李巧芬，常 柏，李春深（.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 30093；.天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院，天津 300070）

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生肌象皮膏對(duì)2型糖尿病大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織的Th1/Th2淋巴細(xì)胞平衡的影響*

李巧芬1，常 柏2，李春深1
（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院，天津 300070）

摘要：［目的］探討生肌象皮膏對(duì)糖尿病大鼠潰瘍組織Th1/ Th2淋巴細(xì)胞平衡的影響。［方法］將Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，1組為正常對(duì)照組，其余3組采用鏈脲佐菌素（STZ）尾靜脈注射制備糖尿病模型，4組動(dòng)物均于背部進(jìn)行打孔處理，造成正常對(duì)照大鼠潰瘍模型與糖尿病潰瘍模型。糖尿病潰瘍大鼠按照血糖和體質(zhì)量分層隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組、凡士林組與生肌象皮膏組。觀察創(chuàng)面組織白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-4、IL-10和干擾素-γ（IFN-γ）含量的變化。［結(jié)果］與正常對(duì)照組比較，糖尿病對(duì)照組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中IL-2及IFN-γ的表達(dá)于實(shí)驗(yàn)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均升高IL-2 及IFN-γ的表達(dá)于實(shí)驗(yàn)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均升高（P＜0.05），而IL-4及IL-10的含量于實(shí)驗(yàn)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均降低（P＜0.05）；與糖尿病對(duì)照組比較，生肌象皮膏組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中IL-2及IFN-γ的表達(dá)于實(shí)驗(yàn)3、7、14、21、30 d均明顯降低，而IL-4及IL-10的表達(dá)于實(shí)驗(yàn)3、7、14和21天增加（均于實(shí)驗(yàn)7 d達(dá)到高峰），P＜0.05。［結(jié)論］生肌象皮膏促進(jìn)糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面的愈合與其調(diào)節(jié)潰瘍?nèi)庋拷M織的Th1/Th2淋巴細(xì)胞的平衡有密切聯(lián)系。

關(guān)鍵詞：生肌象皮膏；糖尿病潰瘍；免疫-炎癥反應(yīng)；IL-2；IL-4；IL-10；IFN-γ

糖尿病潰瘍是導(dǎo)致糖尿病患者截肢致殘的主要原因。預(yù)計(jì)到2025年全球糖尿病患者可能會(huì)達(dá)到2.5億人以上，其中大約有15%將發(fā)生糖尿病性潰瘍或壞疽［1］。中醫(yī)藥治療糖尿病性潰瘍優(yōu)勢(shì)獨(dú)特，生肌象皮膏是中醫(yī)外用藥，具有生肌長(zhǎng)皮、活血養(yǎng)血之功效。筆者應(yīng)用生肌象皮膏在臨床上治療糖尿病潰瘍?nèi)〉昧己眯Ч?-3］，并對(duì)生肌象皮膏促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合的機(jī)制進(jìn)行探討［4-5］。依據(jù)分泌的細(xì)胞因子不同，Th細(xì)胞可分成Th1［分泌白細(xì)胞介素（IL）-2和干擾素-γ（IFN-γ）］與Th2（主要分泌IL-4和IL-10）的兩類亞群。Th1類細(xì)胞主要參與細(xì)胞免疫或遲發(fā)性超敏反應(yīng)，而Th2類細(xì)胞則主要參與體液免疫反應(yīng)。Th1和Th2細(xì)胞兩個(gè)亞群存在細(xì)胞免疫與體液免疫反應(yīng)的交互抑制現(xiàn)象，進(jìn)而影響炎癥-免疫反應(yīng)［6］。本文從Th1/Th2淋巴細(xì)胞平衡改變的角度探討生肌象皮膏對(duì)炎癥-免疫反應(yīng)的影響及其促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合的機(jī)制。

