袁新榮，左強強，馮琴，潘澤民（.克拉瑪依市第二人民醫(yī)院 檢驗科，新疆 克拉瑪依 834007；2.石河子大學醫(yī)學院 生物化學教研室，新疆 石河子832002）

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HS3ST2基因啟動子甲基化與新疆維吾爾族婦女子宮頸癌的相關性

袁新榮1，左強強1，馮琴1，潘澤民2Δ
（1.克拉瑪依市第二人民醫(yī)院 檢驗科，新疆 克拉瑪依 834007；2.石河子大學醫(yī)學院 生物化學教研室，新疆 石河子832002）

摘要：目的 探討HS3ST2基因啟動子甲基化與新疆維吾爾族婦女子宮頸癌的相關性以及早期診斷的可行性.分析HS3ST2基因甲基化對mRNA表達的影響。方法 采用甲基化特異性PCR方法和HPV16，HPV18特異的PCR方法分別檢測了40例正常子宮頸組織，40例新疆維吾爾族婦女子宮頸癌組織的HS3ST2基因啟動子甲基化情況和高危險性HPV的感染情況。用RT-PCR方法檢測了10例甲基化陽性和10例甲基化陰性的組織HS3ST2基因的mRNA表達情況。結果 37例宮頸癌組織，發(fā)生HS3ST2基因啟動子甲基化，正常組織沒有發(fā)生甲基化，相應的高危險性HPV（HPV16，HPV18）的感染例數(shù)分別為27、5例.40例宮頸癌組織，在10例甲基化陽性的組織中HS3ST2基因mRNA的表達水平明顯低于10例甲基化陰性的組織。結論 HS3ST2基因啟動子甲基化可能是維吾爾族宮頸癌發(fā)生關鍵分子標志，具有大規(guī)模臨床試驗和早期子宮頸癌篩查的臨床應用潛力。

關鍵詞：HS3ST2基因；新疆維吾爾族婦女；基因啟動子甲基化；HPV；子宮頸癌

宮頸癌是女性常見腫瘤，是全球范圍內(nèi)導致女性死亡的重要疾病，并且有年輕化趨勢。人類乳頭狀瘤病毒（HPV）感染與宮頸癌高度相關，被認為是必要條件，已用其進行子宮頸癌篩查，但是其特異性尤其是對于年輕女性的篩查相對較低。當前，大量的科學報道發(fā)現(xiàn)，抑癌基因啟動子甲基化可能在宮頸癌的發(fā)生中起了重要作用［1、2］。 硫酸乙酰肝素3-O-磺基轉移酶2基因（heparan sulfate 3-O-sulfotransferase 2，HS3ST2）是新近發(fā)現(xiàn)的一個抑癌基因，在細胞的機械支持、粘附、運動、增殖、分化和形態(tài)形成中起重要作用［3］。近來研究顯示，HS3ST2基因啟動子CpG島甲基化率在多種腫瘤中處于很高的狀態(tài)［4，5］，具有作為早期診斷宮頸癌分子標志物的潛力。但是HS3ST2 基因在宮頸癌中的作用機制尚不清楚，因此，本文分析HS3ST2基因啟動子甲基化，HPV16，HPV18（High-risk HPV，hr-HPV）感染和HS3ST2 mRNA表達的關系，以進一步認識其作用機制。

1　材料與方法

1.1研究對象

所有標本來自2009-2012年期間新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)院，石河子大學附屬醫(yī)院及克拉瑪依市第二人民醫(yī)院未經(jīng)過化療和放療的維吾爾族婦女宮頸手術切除的新鮮組織標本和活檢新鮮組織標本，所有取材均取得患者同意。

1.2DNA的提取

用SK1252基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司）提取組織DNA。步驟按說明書進行。

1.3DNA的亞硫酸氫鹽修飾

參照CpGenomeTM DNA Modification Kit S7820試劑盒（美國Chemicon公司）手冊說明對DNA進行亞硫酸氫鹽處理修飾并純化，修飾后的DNA置-80℃保存。

