半胱氨酸蛋白酶參與調(diào)節(jié)ephrinBs/EphBs信號(hào)通路活化誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛研究

楊　梅，李　建，楊　蕊，王浩偉，袁紅斌

半胱氨酸蛋白酶參與調(diào)節(jié)ephrinBs/EphBs信號(hào)通路活化誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛研究

楊梅，李建，楊蕊，王浩偉，袁紅斌

[摘要]目的觀察小鼠鞘內(nèi)注射酪氨酸激酶受體EphB1及其配體ephrinB2-Fc對(duì)其神經(jīng)病理性疼痛行為的作用及對(duì)半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)表達(dá)水平的影響。方法昆明小鼠36只，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)+生理鹽水組(Sham+NS，n=6)、假手術(shù)+酪氨酸蛋白激酶受體B1組(Sham+EphB1，n=6)、坐骨神經(jīng)壓迫性損傷+生理鹽水組(CCI+NS，n=12)以及CCI+EphB1組(n=12)，于制模前1 d及制模后1、3、5、7、14 d時(shí)測(cè)定各組小鼠的機(jī)械刺激縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)，并于第5天將CCI+NS和CCI+EphB1組中的6只小鼠處死，取L4-5段脊髓，采用免疫組化方法測(cè)定caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)的含量。 另取昆明小鼠24只，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組6只，即空白對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組(NS, 鞘內(nèi)注射5 μl NS)、ephrinB2-Fc 0.1 μg組(注射濃度0.02 g/L，體積5 μl)、ephrinB2-Fc 0.5 μg組(注射濃度0.1 g/L，體積5 μl)。于給藥前3 h和給藥后3、6、9、12、24、48 h測(cè)定各組小鼠MWT和TWL，術(shù)后48 h取L4-5段脊髓，采用免疫組化方法測(cè)定脊髓中caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)的含量。結(jié)果在CCI模型中，與Sham+NS和Sham+EphB1比較，CCI+EphB1與CCI+NS 組術(shù)后第1、3、5、7 d MWT及術(shù)后第3、5、7 d TWL疼痛閾值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CCI+NS相比，CCI+EphB1組MWT和TWL顯著提高， caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白對(duì)照組及NS對(duì)照組相比，ephrinB2-Fc 0.1 μg、0.5 μg組MWT和TWL顯著降低， caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)的含量明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且濃度越高痛閾值越低，陽性細(xì)胞數(shù)越多。結(jié)論鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc、EphB1可分別引起小鼠機(jī)械痛敏和熱痛敏的升高和降低，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)caspase-3表達(dá)變化有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]神經(jīng)病理性疼痛；半胱氨酸蛋白酶3；ephrinB2-Fc ；EphB1 ；鞘內(nèi)注射

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是指由中樞或者外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷和病變所引起的一種疼痛綜合征，以自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和疼痛超敏為主要表現(xiàn)[1]，目前發(fā)病機(jī)制不明，但已成為臨床亟待解決的難題之一[2]。新近研究證實(shí)，軸突導(dǎo)向因子參與了神經(jīng)病理性痛的病理生理過程，其中，受體型酪氨酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinase,RTKs)亞家族Ephs及其配體ephrins在成年大鼠神經(jīng)組織，尤其是傷害性信息調(diào)制相關(guān)的脊髓后角I-III板層以及脊神經(jīng)節(jié)的中小直徑的神經(jīng)元中有表達(dá)[3-4]，并在疼痛調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用。Ephs分為EphA(A1～A8)和EphB(B1～B6)兩大亞家族，其配體分別為ephrinA(A1～A5)和ephrinB(B1～B6)。除此之外，還有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元凋亡也與神經(jīng)病理性疼痛關(guān)系密切。 de Novellis 等[5]發(fā)現(xiàn) ，阻滯谷氨酸mGlu5受體可減少凋 亡基因的表達(dá)及凋亡狀態(tài)，從而減輕痛覺過敏,脊髓背角神經(jīng)元的凋亡對(duì)神經(jīng)病理性疼痛起著重要作用[6]。而caspase-3是半胱氨酸蛋白酶caspase家族的一員，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，那么在ephrinBs/EphBs信號(hào)通路誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛的過程中，caspase-3調(diào)節(jié)的神經(jīng)元凋亡是否發(fā)揮作用還需進(jìn)一步研究。因此，本研究以正常小鼠和坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型(CCI)小鼠為對(duì)象，對(duì)其鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc(Fc標(biāo)記)和EphB1來觀察、明確ephrinBs/EphBs信號(hào)通路在神經(jīng)病理性疼痛中的作用及其此過程中caspase-3的表達(dá)變化，從而探討caspase-3在ephrinB2/EphB1引起疼痛過程中可能發(fā)揮的作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1動(dòng)物來源與主要試劑雄性昆明小鼠，體質(zhì)量22～25 g，購自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2012- 0003，使用許可證號(hào)SYXK(滬)2012- 0003]。ephrinB2-Fc購自R&D公司；小鼠EphB1/Aek5蛋白購自SB公司；兔抗caspase-3購自Cell Signaling公司；羊抗兔IgG二抗購自Abcam公司。多聚甲醛(PFA)、PBS等其他常用試劑均由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院疼痛診療教研室提供。Von Frey細(xì)絲購自美國Stoelting公司，熱痛刺激儀ME-410C購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所。

