4（9）:849-859.

4Lagos-Quintana M，Rauhut R，Lendeckel W，Tuschl T.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs.Science.2001，294:（5543）853-858.

5Ivey KN，Srivastava D.microRNAs as Developmental Regulators.Cold Spring Harb Perspect Biol.2015，7（7）:144-145.

6Hatley ME，Patrick DM，Garcia MR，Richardson JA，Bassel-Duby R，van Rooij E，Olson EN.Modulation of K-Ras-dependent lung tumorigenesis by MicroRNA-21.Cancer Cell.2010，18（3）:282-293.

7Buscaglia LE，Li Y.Apoptosis and the target genes of microRNA-21.Chin J Cancer .2011，30（6）:371-380.

8Friedland DR，Eernisse R，Erbe C，Gupta N，Cioffi JA.Cholesteatomagrowth and proliferation:posttranscriptional regulation by microRNA-21.Otol Neurotol .2009，30（7）:998-1005.

9Liu D，Ma X.［Expression and significance of PTEN，P-ERK and P-AKT in the middle ear cholesteatoma］.Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi.2014，28（4）:238-245

10 Yune TY，Byun JY.Expression of PTEN and phosphorylated Akt in human cholesteatoma epithelium.Acta Otolaryngol.2009，129（5）:501-506

11 Chen X，Qin Z.Post-transcriptional regulation by microrna-21 and let-7amicroRNA in paediatric cholesteatoma.J Int Med Res.2011，39（6）:2110-2118.

12 Sheedy FJ，Palsson-McDermott E，Hennessy EJ，Martin C，O'Leary JJ，Ruan Q，Johnson DS，Chen Y，O'Neill LA.Negative regulation of TLR4 via targeting of the proinflammatory tumor suppressor PDCD4 by the microRNA miR-21.Nat Immunol.2010，11（2）:141-147.

13 Hirai H，Kariya S，Okano M，F(xiàn)ukushima K，Kataoka Y，Maeda Y，Nishizaki K.Expression of toll-like receptors in chronic otitis media and cholesteatoma.Int J Pediatr Otorhinolaryngol.2013，77（5）:674-676

14 Liu W，Xie S，Chen X，Rao X，Ren H，Hu B，Yin T，Xiang Y，Ren J.Activation of the IL-6/JAK/STAT3 signaling pathway in human middle ear cholesteatoma epithelium.Int J Clin Exp Pathol.2014，7（2）:709-715.

15 Kuczkowski J，Sakowicz-Burkiewicz M，Iμycka-μwieszewska E，Mikaszewski B，Pawe?czyk T.Expression of tumor necrosis factor-α，interleukin-1α，interleukin-6and interleukin-10 in chronic otitis media with bone osteolysis.ORL J Otorhinolaryngol Relat .2011，73 （2）:93-99

16 Yang CH，Yue J，Pfeffer SR，Handorf CR，Pfeffer LM.MicroRNA miR-21 regulates the metastatic behavior of B16 melanoma cells.J Biol Chem.2011，286（45）:39172-39178

17 Olszewska E，Wagner M，Bernal-Sprekelsen M，Ebmeyer J，Dazert S，Hildmann H，Sudhoff H，Etiopathogenesis of cholesteatoma，Eur Arch Otorhinolaryngol.2004，261（1）:6-24.

18 Xu Y，Tao ZZ，Hua QQ，Wang XC，Xiao BK，Chen SM.［Activation of nuclear factor-kappaB and aberrant gene expression of interleukin 6 in middle ear cholesteatoma］.Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi.2009，44（3）:192-196.

19 Yang CH，Yue J，Pfeffer SR，F(xiàn)an M，Paulus E，Hosni-Ahmed A，Sims M，Qayyum S，Davidoff AM，Handorf CR，Pfeffer LM.MicroRNA-21 promotes glioblastoma tumorigenesis by down-regulating insulin-like growth factor-binding protein-3（IGFBP3）.J Biol Chem.2014，289（36）:25079-25087.

20 Yang CH，Pfeffer SR，Sims M，Yue J，Wang Y，Linga VG，Paulus E，Davidoff AM，Pfeffer LM.The oncogenic microRNA-21 inhibits the tumor suppressive activity of FBXO11 to promote tumorigenesis.J Biol Chem.2015，290（10）:6037-6046.

21 Pfeffer SR，Yang CH，Pfeffer LM.The Role of miR-21 in Cancer.Drug Dev Res.2015，76（6）:270-277.

22 Li N，Qin ZB.Inflammation-induced miR-802 promotes cell proliferation in cholesteatoma.Biotechnol Lett.2014，36（9）:1753-1759.

23 Armstrong DA，Green BB，Seigne JD，Schned AR，Marsit CJ.MicroRNA molecular profiling from matched tumor and bio-fluids in bladder cancer.Mol Cancer.2015，14（1）:194-195.

24 Zhang C，Liu K，Li T，F(xiàn)ang J，Ding Y，Sun L，Tu T，Jiang X，Du S，Hu J，Zhu W，Chen H，Sun X.miR-21:A gene of dual regulation in breast cancer.Int J Oncol，2016.48（1）:161-172

25 Griffiths-Jones S.miRBase：microRNA sequences and annotation .Curr Protoc Bioinformatics.2010，12（12）:9-10.

26 Griffiths-Jones S，Grocock R J，van Dongen S，Bateman A，Enright A J.miRBase：microRNA sequences，targets and gene nomenclature.Nucleic Acids Res.2006，34（1）:140-144.

27廖軍，林昶.中耳膽脂瘤的可能發(fā)病機制［J］.中華耳科學(xué)志，2015，13 （2）:362-365.Liao Jun Lin Chang.The possibility of middle ear cholesteatoma pathogenesis［J］.Chinese Journal of Otology 2015，13（2）:362-365.

Research progress of MicroRNAin the pathogenesis of cholesteatoma

Baheti jiang.tuokejigeteAyheng qukuerhan
Department of otolaryngology，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，xin jiang 830054
Corresponding author:Ayheng qukuerhanEmail:ayhen979@sina.com

【Abstract】MicroRNA which has variety of biological functions in cells is a small RNA molecule in the organism，participates in transcriptional regulation，energy metabolism，growth，reproduction and so on.MicroRNAs are important molecules in cell gene regulation in body，and exercise a variety of biological function.In recent years，a large number of molecular biology researches in pathogenesis of cholesteatoma of middle ear，have made a new progress of which miRNAs study and opened a new field.MiR-21 may be related with the occurrence and development of cholesteatoma of middle ear，and has played a potential role in cholesteatoma of middle ear in growing and diffusing.This paper reviewed the researching progress of the miR-21 and cellular signaling pathways and their interaction in occurrence mechanism and development of cholesteatoma of middle ear .

【Keyword】Cholesteatoma of middle ear；MicroRNAs；Pathogenesis

【中圖分類號】R764

【文獻標識碼】A

【文章編號】1672-2922（2016）02-304-4

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.02.036

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項目（2013211A098）

作者簡介：巴合提江·托克吉格特，研究生，耳鼻咽喉頭頸部腫瘤外科治療

通訊作者：阿依恒·曲庫爾汗，Email:ayhen979@sina.com

收稿日期：（2015-10-09審核人：翟所強）