細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)對滸苔孢子囊形成的影響

王 菁， 牛從從， 王 輝， 郇 麗（. 山東省青島第五十八中學(xué)， 山東 青島 6600； . 中國科學(xué)院海洋研究所， 山東 青島， 6607）

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細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)對滸苔孢子囊形成的影響

王 菁1， 牛從從1， 王 輝2， 郇 麗2
（1. 山東省青島第五十八中學(xué)， 山東 青島 266100； 2. 中國科學(xué)院海洋研究所， 山東 青島， 266071）

滸苔（Ulva prolifera）是我國黃海海域綠潮暴發(fā)的主要成因種， 其孢子囊的形成和孢子的釋放是滸苔大量、快速增殖的基礎(chǔ)。本文以滸苔為研究材料， 比較分析了還原劑（DTT）和氧化劑（H2O2）對直徑為1 mm的圓形藻片從營養(yǎng)細(xì)胞形成孢子囊過程的影響。研究結(jié)果表明， DTT對滸苔孢子囊的形成具有明顯的抑制作用， 用H2O2處理的滸苔藻片與對照組相比沒有顯著性的差異， 因此滸苔細(xì)胞處于還原狀態(tài)時不利于孢子囊的形成。研究結(jié)果為探究滸苔孢子形成的調(diào)控機制提供了科學(xué)依據(jù)。

滸苔； 孢子囊； DTT； H2O2

［Foundation： Strategic Leading Science and Technology Projects of China. Academy of Sciences（XDA11020404）； National Natural Science Foundation of China （41176137）］

自2007年至今， 由滸苔引發(fā)的綠潮在我國黃海海域連續(xù)多年周期性爆發(fā)， 造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，惡化了海洋環(huán)境和旅游景觀， 引起了社會的廣泛關(guān)注。2008年在青島近海海域形成的大面積漂浮滸苔嚴(yán)重影響了青島奧運會帆船、帆板比賽的順利進(jìn)行。據(jù)報道， 2008年綠潮爆發(fā)時其生物量超過1000萬t， 在青島至少打撈了150萬t的滸苔藻體［1-2］。為此， 當(dāng)?shù)卣馁M了大量的人力、物力和財力對其進(jìn)行清除。在2007年以前， 青島近海乃至國內(nèi)其他海域很少發(fā)生綠潮現(xiàn)象， 因此相關(guān)研究報道較少。盡管近年來政府和研究者對綠潮高度關(guān)注， 但主要集中在綠潮原因種滸苔的溯源研究、生物活性物質(zhì)分析上［3-4］， 對滸苔的生物學(xué)特性， 尤其是孢子囊形成過程的研究相對較少。

滸苔的繁殖方式主要分為3種類型： （1）單性生殖，即雌雄配子體釋放的配子附著后， 分別發(fā)育成新的配子體， 無需相互結(jié)合形成合子， 甚至有的配子不放散出來原位生長發(fā)育； （2）有性生殖， 即放散的雌雄配子結(jié)合形成合子， 合子附著后發(fā)育成孢子體， 成熟后釋放的孢子再發(fā)育成配子體， 孢子體世代與配子體世代在形態(tài)上無顯著差異， 其生活史為同型世代交替； （3）無性生殖， 即孢子體釋放的孢子附著后直接進(jìn)行生長發(fā)育［5］。當(dāng)綠潮爆發(fā)時， 滸苔的主要繁殖方式為無性生殖， 即營養(yǎng)細(xì)胞首先形成孢子囊， 然后釋放孢子， 進(jìn)而發(fā)育形成新的藻體。因此， 研究滸苔的增殖過程應(yīng)聚焦在孢子囊的形成過程及其孢子的釋放和萌發(fā)。

據(jù)報道， 細(xì)胞光合電子傳遞鏈的氧化還原狀態(tài)影響孢子的形成和發(fā)育過程， 如藍(lán)藻藻殖段的形成受光合電子傳遞鏈上質(zhì)體醌氧化還原狀態(tài)的調(diào)控［6］，質(zhì)體醌的氧化還原狀態(tài)與細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)。在高等植物中， 細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)影響其生長發(fā)育過程［7］。滸苔是孢子植物， 其營養(yǎng)細(xì)胞極易形成孢子囊， 那么滸苔細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)是否會調(diào)控其孢子囊的形成過程？

為此， 本文以黃海綠潮主要成因種滸苔為材料，使用還原劑和氧化劑改變細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)， 觀察其對滸苔孢子囊形成的影響， 研究結(jié)果為探究滸苔孢子囊形成的調(diào)控機制提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料的采集與培養(yǎng)

