高效氯氟氰菊酯和阿維菌素對中華蜜蜂CarE和GSTs的影響

韓文素　何杏　高景林　劉俊峰　趙冬香

摘 要 羧酸酯酶（Carboxylesterase， CarE）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GSTs）是蜜蜂體內(nèi)重要的生化標(biāo)記酶。本研究探討了高效氯氟氰菊酯lambda-cyhalothrin和阿維菌素abamectin亞致死劑量對中華蜜蜂Apis cerana cerana中腸CarE和谷GSTs活性的影響。結(jié)果表明，用阿維菌素和高效氯氟氰菊酯亞致死濃度LC5飼喂中華蜜蜂，明顯誘導(dǎo)CarE活性增強(qiáng)；LC5濃度的阿維菌素誘導(dǎo)GSTs活性增強(qiáng)，而LC10～LC40的濃度抑制GSTs活性；高效氯氟氰菊酯LC5～LC40濃度對GSTs作用不明顯；用LC10濃度的阿維菌素和高效氯氟氰菊酯處理中華蜜蜂72 h，CarE活性呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢，而對GSTs作用不明顯。

關(guān)鍵詞 羧酸酯酶；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶；中華蜜蜂；高效氯氟氰菊酯；阿維菌素

中圖分類號 S482.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

近年來，全球蜜蜂數(shù)量驟減引起了社會各界的極大關(guān)注[1]，研究證實，殺蟲劑的廣泛施用是造成此現(xiàn)象的主要原因之一[2]。蜜蜂具備獨特的生物學(xué)特性，對殺蟲劑非常敏感，常被不同地理區(qū)域用作監(jiān)測殺蟲劑污染的生物指示器[3]。中華蜜蜂Apis cerana cerana，是中國特有的蜂種資源，具有嗅覺敏銳、抗寒耐熱、抗螨及采集能力強(qiáng)等特點[4]。據(jù)報道，中華蜜蜂對藥劑更加敏感，一些對意大利蜜蜂低毒的藥劑，可能會造成中華蜜蜂的大量中毒死亡[5]，因此有必要以中華蜜蜂為生物指示器，監(jiān)測環(huán)境中殺蟲劑的污染情況以及殺蟲劑對蜂群健康的影響。

生化酶是生物體內(nèi)最靈敏的生物檢測劑，監(jiān)測其活性變化可知生物體內(nèi)最早的污染物誘導(dǎo)反應(yīng)情況[6]?？捎米魃瘶?biāo)記物的酶有乙酰膽堿酯酶（AchE）、羧酸酯酶（CarE）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）[7]。CarE是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶，參與殺蟲劑的Ⅰ項解毒代謝[8]，CarE能以水解蛋白和結(jié)合蛋白2種物質(zhì)對殺蟲劑進(jìn)行解毒，其活性與昆蟲解毒能力密切相關(guān)[9]。GSTs能夠催化還原型谷胱甘肽GSH對底物進(jìn)行親核共軛代謝，在抗毒機(jī)制的第Ⅱ階段起作用，被稱為Ⅱ項代謝酶[4，10]，在昆蟲體內(nèi)降解許多外來化合物的過程中發(fā)揮解毒和抗氧化的作用[11]。因此，可通過測定CarE和GSTs活性變化，評估環(huán)境中殺蟲劑的污染狀況以及殺蟲劑對蜜蜂種群的影響。

高效氯氟氰菊酯和阿維菌素是防治害蟲的常用藥劑。高效氯氟氰菊酯屬于擬除蟲菊酯類殺蟲劑，殺蟲譜廣、高效、速效，對中華蜜蜂攝入和觸殺毒性均為高毒[12]。阿維菌素殺蟲活性強(qiáng)且殺蟲譜廣，無論單劑還是混配劑對蜜蜂攝入或觸殺的急性毒性均為高毒，甚至劇毒[13-16]。施用于田間的殺蟲劑隨著時間的推移，會逐漸降解為亞致死劑量，亞致死劑量對蜜蜂的學(xué)習(xí)、行為和生理會產(chǎn)生明顯的亞致死效應(yīng)[17]。迄今為止，亞致死劑量的高效氯氟氰菊酯和阿維菌素對中華蜜蜂解毒酶的影響尚未見報道，因此本研究在實驗室條件下測定高效氯氟氰菊酯和阿維菌素對CarE和GSTs的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)，以期為診斷殺蟲劑對蜂群健康的影響及更好地保護(hù)中華蜜蜂提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源 中華蜜蜂采集蜂，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所試驗蜂場提供（N19°32′，E109°32′）。供試蜜蜂要求同一種群、齡期相同、健康狀況良好。

