李　琦，智達夫，延　沁，劉默寧，鄭欣欣，曹貴方

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院 動物組織胚胎與發(fā)育生物學研究室，呼和浩特 010018)

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LPS通過TLR4影響綿羊輸卵管上皮細胞SBD-1的表達

李琦，智達夫，延沁，劉默寧，鄭欣欣，曹貴方*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院 動物組織胚胎與發(fā)育生物學研究室，呼和浩特 010018)

摘要：旨在研究脂多糖(LPS)對綿羊輸卵管上皮細胞β-防御素-1(SBD-1)表達的影響及其調(diào)控途徑，本研究設置不同濃度(10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、1 mg·mL-1)LPS，分別作用不同時間(0、1、3、6、12和24 h)，檢測綿羊輸卵管上皮細胞SBD-1和Toll樣受體-4 (TLR4) mRNA表達水平，通過免疫組化檢測SBD-1表達定位，并進一步通過TLR4阻斷試驗來證實TLR4介導LPS引起SBD-1表達。結果表明，SBD-1蛋白表達于輸卵管上皮細胞。LPS以濃度和時間依賴方式影響綿羊輸卵管上皮細胞中SBD-1的表達，且100 ng·mL-1LPS在作用12 h后，SBD-1的表達水平達到最高。阻斷試驗表明，TLR4介導LPS對SBD-1的表達調(diào)控。綜上表明，LPS可以影響綿羊輸卵管上皮細胞表達SBD-1，且該過程通過TLR4介導。

關鍵詞：輸卵管；脂多糖；綿羊β-防御素-1；Toll樣受體-4

綿羊輸卵管炎是一種季節(jié)性多發(fā)的生殖道炎癥，一般由外源微生物感染引起，并導致免疫系統(tǒng)紊亂。在眾多的感染源中，由細菌感染引起的輸卵管炎最為常見，但是隨著細菌對抗生素的抵抗越來越強，傳統(tǒng)的抗生素治療作用越來越小[1]。研究報道，動物體內(nèi)本身存在的防御素比抗生素具有更直接的抗感染功能[2]。研究防御素的功能及其調(diào)節(jié)機制非常重要。β-防御素是一種抗菌肽分子，是動物長期進化而來的先天性免疫屏障，廣泛表達于哺乳動物和鳥類的黏膜上皮組織，具有廣譜抗菌性、抗細胞毒性、抗病毒及調(diào)節(jié)免疫的作用[3-4]。有報道表明，輸卵管中防御素表達量較高，而且細菌感染會刺激防御素表達，并參與免疫排斥反應[5]。革蘭陰性菌引起的機體免疫反應主要是其細胞壁組成成分脂多糖(LPS)[6-8]，在體外經(jīng)LPS刺激，上皮細胞能夠分泌與炎癥相關的細胞因子，介導炎癥反應[9]。β-防御素作為先天性免疫屏障在某些物種中也被證實可被LPS上調(diào)[10-13]。LPS需要通過細胞膜表面Toll樣受體4(TLR4)才能激活下游信號途徑，進而調(diào)控防御素表達[14-15]。然而，在綿羊輸卵管中LPS是否能影響β-防御素的表達，及是否通過TLR4介導目前尚不清楚。本試驗以LPS模擬革蘭陰性菌侵染細胞為模型，研究在此過程中，β-防御素的表達情況以及是否通過TLR4介導其表達，為進一步探索輸卵管炎發(fā)病機理、合理開發(fā)及運用輸卵管炎相關藥物提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1主要試驗材料

雙抗、0.25%胰蛋白酶購自Gibco。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、D-PBS購自Hyclone。DNA Marker(DL2000)、反轉錄試劑盒(No.RR047A)、熒光定量酶SYBR?PremixExTaqⅡ(No.DRR081A)、Premix Ex Tag DNA聚合酶(RR902Q)購自大連寶生物公司?？俁NA提取試劑盒(No.220010)購自上海飛捷生物有限公司。LPS(Cat.No.L2880)購自Sigma公司。SBD-1抗體為本實驗室制備。免疫組化染色試劑盒、顯色劑DAB購自福州邁新生物技術公司。TLR4特異抗體(Cat.No.16-9917-82)購自eBioscience公司。

1.2綿羊輸卵管SBD-1的表達定位

取綿羊輸卵管壺腹部組織，按常規(guī)方法脫水，包埋，切片，37 ℃烘片過夜；切片水化后置于檸檬酸緩沖液(10 mmol·L-1檸檬酸，pH 6.0)中高壓修復抗原10 min。PBST 洗3次×5 min，加入0.3%甲醇-H2O2，濕盒中室溫孵育10 min，PBS洗3次×5 min。加入山羊血清，37 ℃封閉30 min。再加入制備的SBD-1抗體(1∶700)，4 ℃濕盒中孵育24 h，PBST搖洗3次×5 min。加入二抗工作液(生物素標記)，37 ℃濕盒中孵育30 min，加入三抗工作液(辣根酶標記鏈霉卵白素)，37 ℃濕盒中孵育30 min。PBST洗3次×5 min。加入DAB，顯色2～5 min，自來水沖洗，蘇木素染色3 min，0.5%冰醋酸分色，脫水后封片。

1.3細胞培養(yǎng)