1.4甲基化特異性PCR

甲基化和非甲基化正向和反向引物序列參照文獻，使用 Bio-Rad 梯度PCR儀進行擴增，康為世紀PCR反應Mix，反應條件：先95℃×5 min，再94℃×1 min，58℃×1 min，72℃×1min，共34個循環(huán)，最后72℃ 延伸 10 min。最后使用2％的瓊脂糖凝膠電泳分析實驗結果。

1.5RNA的提取

取出-80℃保存的子宮頸甲基化陽性和陰性的組織各10例，每例樣本取30mg，使用液氮在研缽中研成粉末，用Trizol法提取 RNA。

1.6RT-PCR

將提取的 RNA使用reverse transcriptase（Fermentas，Hanover，MD，USA）試劑盒逆轉錄為cDNA。反應條件：95℃×5 min：94℃×30 s：58℃×30 s：72℃×30 s，共34個循環(huán)，最后72℃延伸 10 min。GAPDH 用作PCR擴增反應的內(nèi)對照。

1.7統(tǒng)計分析

2　結果

2.1甲基化特異性PCR結果和HPV16，HPV18的感染情況

40例正常組織沒有甲基化，40例宮頸癌組織分別有37例發(fā)生甲基化。相應的分別有5例、27例發(fā)生了hr-HPV的感染，兩項指標統(tǒng)計學均有顯著性差異（P＜0.01）（圖1，表2）

表1　引物信息和PCR反應條件

圖1　HS3ST2甲基化特異性PCR和HPV16，HPV18特異性PCR結果

表2　在子宮頸癌的各階段中，HS3ST2基因啟動子甲基化和hr-HPV感染發(fā)生的頻率

2.2半定量RT-PCR結果

結果在10例HS3ST2基因啟動子甲基化的組織中，HS3ST2基因的mRNA的表達量遠遠低于10例未甲基化的組織，甲基化陰性組織中的平均吸（P＜0.01，n=3）（圖2）。

圖2　10例HS3ST2基因啟動子甲基化陽性和10例陰性子宮頸組織的mRNA表達情況

3　討論

宮頸癌的發(fā)生是一種有多個病理階段，多步驟的過程，與hr-HPV感染高度相關，且有隨病變嚴重程度的增加而明顯上升的趨勢［6］，使其成為癌癥機制研究并篩查癌癥早期相關分子生物標志的理想模型。由于HSPG廣泛分布于細胞表面和細胞外基質(zhì)，是細胞外基質(zhì)的主要成分，而且其中的糖胺聚糖是多陰離子化合物，結合Na+、K+，從而吸收水分，其羥基也有親水性而形成凝膠，從而阻止細菌通過，但不影響小分子化合物的擴散。HS3ST2作為修飾HSPG的重要酶類，其沉默表達可能導致了修飾錯亂和信號傳導異常。此外，在對非小細胞性肺癌及癌周肺組織，腫瘤及非腫瘤的痰液等標本進行了11個基因的甲基化分析中HS3ST2基因居第一位，且甲基化水平隨腫瘤的病理分級升高而升高。顯示出很高的相關性［7］。

目前，HS3ST2基因在子宮頸癌發(fā)生中的具體分子機制的研究較少，雖然發(fā)現(xiàn)了其在許多腫瘤中的特異性和敏感性有應用于早期診斷的潛力，但是HS3ST2基因啟動子甲基化與mRNA的表達的關系尚未在子宮頸癌中研究。尤其是，當前將甲基化檢測應用于子宮頸癌篩查的主要問題不再是抑癌基因啟動子甲基化的特異性不高，而是由于需要結合陰道鏡和細胞學來分析甲基化與腫瘤進展的關系，但是這些分析尚存在分歧［8］，而且，當今的早期干預治療使得甲基化病人的長期隨訪無法進行，難以統(tǒng)計分析HS3ST2啟動子甲基化是否與子宮頸癌的進展惡化直接關系。對此，本文檢測了hr-HPV的感染情況，發(fā)現(xiàn)40例宮頸癌患與40例正常組織相比均出現(xiàn)較高甲基化和hr-HPV感染率（P＜0.01），提示hr-HPV感染與甲基化存在一定關系，為HS3ST2基因啟動子甲基化檢測應用于子宮頸癌的早期診斷的可靠性提供相關機制參考和分子水平支持。且甲基化水平高的組織mRNA的表達水平受到了顯著抑制（P＜0.01），進一步提示了甲基化在維吾爾族宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