1.1.2 儀器與試劑 試驗儀器：紫外可見分光光度計（SHIMADZU CORPORATION，UV-2600），數(shù)顯三用恒溫水箱（金壇市金南儀器廠，XMTD-204），漩渦混合器（Labnet，VX100），小型臺式冷凍型離心機(jī)（Eppendorf，5417R），電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，TLE204E/02），微量移液槍（SWISS，SOCOREX）及配套吸頭，溫濕度記錄儀（浙江托普儀器有限公司，TPJ-20），超純水系統(tǒng)（Cascada LS，PAL-CAXXXLSM2）。

供試藥劑及試劑：93.5%阿維菌素原藥（山東志誠化工有限公司）、97%高效氯氟氰菊酯原藥（農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所）、考馬斯亮藍(lán)G-250（Solarbio公司）、牛血清白蛋白（BSA，Solarbio公司）、十二烷基硫酸鈉（SDS，Sigma公司）、α-乙酸萘酯（α-NA，Solarbio公司）、β-乙酸萘酯（β-NA，Solarbio公司）、毒扁豆堿（上海源葉生物科技有限公司）、固藍(lán)B鹽（Solarbio公司）、α-萘酚（Macklin 公司）、β-萘酚（Macklin 公司）、谷胱甘肽（GSH，Solarbio公司）、乙二胺四乙酸（EDTA，Biotopped公司）、1，1-二氯-2，4-二硝基苯（CDNB，Sigma公司），95%乙醇（分析純，西隴化工股份有限公司）、磷酸（分析純，西隴化工股份有限公司）、磷酸氫二鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）、磷酸二氫鉀（分析純，西隴化工股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 生物處理 毒力測定：參照國家環(huán)境保護(hù)部頒布的《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》，稍加改進(jìn)。采用攝入法測定經(jīng)口毒性。用50%蔗糖水將藥劑稀釋成系列試驗濃度，裝入15 mL直口離心管中，直至將離心管中事先放入的0.2～0.25 g脫脂棉潤濕即可；通過飼喂孔放入貯蜂籠內(nèi)，讓饑餓2 h的中華蜜蜂通過孔眼取食，并且在試驗期間保持脫脂棉濕潤，用50%蔗糖溶液作為對照組。試驗共設(shè)6個處理，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)10只蜜蜂，48 h后檢查死亡蟲數(shù)。

劑量效應(yīng)：根據(jù)毒力測定結(jié)果，分別選取高效氯氟氰菊酯和阿維菌素對蜜蜂的亞致死濃度LC5、LC10、LC20、LC30、LC40，用攝入法處理中華蜜蜂，同時以無藥劑的50%蔗糖溶液作為對照組。試驗每藥劑共設(shè)6個處理，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)10只蜜蜂。取食24 h后將存活蜜蜂放入-20 ℃冰箱使其麻痹，然后取出中腸用于CarE和GSTs的活性測定。

時間效應(yīng)：根據(jù)毒力測定結(jié)果，選取亞致死濃度LC10的高效氯氟氰菊酯和阿維菌素，用攝入法處理中華蜜蜂，同時以無藥劑的50%蔗糖溶液作為對照組。處理4、8、24、48、72 h后，取存活的蜜蜂立即放入-20 ℃冰箱使其麻痹，然后取出中腸用于CarE和GSTs的活性測定。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)10只蜜蜂，每藥劑共用300只蜜蜂。

1.2.2 酶液制備 參照Badiou-Bénéteau等[7]的方法改進(jìn)。取同一處理的中華蜜蜂5頭，用鑷子夾住尾端蟄針拽出中腸，放入冰浴的玻璃勻漿器中勻漿，離心后取上清液作為測定CarE和GSTs時的酶源。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)5只蜜蜂。[測定CarE時，加入預(yù)冷的pH7.0的0.04 mol/L磷酸緩沖液冰浴并勻漿，然后在4 ℃、10 800 r/min條件下離心15 min；測定GSTs時，加入預(yù)冷的pH6.5的0.1 mol/L磷酸緩沖液（含1.0 mmol/L EDTA）冰浴并勻漿，然后在4 ℃、10 000 r/min條件下離心30 min]。

