上海市浦東新區(qū)2012-2013年病毒性腹瀉檢測情況分析

丁　明，劉春利，潘麗峰，陸　嵐，邱慧芳，劉　青，朱林英，馬　平，郝莉鵬，傅益飛

上海市浦東新區(qū)2012-2013年病毒性腹瀉檢測情況分析

丁明，劉春利，潘麗峰，陸嵐，邱慧芳，劉青，朱林英，馬平，郝莉鵬，傅益飛

[摘要]目的了解上海市浦東新區(qū)2012-2013年間常見病毒性腹瀉的病原學(xué)特征，為腹瀉病的防控提供依據(jù)。方法收集2012-2013年上海市浦東新區(qū)14家監(jiān)測醫(yī)院腹瀉患者的糞便標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR)檢測輪狀病毒、諾如病毒GI型、諾如病毒GII型、星狀病毒、扎如病毒和腸腺病毒。結(jié)果共檢測糞便樣本4 214份。1 255份樣本檢出至少1種病毒核酸，核酸陽性檢出率為29.78%。輪狀病毒、諾如病毒GI型、諾如病毒GII型、扎如病毒、星狀病毒以及腸腺病毒的檢出率分別為7.6%、1.4%、18.6%、1.6%、1.5%和1.1%。各年齡組均有病毒檢出，其中年齡最小的為1歲，最大為92歲，分別為感染輪狀病毒和諾如病毒。病毒性腹瀉感染不存在男女差異，但不同年齡組的病毒性腹瀉感染有差異。不同病毒病原的感染存在不同的高峰期，但主要集中在秋冬季。結(jié)論諾如病毒和輪狀病毒是浦東地區(qū)病毒性腹瀉的主要病原。應(yīng)該加強(qiáng)對病毒性腹瀉的監(jiān)測，尤其是諾如病毒和輪狀病毒。

[關(guān)鍵詞]病毒性腹瀉；諾如病毒；輪狀病毒；扎如病毒；星狀病毒；腸腺病毒

諾如病毒(norovirus，NV)、輪狀病毒(rotavirus，RV)、扎如病毒(sapovirus，SPV)、星狀病毒(astrovirus，ASTV)和腺病毒(adenovirus，ADV)等是引起人類腹瀉的主要病毒性病原，近年來全國各地開展的腹瀉綜合監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，病毒性腹瀉占有較高比例，諾如病毒和輪狀病毒為主[1-5]。上海市浦東新區(qū)疾病預(yù)防控制中心從2011年開始對轄區(qū)內(nèi)14家醫(yī)療機(jī)構(gòu)腹瀉患者進(jìn)行監(jiān)測[6]，采集患者的糞便樣本進(jìn)行上述腹瀉病毒的檢測?，F(xiàn)將2012年1月到2013年12月的檢測結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源及數(shù)量

本研究所采集的標(biāo)本為24 h內(nèi)大便次數(shù)3次或以上、且大便性狀有改變(呈稀便、水樣便、黏膿便或膿血便等)的門診病例的糞便標(biāo)本。標(biāo)本采自仁濟(jì)醫(yī)院東院(以下簡稱仁濟(jì))、上海市兒童醫(yī)學(xué)中心(以下簡稱兒中心)、東方醫(yī)院(以下簡稱東方)、公利醫(yī)院(以下簡稱公利)、浦南醫(yī)院(以下簡稱浦南)、周浦醫(yī)院(以下簡稱周浦)及金楊社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心(以下簡稱金楊)、上海市第六人民醫(yī)院東院(以下簡稱六院)、浦東新區(qū)人民醫(yī)院(以下簡稱浦人醫(yī))、浦東醫(yī)院(原南匯中心醫(yī)院，以下簡稱浦東)、上海市第七人民醫(yī)院(以下簡稱七院)、南華醫(yī)院(以下簡稱南華)、機(jī)場鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心(以下簡稱機(jī)場鎮(zhèn))、泥城社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心(以下簡稱泥城)等沿海片區(qū)的腸道門診。從2012年1月到2013年12月，共采集腹瀉糞便樣本4 214份，各醫(yī)療機(jī)構(gòu)樣本采集數(shù)量見圖1。樣本采集后運(yùn)送至上海市浦東新區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.2主要儀器

核酸提取采用QIAxtractor全自動(dòng)核酸抽提儀(德國QIAGEN公司)。實(shí)時(shí)熒光檢測采用Opticon 2實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)、7500fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)、7000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)、LightCycler480II(瑞士羅氏公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1糞便樣本處理取2 g左右糞便加入裝有10 ml磷酸緩沖液的15 ml離心管中，擰緊離心管，用震蕩器劇烈震蕩，用冷凍離心機(jī)3 000×g，離心10 min，取上清備用。