1 材料

生肌象皮膏主要成分為象皮粉，而藥物的來源受到限制（大象屬于二級(jí)保護(hù)動(dòng)物），故天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室應(yīng)用驢皮代替象皮制備生肌象皮膏；凡士林（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供）；鏈脲佐菌素（STZ，sigma公司，批號(hào)：S0130）；Universal 16R低溫高速離心機(jī)（Beckman公司）；高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；血糖測(cè)定試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 大鼠糖尿病潰瘍模型建立與分組 雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK津2005-001。隨機(jī)選取其中15只大鼠，作為正常對(duì)照組，以普通飼料飼養(yǎng)，于實(shí)驗(yàn)第12周時(shí)在無菌條件下用特制打孔器對(duì)所有大鼠在背部打孔，建立正常對(duì)照組潰瘍創(chuàng)面模型；其余實(shí)驗(yàn)大鼠以高脂高熱卡飼料喂養(yǎng)，于實(shí)驗(yàn)第12周采用尾靜脈注射STZ的方法建立糖尿病大鼠模型，72 h后檢測(cè)隨機(jī)血糖超過16.7 mmol/L為糖尿病造模成功，于無菌條件下用特制打孔器對(duì)糖尿病大鼠在背部打孔，建立糖尿病潰瘍創(chuàng)面模型，然后按照血糖和體質(zhì)量隨機(jī)將其分為糖尿病對(duì)照組、凡士林組和生肌象皮膏組。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥 正常對(duì)照組和糖尿病對(duì)照組大鼠予以潰瘍創(chuàng)面嚴(yán)格外科無菌換藥，并配以生理鹽水紗布外敷。高溫高壓分別制成無菌生肌象皮膏紗條與凡士林紗條，分別完全覆蓋于生肌象皮膏組和凡士林組大鼠的潰瘍創(chuàng)面，外用無菌紗布包扎固定。各組大鼠均每日換藥1次。

2.3 動(dòng)物潰瘍組織標(biāo)本獲取及指標(biāo)檢測(cè) 各組實(shí)驗(yàn)大鼠于用藥的第1天、第3天、第7天、第14天、第21天及第30天（6個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)）進(jìn)行創(chuàng)面組織照相，對(duì)應(yīng)前述6個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)依次取創(chuàng)面潰瘍組織標(biāo)本。分別將各組動(dòng)物潰瘍組織標(biāo)本剪碎，加入生理鹽水，以勻漿器制成20%勻漿，以5 000 r/min速度進(jìn)行離心，其上清液置于-20℃冰箱凍存，作為待檢測(cè)標(biāo)本。檢測(cè)程序嚴(yán)格按試劑盒使用說明進(jìn)行，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法定量分析檢測(cè)潰瘍組織中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量。用大鼠待檢測(cè)的蛋白單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的待測(cè)蛋白與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠待測(cè)蛋白抗體，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入酶底物，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，顏色的深淺和樣品中的檢測(cè)指標(biāo)呈正相關(guān)，在490nm處取A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)本A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到潰瘍組織標(biāo)本中IL-2、IL-4、IL-10 和IFN-γ的濃度數(shù)值。

2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 采用SPSS18.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩比較時(shí)，組間方差齊性的采用LSD法，方差不齊的采用DUNNET’S T3法，P＜0.05為具有顯著性差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中Th1淋巴細(xì)胞分泌IL-2 和IFN-γ的改變 與正常對(duì)照組比較，糖尿病對(duì)照組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中IL-2及IFN-γ的表達(dá)于實(shí)驗(yàn)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均升高（P＜0.05）；與糖尿病對(duì)照組比較，生肌象皮膏組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中IL-2及IFN-γ的表達(dá)于實(shí)驗(yàn)3、7、14、21、30 d均明顯降低，P＜0.05。見表1、表2。