1.2.3 CarE活性測定 參照Van Aspern[18]的方法，并加以改進(jìn)。以α-乙酸萘酯（α-NA）為底物，測定時在每個試管中依次加入0.45 mL磷酸緩沖液（0.04 mol/L，pH7.0）、1.8 mL 3×10-4 mol/L的α-NA（含3×10-4 mol/L毒扁豆堿）、0.05 mL酶液；于30 ℃反應(yīng)15 min后，加入0.9 mL顯色劑（1%固藍(lán)B鹽溶液 ∶ 5% SDS溶液=2 ∶ 5，現(xiàn)配現(xiàn)用）終止反應(yīng)并顯色；靜置5～10 min后在600 nm下測定吸光值。對照管中不加酶液，于加入顯色劑之后補(bǔ)加0.05 mL酶液。每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)3次測定。以β-NA為底物的方法同上，在555 nm下測定吸光值。用α-萘酚或β-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線和酶液蛋白質(zhì)含量計算出CarE比活力，單位為nmol/（mg·min）。

1.2.4 GSTs活性測定 參照Habig等[19]的方法。反應(yīng)體系總體積為900 μL，往比色皿中依次加入30 mmol/L GSH 30 μL、0.1 mol/L pH6.5磷酸緩沖液800 μL、40 μL粗酶液、30 mmol/L CDNB 30 μL，迅速混勻后，于340 nm波長下記錄2 min內(nèi)的吸光值變化。各處理設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)平行測定3次。記錄反應(yīng)速度（OD340 nm/min），以每分鐘催化生成1 nmol產(chǎn)物為一個酶活單位。按照下述公式計算比活力：GSTs活力單位nmol/（mg·min）=（△OD340·υ）/X·L·t（min）/a·V。式中，△OD340為每分鐘光吸收的變化值（△OD340·/min），υ為酶促反應(yīng)體積（900 μL），X為產(chǎn)物的消光系數(shù)[0.009 6 L/（μmol·cm）]，L為比色杯的光程（1 cm），t為反應(yīng)時間（min），a為酶液蛋白含量（單位：），V為酶液體積（mL）。

1.2.5 蛋白質(zhì)含量的測定 參照Bradford[20]考馬斯亮藍(lán)G-250法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。毒力測定包括計算LC50、回歸方程、95%的置信限及高效氯氟氰菊酯和阿維菌素的試驗濃度值；時間效應(yīng)中，各試驗組比活力數(shù)值均進(jìn)行獨立樣本T檢驗；劑量效應(yīng)中，各試驗組比活力數(shù)值均進(jìn)行單因素方差分析（多重比較用Duncan法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效氯氟氰菊酯和阿維菌素對中華蜜蜂的急性經(jīng)口毒性

由表1結(jié)果可知，攝入法測定97%高效氯氰菊酯原藥和93.5%阿維菌素原藥對中華蜜蜂的LC50值分別為4.635和0.028 mg/L（48 h）。按照農(nóng)藥對蜜蜂急性經(jīng)口毒性標(biāo)準(zhǔn)，高效氯氟氰菊酯對中華蜜蜂的攝入毒性為高毒，阿維菌素對中華蜜蜂的攝入毒性為劇毒。

根據(jù)毒力曲線計算出高效氯氟氰菊酯對中華蜜蜂的亞致死濃度為LC5（0.768 mg/L）、LC10（1.142 mg/L）、LC20（1.847 mg/L）、LC30（2.613 mg/L）、LC40（3.514 mg/L），阿維菌素對中華蜜蜂的亞致死濃度LC5（0.005 mg/L）、LC10（0.008 mg/L）、LC20（0.012 mg/L）、LC30（0.016 mg/L）、LC40（0.022 mg/L），并分別用上述劑量處理后續(xù)試驗中的中華蜜蜂采集蜂。