1.3.2核酸提取根據(jù)QIAxtractor全自動(dòng)核酸抽提儀核酸提取操作方案進(jìn)行。樣本體積為200 μl，提取以后得到總核酸體積為60 μl。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)引物根據(jù)Liu等[7]文獻(xiàn)所述，由Invitrogen公司合成。試劑采用Qiagen公司生產(chǎn)的QuantiTect Probe RT-PCR Kit，反應(yīng)體系為25 μl，由12.5 μl、2×QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix， 0.6 μl、0.4 μmol/L 上下游引物，0.3 μl、0.2 μmol/L探針， 0.3 μl QuantiTect RT Mix、5.7 μl RNase-free Water以及5 μl模板核酸組成。根據(jù)各儀器操作說明，設(shè)置反應(yīng)條件為：50 ℃，30 min；95 ℃，15min；再按94 ℃，15 s→60 ℃，60 s循環(huán)40次，熒光檢測在60 ℃。Ct值≤35時(shí)，判斷結(jié)果為陽性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

病例信息和檢測結(jié)果均錄入Excel 2007進(jìn)行整理，用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1腹瀉病例感染病原的檢出情況

對4 214份標(biāo)本都進(jìn)行了RV、諾如病毒GI型(NV GI)、諾如病毒GII型(NV GII)、ASTV、SPV和ADV的real-time PCR檢測，共檢出1 255份標(biāo)本含有至少1種病毒核酸。其中1 170份為單一病毒核酸陽性，80份為雙重病毒核酸陽性，5份為三重及以上病毒核酸陽性的樣本檢出。核酸陽性檢出率為29.78%(1 255/4 214)。各病毒按檢出陽性率排列依次為NV GII 18.6%(784/4 214)、RV 7.6%(321/4 214)、SPV 1.6%(69/4 214)、ASTV 1.5%(63/4 214)、NV GI 1.4% (59/4 214)以及ADV 1.1%(48/4 214)。

2.2腹瀉病毒感染的性別構(gòu)成情況

在所有的4 214份樣本中，男性患者2 180份(51.73%)，女性患者2 034份(48.27%)，男女比1.07∶1接近1∶1。陽性樣本中，男性患者663份(52.83%)，女性患者592份(47.17%)，經(jīng)檢驗(yàn)，病毒性腹瀉男女患者陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.398，P=0.334)。

2.3腹瀉患者的年齡分布情況

1 255例病毒性腹瀉患者的年齡在1～98歲，其中感染NV的患者年齡為1～92歲、感染RV的患者年齡為1～92歲、感染SPV的患者年齡為1～79歲、感染ASTV的患者年齡為1～84歲、感染EADV的患者年齡為1～92歲。經(jīng)檢驗(yàn)，各年齡組間的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=55.484，P<0.05)。各年齡組腹瀉病毒感染的檢出情況見表1。

注：A-F分別為輪狀病毒、諾如病毒GI型、諾如病毒GII型、扎如病毒、星狀病毒以及腸道腺病毒在2012年1月到2013年12月間檢出數(shù)及檢出率；RV為輪狀病毒，NV GI為諾如病毒GI型，NV GII為諾如病毒GII型，SPV為扎如病毒，ASTV為星狀病毒，ADV為腺病毒圖2　2012-2013年上海市浦東新區(qū)腹瀉病毒的檢出情況

年齡組RVNVGINVGIISPVASTVADV合計(jì)1～1052185692718011～2094230123921～304811132208422331～4056121391615123941～502769595414651～606714164912627261～704888969116171～80101343104981～92422403336合計(jì)321597856963481345

注：RV為輪狀病毒，NV GI為諾如病毒GI型，NV GII為諾如病毒GII型，SPV為扎如病毒，ASTV為星狀病毒，ADV為腺病毒

2.4腹瀉患者的時(shí)間分布情況

2012-2013年各月間均有腹瀉病毒檢出，其中10月最多為76份，9月最少為14份。經(jīng)檢驗(yàn)，各月間腹瀉病毒的檢出率有顯著差異(χ2= 136.847，P<0.05)。2012-2013年各月間，各病毒的檢出情況見圖2。