滸苔藻體采集于青島市沿岸潮間帶（36°03′14″N，120°22′17″E）。采集后快速轉(zhuǎn)入實驗室培養(yǎng)。藻體用滅菌海水反復(fù)清洗以去除雜質(zhì)、小的浮游動物以及其他雜藻， 然后培養(yǎng)在滅菌海水中。

1.2 實驗材料的處理

選擇生理狀態(tài)健康、藻體生長發(fā)育基本同步的滸苔作為實驗材料。用打孔器將藻體打成直徑為1 mm的圓形藻片， 在滅菌海水中進(jìn)行培養(yǎng)。前期實驗發(fā)現(xiàn)1 mm藻片在光照強度為40 μmol /（m2·s）（L： D=12：12）， 溫度為20℃的條件下培養(yǎng)60 h后營養(yǎng)細(xì)胞即形成孢子囊并釋放孢子， 且同步性良好， 故選取此培養(yǎng)條件進(jìn)行本實驗。

1.3 顯微鏡觀察

藻片培養(yǎng)期間在顯微鏡（Leica DM 2500， 德國）下觀察其孢子囊形成情況， 并依據(jù)藻片內(nèi)有無孢子囊形成為標(biāo)準(zhǔn)， 計算孢子囊形成率。

1.4 還原劑對滸苔孢子囊形成的影響

選用常見的強還原劑二硫蘇糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）作為還原劑， 使細(xì)胞處于還原狀態(tài)。1 mm圓形藻片用正常滅菌海水培養(yǎng)36 h后， 在培養(yǎng)基中添加DTT至終濃度為2 mmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行顯微觀察， 并計算形成孢子囊藻片的比例。

另外， 藻片用DTT處理24 h后， 用滅菌海水反復(fù)沖洗去除DTT， 然后在正常的海水中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后再次觀察其孢子囊形成狀況， 計算形成孢子囊藻片的比例， 并與以上結(jié)果進(jìn)行比對分析。

1.5 氧化劑對滸苔孢子囊形成的影響

以合適濃度的過氧化氫（Hydrogen Peroxide，H2O2）作為氧化劑， 使細(xì)胞處于氧化狀態(tài)。1 mm圓形藻片用正常滅菌海水培養(yǎng)36 h后， 在培養(yǎng)基中添加H2O2至終濃度為0.2 mmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后對藻片進(jìn)行顯微觀察， 并計算形成孢子囊藻片的比率。

2 結(jié)果

2.1 正常培養(yǎng)藻片的孢子囊形成與孢子釋放情況

藻片在培養(yǎng)起始時（0 h）全部為營養(yǎng)細(xì)胞（圖1A），培養(yǎng)48 h后， 藻片依然為營養(yǎng)細(xì)胞， 與起始時相同，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本沒有發(fā)生顯著變化（圖1B）。繼續(xù)培養(yǎng)12 h（總培養(yǎng)時間60 h）， 期間大部分圓形藻片開始形成孢子囊， 部分孢子囊開始釋放孢子（圖1C）。培養(yǎng)60 h后， 形成孢子囊的藻片比率約為84%（表1）。

圖1 正常培養(yǎng)條件下不同時間段滸苔藻片孢子囊的形成情況Fig. 1 The formation of Ulva prolifera sporangia after various lengths of time under normal culture conditions

表1 不同處理條件下滸苔藻片形成孢子囊的藻片比率Tab. 1 The percentage of sporangia that formed on Ulva prolifera disks under different treatments

2.2 DTT對滸苔孢子囊形成的影響

正常培養(yǎng)36 h后的藻片置于終濃度為2 mmol/L DTT的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)， 12 h后（總培養(yǎng)時間為48 h）進(jìn)行顯微觀察。從圖2A可以看出， 藻片與正常條件下培養(yǎng)的藻片無顯著差別。在2 mmol/L DTT的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后（總培養(yǎng)時間為60 h）， 大部分藻片仍然處于營養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)， 很少有藻片形成孢子囊（圖2B）， 形成孢子囊的藻片比率僅約為11.3%（表1）。

將在2 mmol/L DTT的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后的藻片挑選出來， 去除DTT后繼續(xù)培養(yǎng)， 發(fā)現(xiàn)在去除DTT培養(yǎng)48 h（總培養(yǎng)時間為108 h）后大部分藻片又形成了孢子囊， 形成孢子囊的藻片比率約為80.5%。

2.3 H2O2對滸苔孢子囊形成的影響

選取正常培養(yǎng)36 h后的藻片添加終濃度為0.2 mmol/L的H2O2， 繼續(xù)培養(yǎng)12 h后進(jìn)行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)藻片細(xì)胞與同期正常培養(yǎng)的圓形藻片無顯著差別（圖3A）。再繼續(xù)培養(yǎng)12 h（總培養(yǎng)時間為60 h）后，同正常培養(yǎng)組類似， 表現(xiàn)為大部分藻片形成孢子囊并伴隨孢子釋放（圖3B）， 形成孢子囊的藻片比率約為78.9%（表1）。