2.2 高效氯氟氰菊酯和阿維菌素對中華蜜蜂CarE、GSTs的劑量效應(yīng)

如表2所示，用高效氯氟氰菊酯亞致死濃度處理中華蜜蜂后，CarE的活性變化較大且始終處于激活水平。以α-NA為底物時，CarE活性在LC5和LC30的劑量下與對照組差異不顯著；在LC10的劑量時，CarE活性顯著提高，是對照組的1.511倍；在LC20和LC40的劑量時，CarE活性與對照相比達(dá)到極顯著性差異，分別是對照組的1.745和1.805倍。以β-NA為底物時，CarE活性隨著濃度增加而增加，但當(dāng)劑量為LC5～LC30時，CarE活性與對照組差異不顯著，只有當(dāng)為劑量LC40時，CarE活性極顯著提高，是對照組的2.720倍。蜜蜂取食不同濃度的高效氯氟氰菊酯蔗糖溶液24 h后，LC10處理組中華蜜蜂體內(nèi)GSTs比活力低于對照組，LC5、LC20、LC30、LC40處理組GSTs比活力分別是對照組的1.344、1.135、2.007、2.008倍。

用阿維菌素LC5～LC40蔗糖溶液飼喂中華蜜蜂24 h后，阿維菌素明顯誘導(dǎo)CarE活性增強(qiáng)（表2）。以α-NA為底物時，LC10和LC40處理組CarE比活力與對照組之間差異極顯著（p<0.01），分別為對照的1.706和2.569倍。以β-NA為底物時，CarE比活力隨著處理濃度增加而增強(qiáng)，其中LC20處理組CarE比活力顯著高于對照，為對照的1.420倍；LC30和LC40處理組CarE比活力與對照組之間差異極顯著（p<0.01），分別為對照的1.688和2.005倍。用LC5濃度的阿維菌素飼喂蜜蜂24 h時，GSTs活性顯著提高，其酶活性為對照的1.351倍；GSTs活性在LC5以后處于受抑制狀態(tài)，酶活性為對照的0.786～0.591倍；在LC40的劑量下受到的抑制作用達(dá)到最大，其酶活性僅為對照的0.591倍。

2.3 高效氯氟氰菊酯和阿維菌素對中華蜜蜂CarE、GSTs的時間效應(yīng)

如圖1-A所示，采用LC10濃度的高效氯氟氰菊酯飼喂中華蜜蜂72 h，其體內(nèi)CarE隨時間的延長而呈現(xiàn)升高-降低的變化趨勢。以α-NA為底物時，中腸CarE活性被誘導(dǎo)，8 h后逐漸提高，24 h后增加至對照的2.462倍，隨后酶活性逐漸降低，72 h時為對照的1.546倍，與對照無顯著性差異。以β-NA為底物時，CarE的活性在72 h內(nèi)都處于激活狀態(tài)，在4、24 h酶活性分別增加至對照的2.828和2.736倍。GSTs活性變化情況與CarE剛好相反，4 h時處于激活狀態(tài)，為對照的1.154倍，隨后活性迅速降低，一直到72 h處于受抑制狀態(tài)。

阿維菌素亞致死濃度LC10對中華蜜蜂CarE和GSTs的時間效應(yīng)如圖1-B所示。以α-NA為底物時，CarE的活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。飼喂24 h后，CarE活性顯著高于對照組，為對照的1.637倍；飼喂48 h后，CarE活性逐漸被抑制；達(dá)到72 h時，CarE活性僅為對照的0.639倍。以β-NA為底物時，4～48 h CarE活性被誘導(dǎo)，48 h時其活性增至對照的2.297倍，極顯著高于對照組；隨后活性逐漸下降，72 h時僅為對照的0.690倍。GSTs活性的變化趨勢和對照基本一致，4～48 h酶活性低于對照，均處于受抑制狀態(tài)，72 h時其酶活性高于對照，為對照的1.349倍，但各時間點酶活性與對照均無顯著性差異。