3.2 大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織Th2淋巴細(xì)胞分泌IL-4和IL-10的變化 與正常對(duì)照組比較，糖尿病對(duì)照組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中IL-4及IL-10的含量于實(shí)驗(yàn)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均降低（P＜0.05）；與糖尿病對(duì)照組比較，生肌象皮膏組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中IL-4及IL-10的表達(dá)于實(shí)驗(yàn)3、7、14、21 d增加（均于實(shí)驗(yàn)7 d達(dá)到高峰），P＜0.05。見表3、表4。

表1 各組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中IL-2含量的比較（±s）Tab.1 Comparison of IL-2 contents in ulcer granulation tissue in the rats of each group （±s）ng/L

表1 各組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中IL-2含量的比較（±s）Tab.1 Comparison of IL-2 contents in ulcer granulation tissue in the rats of each group （±s）ng/L

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與糖尿病組比較，#P＜0.05。

1 d 3 d 48.71±5.720 50.64±6.8200 56.85±7.25* 67.18±8.24*0 55.75±7.28* 65.42±7.04*0 55.57±6.14* 57.18±6.24#組別正常對(duì)照組糖尿病對(duì)照組凡士林組生肌象皮膏組動(dòng)物數(shù)10 10 10 10 7 d 48.95±5.1500 87.20±8.47*0 72.82±8.48*0 68.76±5.14#14 d 21 d 30 d 53.84±6.1400 57.51±6.8700 67.51±7.1500 98.56±9.02*0 99.13±9.51*0 89.45±8.21*0 91.57±9.84*0 86.82±8.03*0 66.42±7.9200 73.58±6.50#67.05±7.44#63.70±7.05#

表2 各組大鼠潰瘍組織中IFN-γ水平的比較（±s）Tab.2 Comparison of the level of IFN-γ in ulcer granulation tissue in the rats of each group（±s）ng/L

表2 各組大鼠潰瘍組織中IFN-γ水平的比較（±s）Tab.2 Comparison of the level of IFN-γ in ulcer granulation tissue in the rats of each group（±s）ng/L

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與糖尿病組比較，#P＜0.05。

1 d 3 d 28.71±4.03* 35.08±8.52* 39.19±5.48* 57.37±7.67* 36.72±5.33* 53.35±6.80* 37.15±5.25* 45.82±6.81#組別正常對(duì)照組糖尿病對(duì)照組凡士林組生肌象皮膏組動(dòng)物數(shù)10 10 10 10 7 d 44.78±6.25* 60.43±7.22** 58.21±10.49** 53.04±5.72#14 d 21 d 30 d 48.10±6.13** 46.27±7.53** 42.17±7.24** 78.43±8.94** 67.81±9.47** 66.94±7.57** 71.75±8.03** 65.49±8.87** 63.17±8.27** 57.48±7.53#60.87±8.74#59.26±6.29#

表3 各組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中IL-4含量的比較（±s）Tab.3 Comparison of IL-4 concents in ulcer granulation tissue in the rats of each group（±s）ng/L

表3 各組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中IL-4含量的比較（±s）Tab.3 Comparison of IL-4 concents in ulcer granulation tissue in the rats of each group（±s）ng/L

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與糖尿病組比較，#P＜0.05。

1 d 3 d 97.40±9.61 99.72±9.82 68.01±9.37* 67.34±9.41* 69.47±9.50* 68.54±9.84* 67.43±9.48* 76.79±9.83#組別正常對(duì)照組糖尿病對(duì)照組凡士林組生肌象皮膏組動(dòng)物數(shù)10 10 10 10 7 d 98.48±10.12* 63.62±9.43** 68.46±9.71** 82.68±9.04#14 d 21 d 30 d 89.38±9.73** 86.82±10.67* 79.35±11.80 69.62±8.07** 67.56±8.29** 67.71±8.85* 62.24±7.57** 60.35±9.84** 68.29±8.91* 78.57±9.29#66.57±9.72** 64.64±9.16*

