王新鳳 馬傳江 曹廣尚

摘要：目的 建立超高效液相色譜法（UPLC）同時(shí)測(cè)定白花蛇舌草及其混淆品中胞苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷5種抗腫瘤核苷類成分的方法，并比較其含量差異。方法 采用UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 ?m）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫，檢測(cè)波長254 nm，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃。結(jié)果 5種核苷類成分線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均符合方法學(xué)相關(guān)要求，加樣回收率為98.7%～101.5%。應(yīng)用所建方法測(cè)定了不同產(chǎn)地白花蛇舌草和其常見混淆品中5種核苷類成分的含量。結(jié)論 本研究所建立的方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、可靠，適用于白花蛇舌草及其混淆品中核苷類成分的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：白花蛇舌草；含量測(cè)定；核苷；超高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.023

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）07-0092-03

Content Determination of Five Nucleosides in Hedyotis Diffusa and Its Adulterants by UPLC WANG Xin-feng， MA Chuan-jiang， CAO Guang-shang （The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250011， China）

Abstract： Objective To explore an UPLC method for simultaneous content determination of the five nucleosides （cytidine， uridine， adenine， thymidine and adenosine） in Hedyotis diffusa and its adulterants； To compare the content differences. Methods The analysis was performed on a BEH C18 column （2.1 mm×50 mm， 1.7 ?m） by UPLC eluted with acetonitrile and water in gradient mode. The flow rate was 0.5 mL/min； the detection wavelength was set at 254 nm； the column temperature was set at 30 ℃. Results Five nucleosides have good linear relationship， precision， stability， and repeatability according to the requirements of the methodology determination. The recoveries were among 98.7%–101.5%. Five nucleosides in Hedyotis diffusa and its adulterants from different areas were determined by the UPLC method. Conclusion The method is certified to be simple， rapid， accurate and reliable， which can be used for the determination of nucleosides in Hedyotis diffusa and its adulterants.

Key words： Hedyotis diffusa； content determination； nucleosides； UPLC

白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa（Wind.）Roxb.的干燥全草，具有清熱解毒、活血化瘀、利濕通淋的功效[1]，臨床常用于抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗炎等[2]。白花蛇舌草臨床應(yīng)用廣泛，但多數(shù)地區(qū)使用的白花蛇舌草實(shí)為同科同屬植物傘房花耳草Hedyotis corymbosa（L.）Lam.（又名水線草），或兩者混合使用。核苷類成分是生物細(xì)胞維持生命活動(dòng)的基本組成元素，參與DNA代謝過程，通過激活人體中的嘌呤受體發(fā)揮多種生理作用，其質(zhì)量控制方法也多有報(bào)道[3-5]。本課題組前期研究表明其所含核苷具有良好的抗腫瘤活性[6]，但目前尚未見

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81274052）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2015HL116、ZR2011HL043）

通訊作者：曹廣尚，E-mail：cgs198041@163.com

對(duì)本品中核苷類成分進(jìn)行含量控制的報(bào)道。本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）對(duì)白花蛇舌草及其混淆品中胞苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷5種活性核苷類成分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定并比較其含量差異，為臨床合理使用白花蛇舌草提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters ACQUITY UPLC型超高效液相色譜儀（美國Waters公司，光電二極管陣列檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器），AE200s電子分析電平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），KQ5200DA超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