1.2鞘內(nèi)給藥及CCI動(dòng)物模型的制備小鼠按簡化后的Hylden和Wilcox[7]方法鞘內(nèi)給藥：腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后，定位L6并剪毛、消毒。按壓小鼠腰骶兩側(cè)固定，自L5-6棘突間隙進(jìn)針，以鼠尾突然出現(xiàn)側(cè)向擺動(dòng)為進(jìn)針成功標(biāo)志。注射用10 μl微量進(jìn)樣器進(jìn)行，注射容積為5 μl，注射時(shí)間為10 s，留針20 s。 36只雄性小鼠隨機(jī)分為4組，參考Bennett等[8]的方法建立左后肢CCI模型。小鼠稱質(zhì)量后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，暴露出坐骨神經(jīng)主干，用4-0鉻制腸線環(huán)繞神經(jīng)干分別做 4個(gè)輕度結(jié)扎環(huán)，間距1 mm，結(jié)扎強(qiáng)度以引起小腿肌肉輕度顫動(dòng)反應(yīng)但不影響神經(jīng)血運(yùn)為宜。局部敷以青霉素粉，縫合肌筋膜及各層組織后縫合皮膚。假手術(shù)組只暴露坐骨神經(jīng)，不做神經(jīng)結(jié)扎。術(shù)畢將大鼠放入底部鋪有熱毯的塑料盒中待其自由蘇醒，后于安靜、溫暖環(huán)境自由喂養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理取36只雄性昆明小鼠，隨機(jī)分為4組：(1)假手術(shù)(Sham)+生理鹽水(NS)對(duì)照組(n=6)，鞘內(nèi)注射NS，0.5 h后暴露左后肢坐骨神經(jīng)主干，但不予結(jié)扎，后逐層縫合；(2)Sham+磷酸化酪氨酸蛋白激酶受體B1(EphB1)組(n=6)，鞘內(nèi)注射EphB1 0.1 g/L，0.5 h后暴露左后肢坐骨神經(jīng)主干，但不予結(jié)扎，后逐層縫合；(3)坐骨神經(jīng)壓迫性損傷(CCI)+NS組(n=12)，鞘內(nèi)注射NS，0.5 h后暴露左后肢坐骨神經(jīng)主干并結(jié)扎，后逐層縫合；(4)CCI+EphB1組(n=12)，鞘內(nèi)注射EphB1 0.1 g/L，0.5 h后暴露左后肢坐骨神經(jīng)主干并結(jié)扎，后逐層縫合。各組小鼠均于術(shù)前1 h測(cè)基礎(chǔ)痛閾值，術(shù)前0.5 h行鞘內(nèi)注射，注射劑量均為5 μl，術(shù)后第1、3、5、7、14天測(cè)定小鼠的機(jī)械性縮足閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)，其中CCI+NS和CCI+EphB1組在術(shù)后第5天將其中6只處死灌流取L4-5段脊髓做免疫組化，剩余6只繼續(xù)參與后續(xù)行為測(cè)定。另取24只昆明小鼠，隨機(jī)分為4組(每組6只)：(1)空白對(duì)照組，不做任何處理，只在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定MWT、TWL和caspase-3；(2)NS對(duì)照組，鞘內(nèi)注射 NS；(3)ephrinB2-Fc 0.1 μg組，鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc 0.02 g/L；(4)ephrinB2-Fc 0.5 μg組，鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc 0.1 g/L。各組注射劑量均為5 μl，于測(cè)定完MWT和TWL基礎(chǔ)值(術(shù)前3 h)后1 h給予鞘內(nèi)注射相應(yīng)溶劑，之后分別于3、6、9、12、24、48 h測(cè)定MWT和TWL，并于48 h測(cè)定完所有數(shù)值后將小鼠處死，灌流，取L4-5段脊髓做免疫組化染色。