3討論

浦東新區(qū)疾病預(yù)防控制中心自2011年7月開始對轄區(qū)內(nèi)腹瀉病的感染情況進(jìn)行監(jiān)測。2011年對1 327份腹瀉標(biāo)本進(jìn)行檢測，核酸的陽性率為13.49%[6]，遠(yuǎn)低于本研究時(shí)段的29.78%。NV在本研究時(shí)段中出現(xiàn)了高檢出率，尤其是GII型，達(dá)到了18.6%，比2011年所有病原的總檢出率還要高。RV的檢出率從8.29%降低為7.6%，是所有病原中檢出率唯一降低的病毒。而SPV、ASTV和ADV的檢出率均有增加。這可能與2011年只是半年時(shí)間的檢測，不是一個(gè)完整的年度監(jiān)測結(jié)果，因此不能完整的反映出病毒病原在一個(gè)完整年度中的流行趨勢有關(guān)。同時(shí)，也有可能與病毒病原在不同年度的流行強(qiáng)度相關(guān)。

在本研究時(shí)段內(nèi)，人群的性別差異基本與2011年和其他涉及到成人研究的地區(qū)相一致，男女比在1∶1左右[2-3，8]。對嬰幼兒腹瀉的研究發(fā)現(xiàn)男性感染者要多于女性[9]，可能與男童較女童頑皮，個(gè)人衛(wèi)生沒有搞好相關(guān)。

病毒感染是引起腹瀉的原因之一。在涉及到成人的病毒性腹瀉病原研究中，NV感染是引起成人腹瀉的主要病毒病原[2-3，8]，而RV感染則是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原[1，5，10-14]，ASTV、SPV和EADV則根據(jù)地區(qū)的不同，檢出情況也不盡相同，但檢出率均在5%以下[1-6，8，10-16]。因此，NV和RV是目前引起病毒性腹瀉的主要病原。同時(shí)，21～60歲年齡組在本研究時(shí)段內(nèi)青壯年病毒性腹瀉的主要病毒性病原是NV，在本研究中接近50%。

在流行季節(jié)上，NV呈全年流行狀態(tài)，但是每年的冬季是流行期，尤其是1、2月份是感染的高峰期。其余病毒也呈現(xiàn)出冬季是流行高峰的狀態(tài)。特別的是SPV和ASTV，兩者在2013年7月以后均未檢出，而NV、RV和EADV則在此時(shí)出現(xiàn)較高的檢出率。在檢測試劑沒有變化的情況下，出現(xiàn)SPV和ASTV未檢出，提示可能出現(xiàn)病毒變異的情況。

總之，需要對NV和RV做好監(jiān)測和防控工作，同時(shí)，在開展病毒性腹瀉核酸檢測的基礎(chǔ)上，還要繼續(xù)對相關(guān)病毒進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和分子流行病學(xué)研究，為本地區(qū)病毒性腹瀉的防控工作打下扎實(shí)的基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]劉桂香，易虎，田登，等. 2011年西寧地區(qū)兒童腹瀉病毒流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國婦幼保健, 2013, 28(4):674-676. DOI:10.7620/zgfybj.j.issn.1001-4411.2013.28.37.

[2]胡婷婷，羅敏紅，冀新鳳，等. 廣州市醫(yī)院成人病毒性腹瀉的分子流行病學(xué)研究[J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 13(1):20-23.

[3]黎景全，黃勇，袁達(dá)康，等. 東莞市病毒性腹瀉病原學(xué)分析[J]. 中國熱帶醫(yī)學(xué), 2013, 13(1):15-18.

[4]沙比熱木·托合塔木，阿依古麗·伊爾哈力，劉紅斌，等. 2010年烏魯木齊市住院兒童病毒性腹瀉監(jiān)測結(jié)果分析[J]. 疾病監(jiān)測, 2013, 28(6):439-442. DOI:10.3784/j.issn.1003-9961.2013.6.006.

[5]韓東升，陳瑜. 我國東南沿海地區(qū)兒童急性腹瀉患者病毒學(xué)病原譜研究//浙江省醫(yī)學(xué)會檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會、浙江省醫(yī)師協(xié)會檢驗(yàn)醫(yī)師分會, F, 2012 [C].

[6]潘麗峰，劉丹，劉青，等. 上海市浦東新區(qū)2011年病毒性腹瀉檢測情況分析[J]. 中國初級衛(wèi)生保健, 2012, 26(9):50-52. DOI:10.3969/j.issn.1001-568X.2012.09.021.

[7]Liu J, Kibiki G, Maro V, et al. Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis[J]. J Clin Virol, 2011, 50(4):308-313. DOI:10.1016/j.jcv.2010.12.009.