由上述分析，HS3ST2基因啟動子甲基化與新疆維吾爾族婦女子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展高度相關，在HSIL和子宮頸癌中的高特異性和較高的敏感性使其具有補充和改進當前以細胞形態(tài)學和HPV檢測為主的早期篩查方法，HS3ST2基因啟動子甲基化可能是hr-HPV感染所誘導的早期重要的分子改變，具有子宮頸癌早期大規(guī)模篩查的潛力。

參考文獻

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［3］M.Bernfield，M.Gotte，P.W.Park，et al.Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans［J］.Annu.Rev.Biochem，1999，68:729-777..

［4］Yasuharu Tokuyama.Takao Takahashi，Naoki Okumura，et.al. Aberrant methylation of heparan sulfate glucosamine 3-o-sulfotransferase 2 genes as a biomarker in colorectal cancer［J］.Anticancer research.2010，30:4811-4818.

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［7］Narayan Shivapurkar，Victor Stastny，Makoto Suzuki，et al.Application of a methylation gene panel by quantitative PCR for lung cancers［J］.Cancer Letters.2007，24:756-771.

［8］Nan Yang，Jasper J.H.Eijsink，Aqnes Lendvai，et al.Methylation markers for CCNA1 and C13ORF18 are strongly associated with high-grade cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer in cervical scrapings［J］.Cancer Epidemiology，Biomarkers Prevention，2009，18:3000-3007.

Relationship Between the Promoter Methylation of HS3ST2 Gene and the Cervical Cancer in Xinjiang Uigur Women

YUAN Xin-rong1，ZUO Qiang-qiang1，F(xiàn)ENG Qin1，PAN Ze-min2Δ
（1.Department of laboratory， The Second People Hospital of Karamay region， Karamay， Xinjiang 834007 P.R.China， 3.Department of biochemistry， School of medicine， Shihezi university， Shihezi， Xinjiang 832002 P.R.China）

Abstract:Objective：To explore the relationship between the gene promoter methylation of HS3ST2 and the cervical cancer tissues of Xinjiang Uigur women and the feasibility of the early detection and analyze the HS3ST2 gene mRNA expression in methylatiion positive and negative tissues.Methods：Methylation specific PCR（MSP）and HPV16，HPV18 specific PCR were used to detect 40 normal cervix and 40 cervical cancer tissues of Xinjiang Uigur women.The relationship between the methylation and infection was also investigated in 40 cervical cancer tissues.RT-PCR was used to analyze HS3ST2 gene mRNA expression in 10 methylation positive and 10 methylation negative cervical tissues.Results：The methylation frequency of HS3ST2 was 37/40 in cervical cancer.However，HS3ST2 gene promoter methylatiion was not found in 40 normal cervix.The corresponding infection frequency of HPV is 27/40 and 5/40.The HS3ST2 gene mRNA expression level was more decreased in the 10 methylation positive cervical tissues than in the 10 methylation negative cervical tissues.Conclusion：The hypermethylated HS3ST2 may be the critical marker for the cervical lesion that will progress to cervical cancer and has the potential for the early cervical cancer screening.

Keywords:HS3ST2 gene；Xinjiang Uigur women；Gene promoter methylation； HPV； Cervical cancer

*基金項目：兵團青年科技創(chuàng)新資金項目（2012CB018）

作者簡介：袁新榮，女，漢族，本科，副主任技師；左強強，男，漢族，山東沂源，碩士生，研究方向：分子遺傳學

通訊作者：潘澤民