1.4行為學(xué)測(cè)定機(jī)械痛測(cè)定參照Dixon[9]的測(cè)試方法，Von Frey纖維細(xì)絲測(cè)定MWT，將一有機(jī)玻璃箱(20 cm×25 cm×15 cm)置于金屬篩網(wǎng)上，小鼠放置于玻璃箱中，待小鼠在有機(jī)玻璃箱中適應(yīng)30 min后，用Von Frey纖維絲垂直刺激小鼠后肢足底中部，持續(xù)時(shí)間≤4 s，小鼠出現(xiàn)抬足或者舔足行為視為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。測(cè)定首先從1.0 g開始，4.0 g結(jié)束，當(dāng)該力度的刺激不能引起陽性反應(yīng)，則給予相鄰大一級(jí)力度的刺激；如果出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予相鄰小一級(jí)力度的刺激，如此連續(xù)進(jìn)行，直至出現(xiàn)第2次陽性和陰性反應(yīng)的騎跨，再連續(xù)測(cè)定4次。每次刺激間隔30 s，以此向下推算小鼠50%縮足閾值。

熱痛測(cè)定按Hargreaves法[10]測(cè)定TWL，將有機(jī)玻璃箱(7 cm×9 cm×11 cm)置于3 mm厚的玻璃板上，將小鼠放入其中并適應(yīng)1 h，后用熱痛刺激儀照射小鼠足底，照射開始至小鼠出現(xiàn)抬腿回避時(shí)即為TWL。自動(dòng)切斷時(shí)間為20 s，以防止組織損傷。熱刺激強(qiáng)度在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中維持一致。每只動(dòng)物測(cè)定5次，每次間隔3 min，取后3次平均值為小鼠TWL值。

1.5免疫組織化學(xué)染色按實(shí)驗(yàn)安排時(shí)間點(diǎn)及個(gè)數(shù)取小鼠脊髓背角測(cè)定caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)的變化。所有小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后開胸，分離暴露心臟，用事先將針頭磨平的頭皮針插至小鼠左心室，剪破右心耳，4 ℃的0.1 mol/L PBS 40 ml快速?zèng)_洗，繼之以4 ℃ 4%多聚甲醛溶液(內(nèi)含0.1 mol/L PBS，pH7.4)60 ml灌注固定，后取L4-5脊髓，在4 ℃ 4%多聚甲醛中固定8 h，然后石蠟包埋，每個(gè)標(biāo)本于石蠟切片機(jī)上切取6張(同一部位)，片厚5 μm。免疫組織化學(xué)染色采用ABC復(fù)合物(1∶200)室溫30 min，最后用DAB/H2O2溶液進(jìn)行呈色反應(yīng)。用0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。每只小鼠取6張脊髓切片染色(其中1張用于陰性對(duì)照染色)，在脊髓背角淺層先于20×10倍光鏡下觀察，然后用MoticB5顯微攝像系統(tǒng)(MotieChina，北京)進(jìn)行圖片采集，后在圖片上以中央管為標(biāo)志，橫豎均垂直90°觀察約1/4脊髓即一側(cè)脊髓背角內(nèi)caspase-3的陽性細(xì)胞數(shù)量，每個(gè)分組統(tǒng)計(jì)5張切片的數(shù)量，匯總后求平均數(shù)得所需結(jié)果。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。各組術(shù)前痛的比較采用單因素方差分析；術(shù)后各組機(jī)械痛和熱痛的比較采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析。各組小鼠在CCI前后疼痛的比較以及caspase-3免疫組化結(jié)果變化的比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水平α為0.05。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1鞘內(nèi)注射EphB1對(duì)CCI小鼠痛閾值及脊髓背角凋亡的影響