3 討論與結(jié)論

高效氯氟氰菊酯和阿維菌素是當(dāng)前殺蟲劑市場上的主導(dǎo)產(chǎn)品。本研究表明，高效氯氟氰菊酯對中華蜜蜂的經(jīng)口毒性為4.635 mg/L（48 h），為高毒；阿維菌素對中華蜜蜂的經(jīng)口毒性為0.028 mg/L（48 h），為劇毒，此結(jié)果與文獻(xiàn)報道相一致[12-16]。因此，為避免蜜蜂在采集花蜜和花粉時急性中毒死亡，施用時應(yīng)避開蜜源植物花期。

化學(xué)農(nóng)藥對蜜蜂及其它非靶標(biāo)生物的安全性已成為全球普遍關(guān)注的環(huán)境污染與生物安全問題。由于蜜蜂在蜂巢周圍1.5～3 km的范圍內(nèi)密集的采集活動，能接觸到大量的污染物，常被作為可靠的環(huán)境污染生物指示器[21-22]。近年來，世界各地的蜜蜂出現(xiàn)了嚴(yán)重的種群衰退現(xiàn)象，致使各國采取積極措施監(jiān)測和診斷蜂群健康[23]。研究證實，采集蜂體內(nèi)的生化酶可作為監(jiān)測環(huán)境污染最有效的工具[7，22]。

CarE是蜜蜂重要的解毒酶，存在于頭部和中腸內(nèi)，共有八個亞家族，其中保幼激素酯酶、α和β酯酶是CarE的主要催化酶，其主要作用就是催化水解進(jìn)入體內(nèi)的外源性物質(zhì)[24-25]。據(jù)Badiou-Bénéteau等[7]報道，接觸亞致死劑量的殺蟲劑后，CarE活性改變，其每種亞型都可作為重要的生化指示物。以CarE作為生化指示物在蜜蜂對馬拉硫磷、甲基對硫磷、噻蟲嗪、氟蟲腈、溴氰菊酯、多殺菌素等的監(jiān)測中均有研究報道[7，26-27]。本研究結(jié)果表明，高效氯氟氰菊酯和阿維菌素亞致死劑量明顯誘導(dǎo)中華蜜蜂中腸內(nèi)CarE活性的提高。用LC10劑量阿維菌素和高效氯氟氰菊酯處理中華蜜蜂，72 h內(nèi)CarE的活性整體呈現(xiàn)先增強(qiáng)后降低的變化趨勢，存在一定的時間效應(yīng)。

GSTs在對內(nèi)源性和外源性毒物（藥物、殺蟲劑等）的解毒中發(fā)揮著重要作用[28]。蜜蜂的GSTs主要存在于脂肪體、中腸、馬氏管等組織中，主要通過催化親電基團(tuán)與GSH結(jié)合，產(chǎn)生水溶性強(qiáng)、無毒的代謝產(chǎn)物而排出體外[29]。除解毒作用，GSTs還具有保護(hù)細(xì)胞防御氧化損傷的作用[9]。本研究中GSTs的活性在阿維菌素LC10～LC40的劑量下處于受抑制狀態(tài)，而在高效氯氟氰菊酯LC5～LC40的劑量處于激活狀態(tài)。分別用LC10濃度阿維菌素和高效氯氟氰菊酯處理中華蜜蜂，72 h內(nèi)其GSTs的活性均處于受抑制狀態(tài)，究其原因，可能與殺蟲劑的靶標(biāo)部位以及殺蟲劑的毒性相關(guān)[30]，如啶蟲脒、吡蚜酮、啶蟲丙醚、噻蟲嗪、樂果、毒死蜱、多殺菌素提高采集蜂GSTs活性[7，11，27，31]，而呋蟲胺、氟氯苯菊酯、吡蟲啉則抑制采集蜂GSTs活性[26，32-33]。

蜜蜂接觸到亞致死劑量的殺蟲劑后，會調(diào)控體內(nèi)不同的酶，以此來對生理及行為發(fā)生改變的生理過程做出反應(yīng)，因此評估殺蟲劑對蜜蜂種群和環(huán)境健康的影響時，選擇生化指示酶是關(guān)鍵的一步。本研究表明，應(yīng)用CarE和GSTs作為生化指示酶評估高效氯氟氰菊酯和阿維菌素亞致死劑量對中華蜜蜂種群健康的影響是合理的。關(guān)于高效氯氟氰菊酯和阿維菌素誘導(dǎo)中華蜜蜂CarE和GSTs活性改變的分子機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

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