圖2 在培養(yǎng)液中添加終濃度為2 mmol/L DTT時， 不同時間段滸苔藻片孢子囊的形成情況Fig. 2 The formation of Ulva prolifera sporangia following various lengths of exposure to dithiothreitol （DTT）

圖3 在培養(yǎng)液中添加終濃度為0.2 mmol/L H2O2時， 不同時間段滸苔藻片孢子囊的形成情況Fig. 3 The formation of Ulva prolifera sporangia following various lengths of exposure to H2O2

3 討論

多種因素可以促進(jìn)滸苔孢子囊的形成和孢子的釋放。Wang等［8］研究發(fā)現(xiàn)高鹽和高光等脅迫因子可以促進(jìn)滸苔孢子囊的形成。Gao等［9］將滸苔藻體分成不同孔徑大小的圓形藻片， 觀察其孢子囊的形成和孢子的放散情況， 發(fā)現(xiàn)直徑小于1 mm的藻片最適合于孢子囊的形成， 釋放的孢子可正常發(fā)育成新的藻體。在自然條件下， 絲狀的滸苔藻體可能由海浪沖擊和螺旋槳等機械作用產(chǎn)生不同大小的碎片， 動物濾食也會產(chǎn)生碎片， 尤其食藻動物排出的糞便中含有大量的未完全消化的藻片［10］。這些藻片在合適的條件下都會形成孢子（配子）囊。正因如此， 作者選擇了1 mm的藻片作為實驗材料， 研究孢子囊的形成和孢子的釋放過程。

通過對比分析含有DTT的培養(yǎng)液中的藻片和不含有DTT的正常培養(yǎng)液中的藻片， 發(fā)現(xiàn)DTT可以明顯抑制藻片孢子囊的形成。DTT可以使細(xì)胞處于還原狀態(tài)， 我們推測光合電子傳遞鏈上的質(zhì)體醌也因此處于還原狀態(tài)， 由此影響了光合電子的傳遞， 進(jìn)而影響了孢子囊的形成； 當(dāng)去除DTT時， 圓形藻片可以繼續(xù)形成孢子囊， 表明這種抑制作用是暫時性的。以上結(jié)果與以藍(lán)藻作為材料的結(jié)果基本一致［6］。

含有H2O2的培養(yǎng)液中的藻片與不含有H2O2的正常培養(yǎng)液中的藻片進(jìn)行比較分析， 發(fā)現(xiàn)兩者均可形成孢子囊并伴隨著孢子的釋放， 沒有顯著性差異。究其原因， 作者認(rèn)為與完整藻體相比， 直徑為1 mm的藻片由于機械損傷也是處于逆境狀態(tài)。一般認(rèn)為，處于逆境狀態(tài)的組織可以產(chǎn)生活性氧［11-13］， 營養(yǎng)細(xì)胞因此處于氧化狀態(tài)， 所以極易形成孢子囊。與添加有DTT的培養(yǎng)液中的藻片相比， 培養(yǎng)在含有H2O2的藻片極易形成孢子囊， 可能與細(xì)胞的氧化狀態(tài)有關(guān)。

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（本文編輯： 張培新）

The effect of cellular redox state on the formation of Ulva prolifera sporangia

WANG Jing1， NIU Cong-cong1， WANG Hui2， HUAN Li2
（1. Qingdao No.58 High School Shandong Province， Qingdao 266100， China； 2. Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences， Qingdao 266071， China）

Oct.， 10， 2015

Ulva prolifera； sporangia； DTT； H2O2

Outbreaks of Ulva prolifera cause green tides in the Yellow Sea of China. The rapid mass reproduction that is associated with these outbreaks is dependent on the formation of sporangia and the release of spores. In this study， the effect of oxidizing （H2O2） and reducing （dithiothreitol； DTT） agents on sporulation was investigated using 1-mm-diameter disks of U. prolifera. The results suggested that the application of DTT significantly inhibits the sporulation of this species， while there was no significant difference between the H2O2treatment and the control. Therefore， the creation of a reduced environment inhibits sporulation from vegetative cells. This information will be useful for further research into the regulation of sporulation in U. prolifera.

Q418

A

1000-3096（2016）01-0064-04

10.11759/hykx20151227002

2015-10-10；

2015-11-20

中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項（XDA11020404）； 國家自然科學(xué)基金面上項目（41176137）

王菁（1997-）， 女， 山東青島人， E-mail： jzgily@126.com；郇麗， 通信作者， 電話： 0532-82898575， E-mail： huanli2014@163.com