(1)鞘內(nèi)注射EphB1對(duì)CCI模型小鼠熱痛及機(jī)械痛閾值的影響與鞘內(nèi)注射前比較，Sham+NS組與Sham+Eph組小鼠的MWT和TWL差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Sham+NS組和Sham+Eph組比較，CCI+NS和CCI+Eph組小鼠MWT、TWL降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，根據(jù)均值可得在第5天痛閾值達(dá)到最低，14 d接近正常； CCI+Eph組與CCI+NS組小鼠MWT、TWL明顯有所提高，即機(jī)械痛及熱痛均減輕，第3、5、7天尤為明顯。結(jié)果提示，在CCI模型中，鞘內(nèi)注射EphB1可以明顯減輕CCI小鼠3～7 d機(jī)械痛及熱痛閾值。見圖1、2。

注：與Sham+NS及Sham+Eph組比較，aP<0.01；與CCI+NS組比較，aP<0.05圖1　鞘內(nèi)注射EphB1的CCI模型小鼠各測(cè)試點(diǎn)的機(jī)械痛閾值(n=6)

注：與Sham+NS及Sham+Eph組比較，aP<0.05；與CCI+NS組比較，aP<0.05圖2　鞘內(nèi)注射EphB1的CCI模型小鼠各測(cè)試點(diǎn)的熱潛伏期(n=6)

2.1.2鞘內(nèi)注射EphB1對(duì)CCI模型小鼠脊髓背角caspase-3表達(dá)的影響免疫組化染色結(jié)果顯示CCI+Eph組與CCI+NS組小鼠相比，陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。以上結(jié)果綜合提示，CCI模型組小鼠鞘內(nèi)注射EphB1可明顯提高疼痛閾值并減少Caspse-3陽性細(xì)胞表達(dá)。

注：與CCI+NS比較，CCI+Eph組陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少。A：CCI+Eph組； B：CCI+NS組圖3　CCI各組小鼠脊髓背角caspase-3免疫組化圖(HE×200)

2.2鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc對(duì)正常小鼠痛閾值及脊髓背角凋亡的影響

2.2.1鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc對(duì)正常小鼠熱痛及機(jī)械痛閾值的影響與鞘內(nèi)注射前比較，空白對(duì)照組與NS對(duì)照組小鼠無明顯差異(P>0.05)。 與空白對(duì)照組或NS對(duì)照組相比，鞘內(nèi)注射0.5 g/L或0.1 g/L ephrinB2-Fc會(huì)導(dǎo)致熱痛閾值和機(jī)械痛閾值隨時(shí)間變化的降低，且濃度越高痛閾值降低越明顯，恢復(fù)越慢，其中痛閾值在鞘內(nèi)注射后6 h達(dá)到最低(P<0.01)，24 h后回升，48 h基本接近正常，該結(jié)果提示鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc可引起時(shí)間及劑量依賴性的疼痛反應(yīng)。見圖4、5。

注：與空白對(duì)照線及對(duì)NS對(duì)照組比較，aP<0.01；與ephrinB2-Fc 0.1 g/L組比較，aP<0.01圖4　鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc的正常小鼠各測(cè)試點(diǎn)的機(jī)械痛閾值

注：與空白對(duì)照組及NS對(duì)照組相比，aP<0.01；與ephrinB2-Fc 0.1 g/L組相比，aP<0.01圖5　鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc的正常小鼠各測(cè)試點(diǎn)的熱潛伏期