尿苷（批號(hào)110887-200001）、腺嘌呤（批號(hào)110886-200001）、腺苷（批號(hào)110879-200202）均購自中國食品藥品檢定研究院，胞苷（批號(hào)101056874）購于 Sigma公司，胸苷（批號(hào)T55590BGF0）購于天津希恩思生化科技有限公司。白花蛇舌草（產(chǎn)地分別為江蘇、山東、廣東、福建、云南、廣西、安徽和湖北）、傘房花耳草（產(chǎn)地分別為江蘇、河南、廣東、福建、云南、江西、廣西、安徽）經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院馬傳江副主任藥師鑒定，分別為茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa（Wind.）Roxb.的干燥全草及茜草科植物傘房花耳草Hedyotis corymbosa（L.）Lam.的干燥全草。乙腈（色譜純，美國Fisher公司），甲醇（分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 ?m），流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～5 min，0%～5%A；5～10 min，5%～10%A；10～20 min，10%A；20～25 min，10%～0%A），流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長254 nm，進(jìn)樣量10 ?L，柱溫30 ℃。色譜圖見圖1。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取胞苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷對(duì)照品適量，分別用20%甲醇配制成濃度為0.675、0.728、0.693、0.536、0.129 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取上述胞苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷儲(chǔ)備液適量，用20%甲醇配制成濃度分別為 67.50、72.80、69.30、53.60、12.90 ?g/mL混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取白花蛇舌草藥材粉末（過40目篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液20 mL，用氨水調(diào)pH至10.0，用水飽和正丁醇振搖提取5次，每次20 mL，合并正丁醇，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇定容至1 mL量瓶中，搖勻，微孔濾膜（0.45 ?m）過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取混合對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 mL，置10 mL量瓶中，加20%甲醇定容至刻度，搖勻，分別取10 ?L 進(jìn)樣，在上述色譜條件下進(jìn)行分析。以對(duì)照品溶液質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表 1。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取混合對(duì)照品溶液2.5 mL，置 5 mL 量瓶中，加20%甲醇定容至刻度，搖勻，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果胞苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷峰面積RSD分別為 1.4%、1.5%、0.9%、1.1%、1.7%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，胞苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷含量的RSD分別為2.8%、1.5%、1.8%、2.4%、2.7%，表明供試品溶液各成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱定同一樣品 6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，胞苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷含量的 RSD分別為1.9%、1.8%、2.2%、1.9%、1.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批次白花蛇舌草藥材6份，各約0.5 g，分別精密加入一定量對(duì)照品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。在上述色譜條件下分析測(cè)定，胞苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷和腺苷含量的平均回收率為99.42%～100.48%，RSD為0.72%～1.09%，見表2。

2.9 樣品含量測(cè)定

取10個(gè)不同產(chǎn)地白花蛇舌草藥材及其混淆品傘房花耳草，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下分析測(cè)定，每批樣品測(cè)定3份，計(jì)算平均值，結(jié)果見表3。

3 討論

現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》及有關(guān)地方標(biāo)準(zhǔn)目前尚未對(duì)白花蛇舌草進(jìn)行指標(biāo)成分含量控制。本品野生和栽培產(chǎn)量有限而臨床需求量大，導(dǎo)致市場(chǎng)上以次充好、以假亂真，嚴(yán)重影響臨床療效。其中以同科同屬傘房花耳草為其主要混淆品，加之二者所含部分成分相近，臨床上常以之代替或摻雜使用。近年來，隨著對(duì)白花蛇舌草的關(guān)注，對(duì)二者的研究較多，但多基于性狀鑒別或黃酮、三萜等單一成分比較，相關(guān)研究不夠深入。本研究建立了5種核苷類成分的含量測(cè)定方法，并與其混淆品進(jìn)行初步比較，結(jié)果表明不同產(chǎn)地白花蛇舌草中5種核苷類成分存在差異，可知地域環(huán)境等對(duì)其成分影響較大，正品與其混淆品中5種成分含量也存在差異，這可能是二者在功效上存在差異的原因之一。

本試驗(yàn)分別對(duì)甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行考察，結(jié)果5種核核苷類成分在乙腈-水梯度洗脫系統(tǒng)的分離效果更好，且采用UPLC較HPLC測(cè)定快速、結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好，是一種測(cè)定白花蛇舌草中核苷類成分的可靠方法。核苷類成分顯弱堿性，極性大，較難分離。供試品溶液制備中將水提取液調(diào)至pH值為10.0，核苷類呈分子態(tài)，再利用水飽和正丁醇充分萃取，即可將核苷類成分與其他成分分離，達(dá)到較好的提取除雜效果。

本方法簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠，以此為基礎(chǔ)繼續(xù)開展基于多種類指標(biāo)成分及指紋圖譜的質(zhì)量控制，可對(duì)白花蛇舌草及其混淆品從成分、藥效等多角度鑒別。

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（收稿日期：2015-10-16）

（修回日期：2015-12-25；編輯：陳靜）