表4 各組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中IL-10含量的比較（±s）Tab.4 Comparison of IL-10 contents in ulcer granulation tissue in the rats of each group（±s）ng/L

表4 各組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中IL-10含量的比較（±s）Tab.4 Comparison of IL-10 contents in ulcer granulation tissue in the rats of each group（±s）ng/L

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與糖尿病組比較，#P＜0.05。

組別正常對(duì)照組糖尿病對(duì)照組凡士林組生肌象皮膏組動(dòng)物數(shù)10 10 10 10 1 d 3 d 97.24±9.71* 95.85±10.05* 56.81±7.06* 57.51±9.38** 57.15±6.86* 59.46±9.40** 56.80±6.84* 75.48±8.151#7 d 91.08±9.85** 52.45±8.48** 59.14±8.23** 89.12±9.44#14 d 21 d 30 d 89.31±10.06* 77.15±8.25** 65.34±7.09** 41.54±5.81** 38.75±4.64** 37.41±4.05** 53.91±7.30** 50.10±7.04** 41.46±6.81** 82.41±7.72#75.44±8.50#50.16±8.35#

4 討論

生肌象皮膏由象皮、當(dāng)歸、血余炭、龜版、生地等組成，是生肌長(zhǎng)皮的代表方劑。方中以象皮為主藥，配以滋陰養(yǎng)血及活血化瘀收斂之品，共奏生肌長(zhǎng)皮、活血養(yǎng)血之功效［7-8］。經(jīng)臨床應(yīng)用與研究證實(shí)，生肌象皮膏具有消炎抑菌、促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)的作用，可改善微循環(huán)，提高局部組織的抗感染能力，促進(jìn)殘存上皮細(xì)胞和創(chuàng)面周圍上皮細(xì)胞的良好生長(zhǎng)，加快創(chuàng)面組織愈合［9-10］。

T細(xì)胞亞群在創(chuàng)傷后會(huì)發(fā)生明顯變化，在創(chuàng)傷早期Ts細(xì)胞數(shù)量會(huì)明顯增多，但Th細(xì)胞的數(shù)量無明顯變化，從而Ts細(xì)胞總數(shù)比例較大，這又會(huì)直接影響其他T細(xì)胞亞群以及巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致廣泛的免疫抑制［11］。Th1/Th2在創(chuàng)傷或燒傷后的平衡被打破使Th2出現(xiàn)誘導(dǎo)反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)的克隆轉(zhuǎn)移，成為造成細(xì)胞免疫功能降低的重要原因。免疫活化的淋巴細(xì)胞分別產(chǎn)生淋巴因子和抗體，發(fā)揮其殺傷病原微生物的作用［12-13］。

Th細(xì)胞依據(jù)其分泌的細(xì)胞因子不同而劃分成Th1/Th2兩亞群，期中Th1類細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），主要參與細(xì)胞免疫或遲發(fā)性超敏反應(yīng)；Th2類細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-10，主要參與體液免疫反應(yīng)［14］。Th1和Th2細(xì)胞兩個(gè)亞群存在細(xì)胞免疫與體液免疫反應(yīng)的交互抑制現(xiàn)象，Thl細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2、IFN-γ和TNF-α可增強(qiáng)單核/巨噬細(xì)胞活化介導(dǎo)的抗感染機(jī)制，促進(jìn)細(xì)胞免疫，使巨噬細(xì)胞分泌的IL-12增加，誘導(dǎo)原始CD4+T細(xì)胞向Thl的細(xì)胞分化［15］。這種存在于Th1細(xì)胞與單核/巨噬細(xì)胞的正反饋通路使得先天固有性免疫與后天適應(yīng)性免疫應(yīng)答的建立了密切聯(lián)系［16］。上皮屏障功能障礙造成上皮細(xì)胞損傷而引起組織結(jié)構(gòu)重塑中，以為Th2特征的炎癥反應(yīng)是一個(gè)不斷變化的，從而防止進(jìn)一步的損傷發(fā)生［17］。

Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4和IL-10通過刺激肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的生長(zhǎng)和活化、刺激B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞以及Ig類別的轉(zhuǎn)換等促進(jìn)體液免疫，這些細(xì)胞因子可抑制巨噬細(xì)胞激活、T細(xì)胞增殖以及促炎因子產(chǎn)生［18］。Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-10成為重要的抗炎細(xì)胞因子［19］。由此可見，Thl和Th2細(xì)胞之間存在相互抑制，其平衡被打破則可導(dǎo)致免疫性疾病的產(chǎn)生［20］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與糖尿病對(duì)照組比較，生肌象皮膏組大鼠潰瘍?nèi)庋拷M織中IL-2及IFN-γ的表達(dá)于實(shí)驗(yàn)3、7、14、21、30 d均明顯降低，同時(shí)IL-4 及IL-10的表達(dá)于實(shí)驗(yàn)3、7、14、21 d增加，均于實(shí)驗(yàn)7 d達(dá)到高峰。

5 總結(jié)

目前，治療糖尿病潰瘍的方法較多，各有優(yōu)勢(shì)又都存在不足，而導(dǎo)致糖尿病潰瘍的因素是多方面的，中醫(yī)藥學(xué)治療糖尿病潰瘍具有一定的優(yōu)勢(shì)，但在某些機(jī)制方面還不是很清楚。生肌象皮膏作用于糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面，通過抑制促炎因子與增加抗炎因子的含量，維持Th1/Th2淋巴細(xì)胞的功能平衡，進(jìn)一步影響炎癥-免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)糖尿病潰瘍傷口愈合的過程。這種作用是否會(huì)更為廣泛的影響潰瘍創(chuàng)面細(xì)胞因子的含量及其關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：馬 英，張震之）

Influence on the balance of Th1/Th2 lymphocyte in the ulcer healing in type 2 diabetic rats treated by the Shengji Xiangpi mastic

LI Qiao-fen1，CHANG Bai2，LI Chun-shen1
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Metabolic Diseases Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China）

Abstract:［Objective］To investigate the influence on the balance of Th1/Th2 lymphocyte in the ulcer healing in diabetic rats treated by the Shengji Xiangpi mastic（SM）.［Methods］Wistar rats were randomly divided into four groups，one group as the normal control group，the remaining three groups rats injected STZ into vena caudalis as the diabetic model. All the four group rats were punched in back，establishing the diabetic ulcer model. The three group rats of diabetic ulcers were randomly divided into diabetic control group，vaseline group and SM group by the blood glucose and body weight. The changes of IL-2、IL-4、IL-10 and IFN-γ in the wound tissue were observed.［Results］Compare with the rats in normal control group，the contents of IL-2 and IFN-γ were higher and the contents of IL-4 and IL-10 were lower at each selected time point in the rats of the diabetic control group during the experiment，and the difference was significant respectively. Compare with the rats in diabetic control group，the contens of IL-2 and IFN-γ were lower on the 3th，7th，14th，21th，30th day，while the contents of IL-4 and IL-10 on the 3th，7th，14th and 21th day were higher in the rats of SM group，and the difference was significant respectively.［Conclusion］The role of Shengji Xiangpi mastic promoting the ulcer healing in diabetic rats，was closely related to regulate the balance of Th1/Th2 lymphocyte.

Key words：Shengji Xiangpi mastic；diabetic ulcer；immune-inflammation reaction IL-2；IL-4；IL-10；IFN-γ

中圖分類號(hào)：R587.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-1519（2016）01-0031-04

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2016.01.08

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81373846）。

作者簡(jiǎn)介：李巧芬（1972-），碩士，副主任醫(yī)師，從事內(nèi)分泌疾病的臨床及實(shí)驗(yàn)研究。

通訊作者：李春深，E-mail：lichunshen@126.com。

收稿日期：（2015-09-26）