注：A為NS對(duì)照組；B為空白對(duì)照組；C為ephrinB2-Fc 0.02 g/L組；D為ephrinB2-Fc 0.5 g/L組圖6　正常小鼠鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc后脊髓背角caspase-3免疫組化HE染色結(jié)果(×200)

2.2.2鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc對(duì)正常小鼠脊髓背角caspase-3表達(dá)的影響免疫組化染色顯示(圖6、7)空白對(duì)照組與NS對(duì)照組小鼠caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)無明顯差異(P>0.05)。與空白對(duì)照組或NS對(duì)照組小鼠相比，鞘內(nèi)注射0.02 g/L或0.1 g/L ephrinB2-Fc的caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，且注射濃度越高陽性細(xì)胞數(shù)越多(P<0.01)。

注：與空白對(duì)照組及NS對(duì)照組比較，aP<0.05；與ephrinB2-Fc 0.1 g/L組比較，aP<0.05圖7　正常小鼠鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc后脊髓背角caspase-3免疫組化指數(shù)(n=6)

3討論

EphB/ephrinB參與脊神經(jīng)節(jié)段性組織[11]，在脊髓和脊神經(jīng)的發(fā)展中持續(xù)表達(dá)[12]，通過正向與逆向傳導(dǎo)通路調(diào)控樹突棘的細(xì)胞骨架促進(jìn)樹突棘的生長間接誘導(dǎo)NPP的產(chǎn)生[13]，包含軸索導(dǎo)向、血管發(fā)生、組織結(jié)構(gòu)的形成、細(xì)胞遷移以及樹突形態(tài)和突觸的發(fā)生等多種生物功能[14]。近有研究證實(shí)在新生小鼠鞘內(nèi)或足底注射ephrinB1-Fc可引起小鼠時(shí)間及劑量依賴性的痛覺過敏，術(shù)后2～8 h尤為明顯，持續(xù)約24 h后基本接近正常[15]，這與本研究中鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc后出現(xiàn)與基礎(chǔ)值相比的MWT和TWL降低，6～12 h明顯，24 h開始恢復(fù)，且濃度越高疼痛越重、恢復(fù)越慢的結(jié)果基本一致。該現(xiàn)象可能與脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞參與疼痛調(diào)節(jié)，通過C纖維誘發(fā)脊髓背角神經(jīng)元的長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)及降低LTP的刺激閾值有關(guān)[16]。另外，直接進(jìn)行鞘內(nèi)注射作用于中樞也保證了效果的確切性，比外周注射更有優(yōu)勢(shì)，更易誘發(fā)疼痛的產(chǎn)生。CCI模型小鼠鞘內(nèi)注射EphB1，發(fā)現(xiàn)CCI+NS組小鼠疼痛閾值在第5 d達(dá)最低，后逐漸回升，其中CCI+EphB1組小鼠與CCI+NS組相比MWT和TWL均上升，疼痛減輕，說明EphB1與ephrinB1一樣參與疼痛的產(chǎn)生過程。

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子。關(guān)于caspase-3在疼痛中的作用的研究，Scholz[17]等就有神經(jīng)病理性疼痛及炎癥性疼痛模型上發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元凋亡的相關(guān)報(bào)道，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在疼痛刺激下caspase-3表達(dá)上調(diào)?；谏鲜隼碚摬浑y發(fā)現(xiàn)，caspase-3在多種類型的疼痛中均發(fā)揮作用，那么caspase-3與ephrinBs/EphBs信號(hào)通過誘發(fā)的疼痛關(guān)系怎樣，筆者提出如下假設(shè)：caspase與疼痛關(guān)系密切，是NPP中的調(diào)節(jié)分子，并且該調(diào)節(jié)作用同樣適用于ephrinBs/EphBs信號(hào)通路引發(fā)的疼痛。在結(jié)果中可見，ephrinB2-Fc誘發(fā)的疼痛模型中隨著小鼠疼痛的產(chǎn)生，脊髓caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)的含量明顯比NS和空白對(duì)照組增多，且隨著時(shí)間及濃度的增加小鼠的疼痛也增加，呈現(xiàn)出時(shí)間及劑量依賴性；在CCI+NS組與CCI+Eph組中，后者caspase-3表達(dá)減少，說明EphBs在減輕疼痛的過程中可能通過caspase-3發(fā)揮作用。上述結(jié)果間接驗(yàn)證了假設(shè)的合理性。