[8]王春娟，陳志軍，白堯. 西安市病毒性腹瀉病原學(xué)構(gòu)成及流行特征分析[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2013, 40(5):941-943.

[9]陳平，許志良，崔大偉，等. 浙江省急性腹瀉患兒中腸道病毒檢測分析研究 [J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生, 2013, 51(12): 109-113.

[10] 唐志紅，唐景裕，祖秀明，等. 嬰幼兒病毒性腹瀉病原學(xué)的研究 [J]. 中國兒童保健雜志, 2013, 21(10): 1032-1034.

[11] 張宏偉，來金濤，王莎，等. 兒童病毒性腹瀉研究進(jìn)展 [J]. 西藏醫(yī)藥雜志, 2013, 34(1): 29-33.

[12] 李俊華，周帥鋒，劉運(yùn)芝，等. 2009-2010年湖南省哨點(diǎn)醫(yī)院嬰幼兒病毒性腹瀉病原學(xué)研究[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2012, 19(3):337-341. DOI:10.3969/j.issn.1006-3110.2012.03.005.

[13] 杜振元. 朝陽地區(qū)腹瀉兒童病毒感染情況分析 [J]. 中國醫(yī)學(xué)工程, 2014, 22(1): 181.

[14] 王芳，韋統(tǒng)友，張廣蘭. 嬰幼兒秋冬季腹瀉病毒感染的流行特點(diǎn)分析[J]. 衛(wèi)生職業(yè)教育, 2012, 30(20):109-111. DOI:10.3969/j.issn.1671-1246.2012.20.062.

[15] 趙曉玲，張克春，楊杰，等. 2012年深圳市寶安區(qū)病毒感染性腹瀉監(jiān)測結(jié)果分析[J]. 中國民康醫(yī)學(xué), 2013, 25(12):1-3,82. DOI:10.3969/j.issn.1672-0369.2013.12.001.

[16] 張海龍，李苑，張克春，等. 2010年廣東省深圳市病毒性腹瀉監(jiān)測結(jié)果分析[J]. 疾病監(jiān)測, 2012, 27(1):4-7.

(本文編輯：林永麗)

Detection and analysis of viral diarrhea in Shanghai Pudong New District from 2012 to 2013

Ding Ming, Liu Chunli, Pan Lifeng, Lu Lan, Qiu Huifang, Liu Qing, Zhu Linying, MA Ping, Hao Lipeng, Fu Yifei

(DiseasePreventionandControlCenter,PudongNewDistrict,Shanghai200136,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the pathogenic features of viral diarrhea in Shanghai Pudong New District, from 2012 to 2013, so as to provide solid evidence for the prevention and control of infectious diarrhea.Methods Stool samples were collected from diarrhea patients in 14 hospitals under surveillance in Pudong New District from 2012 to 2013. Rotavirus, norovirus (types GI and GII), sapovirus, astrovirus and enteric adenovirus were detected by using real-time polymerase chain reaction (real-time PCR).ResultsTotally, 4214 stool samples were detected and at least one virus nucleic acid was detected in 1255 samples, with a positive detection rate of 29.78%. The detection rates of rotavirus, norovirus type GI and GII, sapovirus, astrovirus and enteric adenovirus were 7.6%,1.4%,18.6%,1.6%,1.5% and 1.1% respectively. Viruses were detected in all age groups, in which the youngest was just one year old and the oldest was 92 years old, who were infected respectively by rotavirus and norovirus. There were no differences in the infection of viral diarrhea between male and female, however, differences could be seen in the infection of viral diarrhea between different age groups. Different viruses had different prevalent seasons, the peak seasons were in autumn and winter.ConclusionNorovirus and rotavirus were the major pathogens to cause viral diarrhea in Pudong. Efforts should be made for the detection of viral diarrhea, particularly the diarrhea induced by norovirus and rotavirus.

[Key words]Viral diarrhea; Norovirus; Rotavirus; Sapovirus; Astrovirus; Enteric Adenovirus

[基金項(xiàng)目]上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年醫(yī)學(xué)人才培養(yǎng)計(jì)劃資助(PWRq2012-23)

[作者單位]200136上海，浦東新區(qū)疾病預(yù)防控制中心(丁明、潘麗峰、陸嵐、邱慧芳、劉青、朱林英、馬平、郝莉鵬、傅益飛)；解放軍92763部隊(duì)醫(yī)院(劉春利)

[通信作者]潘麗峰，電子信箱：alexpan0804@163.com

[中圖分類號]R573.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1009-0754.2016.03.016

(收稿日期：2015-05-04)

·臨床醫(yī)學(xué)··論著·