綜上所述，不難得出結(jié)論，ephrinB2/EphB1信號(hào)通路參與疼痛過程，其中ephrin引起疼痛而Eph可減輕疼痛，并且此信號(hào)通路是通過caspase-3機(jī)制發(fā)揮作用，這一理論提示脊髓背角神經(jīng)元的凋亡可能是ephrinB2/EphB1信號(hào)通路作用于疼痛的機(jī)制之一，該通路將成為臨床治療疼痛的又一新靶點(diǎn)。

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(本文編輯：張陣陣)

Research on the role of caspase-3 in the regulation of neuropathic pain induced by ephrinBs/EphBs signal pathway in mice

Yang Mei, Li Jian, Yang Rui, Wang Haowei, Yuan Hongbin

(DepartmentofAnesthesiology,ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of intrathecal ephrinB2-Fc and EphB1 treatment on the neuropathic pain and the expression level of caspase-3 in dorsal horn of spinal cord in mice.Methods A total of 36 KM mice were evenly randomized into 4 groups: the Sham surgery + normal saline control group (or the Sham + NS group) (n=6), the Sham surgery + EphB1 group (or the Sham+ EphB1 group)( n=6), the CCI + NS group(n=12)and the CCI + EphB1 group(n=12). Mechanical withdrawal threshold (MWT)and thermal withdrawal latency(TWL)were detected one day before and 1, 3, 5, 7 and 14 days after the development of the model. Then, at day 5, 6 mice from the CCI+NS and CCI+EphB1 groups were sacrificed, and L4-5 segments of the spinal cord were collected for the detection of caspase-3 positive cell counts by immunohistochemistry. Another 24 KM mice were taken for study and they were randomly divided into the 4 groups, i.e. the blank control group, normal saline control group (intrathecal injection of 5 μl NS), the 0.1 μg ephrinB2-Fc group (at a dosage of 0.02 g/L, volume 5 μl) and the 0.5 μg ephrinB2-Fc group(at a dosage of 0.1 g/L, volume 5 μl). MWT and TWL of various groups were detected 3 hours before medication and 3, 6, 9, 12, 24 and 48 hours after medication. Forty-eight hours after surgery, L4-5 segments of the spinal cord were collected for the detection of caspase-3 positive cell counts by immunohistochemistry.ResultsIn the CCI+EphB1 and CCI+NS groups of the CCl model, the MWT levels at day 1, 3, 5 and 7 after surgery and TWL levels at day 3, 5 and 7 after surgery were all significantly decreased, as compared with those of the Sham+NS and Sham+EphB1 groups (P<0.05). As compared with the blank control and NS control groups, the expression level of caspase-3 was obviously decreased, and MWT and TWL were significantly increased(P<0.05). In the ephrin B2-Fc group, there were no significant changes in MWT, TWL and caspase-3 levels for the bland control and NS groups, as compared with those before treatment(P>0.05). As compared with those before treatment, the MWT and TWL levels for the 0.1 μg and 0.5 μg ephrinB2-Fc groups were significantly decreased, positive Caspase-3 counts were significantly increased. Statistical significance could be seen, when comparisons were made(P<0.05). The higher the concentrations, the lower the levels of MWT and TWL, and there were more positive cells.ConclusionIntrathecal injection of ephrinB2-Fc and EphB1 could increase and reduce the mechanical and heat hyperalgesia, the mechanism of which might be associated with the regulation of the expression of caspase-3.

[Key words]Neuropathic pain; Caspase-3; EphrinB2-Fc; EphB1; Intrathecal injection

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81371253、81171054)，上海市教委創(chuàng)新基金重點(diǎn)項(xiàng)目(1477083)

[作者單位]200003上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院麻醉科

[通信作者]袁紅斌，電子信箱：jfjczyy@aliyun.com

[中圖分類號(hào)]R747

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1009-0754.2016.03.009

(收稿日期：2016-01-03)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)··論著·