取間情期成年綿羊的輸卵管壺腹部組織，剪除漿膜和脂肪組織，剖開輸卵管，經(jīng)0.05%胰酶消化后，刮取輸卵管內(nèi)層細胞，經(jīng)PBS洗滌2次后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，于37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳至第2代，血清饑餓處理14 h，進行后續(xù)試驗。以上所分離得到的細胞，已經(jīng)過形態(tài)學觀察和免疫熒光顯色等方法鑒定為綿羊輸卵管上皮細胞。

1.4細胞干預試驗

1.4.1LPS對SBD-1表達的影響取同一批次綿羊輸卵管上皮細胞，在細胞培養(yǎng)液中添加不同劑量的LPS 0 ng·mL-1(陰性對照)、10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、1 mg·mL-1，分別培養(yǎng)不同時間0(陰性對照)、1、3、6、12和24 h，收集細胞提取總RNA，通過qRT-PCR檢測SBD-1 mRNA表達量變化。

1.4.2LPS對TLR4表達的影響取同一批次綿羊輸卵管上皮細胞，添加100 ng·mL-1LPS分別培養(yǎng)不同時間(0、6、12和24 h)，以0 h作為陰性對照。在各相應時間點提取細胞總RNA，通過qRT-PCR檢測TLR4 mRNA表達量變化，以確定添加LPS對TLR4表達的影響。

1.4.3TLR4阻斷試驗取同一批次綿羊輸卵管上皮細胞，分成4組，第1組為陰性對照，只添加無血清培養(yǎng)基；第2組添加5 μg·mL-1TLR4特異抗體；第3組添加100 ng·mL-1LPS；第4組添加5 μg·mL-1TLR4特異抗體和100 ng·mL-1LPS。12 h后收集細胞，提取細胞總RNA，通過qRT-PCR反應檢測SBD-1表達量變化，以確定LPS對SBD-1表達的影響是否通過TLR4介導。

1.5qRT-PCR檢測

參照總RNA快速提取試劑盒說明書提取總RNA，并反轉錄制備cDNA。以其為模板進行qRT-PCR擴增。總反應體系20 μL：SYBR?PremixExTaqⅡ 10 μL、上下游特異引物各0.4 μL(引物信息見表1)、cDNA 2 μL、無酶水7.2 μL。反應程序：95.0 ℃3 min；95.0 ℃10 s、退火溫度(表1)30 s、72.0 ℃10 s，48個循環(huán)，并在65.0～95.0 ℃測定熔解曲線。

1.6TLR4 PCR檢測

參照總RNA快速提取試劑盒說明書提取總RNA，并反轉錄制備cDNA。以其為模板進行TLR4 PCR擴增。

1.7統(tǒng)計分析

2結果

2.1綿羊輸卵管中SBD-1表達定位

免疫組織化學染色結果如圖1 B、C，在黏膜層的上皮細胞表現(xiàn)SBD-1強陽性，組化著色呈棕黃色，越靠近黏膜層邊緣著色越深，表明SBD-1表達豐度較高。以IgG代替一抗作為陰性對照，其免疫組化結果如圖1 A，未見任何棕黃色染色顆粒。

表1引物信息和qRT-PCR退火溫度

Table 1Primers information and annealing temperature for qRT-PCR

2.2LPS對綿羊輸卵管上皮細胞SBD-1表達的影響

在輸卵管上皮細胞培養(yǎng)中添加不同劑量的LPS，并培養(yǎng)不同時間，考察LPS對綿羊輸卵管上皮細胞中SBD-1表達的影響。表2和圖2結果表明，在未添加LPS組中，SBD-1的表達量在24 h內(nèi)變化不大，但是LPS不同濃度(10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、1 mg·mL-1)在不同時間(1、3、6、12、24 h)可以不同程度地促進SBD-1 mRNA表達。10、50和100 ng·mL-1LPS在3 h促進SBD-1 mRNA表達，差異顯著(P<0.05)，而200 ng·mL-1和1 mg·mL-1LPS在1 h就可以促進SBD-1 mRNA表達，差異顯著(P<0.05)。SBD-1表達在100 ng·mL-1LPS刺激12 h后達到最高，之后則顯著下降。相比較100 ng·mL-1LPS組，200 ng·mL-1和1 mg·mL-1LPS對SBD-1的表達促進作用在1和3 h較強，在6、12和24 h較弱。所以確定后續(xù)試驗添加LPS的刺激濃度為100 ng·mL-1，刺激時間為12 h。

a.P<0.05，10、50、100和200 ng·mL-1以及1 mg·mL-1處理組與對照組之間差異顯著；b.P<0.05，50、100和200 ng·mL-1以及1 mg·mL-1處理組與10 ng·mL-1之間差異顯著；c.P<0.05，100、200 ng·mL-1和1 mg·mL-1處理組與50 ng·mL-1之間差異顯著；d.P<0.05，200 ng·mL-1和1 mg·mL-1處理組與100 ng·mL-1之間差異顯著；e.P<0.05，1 mg·mL-1處理組與200 ng·mL-1之間差異顯著?！?P<0.05，1、3、6、12和24 h處理組與0 h相比差異顯著；☆.P<0.05，3、6、12和24 h處理組與1 h相比差異顯著；◆.P<0.05，6、12和24 h處理組與3 h相比差異顯著；■.P<0.05，12和24 h處理組與6 h相比差異顯著；▼.P<0.05，24 h處理組與12 h相比差異顯著

Concentration-and time-dependent increase of SBD-1 mRNA expression by LPS in OOECs.Data represent means ± SD (n=3).a-e indicate the data in the same column differ significantly，a.P<0.05vs. 0 ng·mL-1；b.P<0.05vs. 10 ng·mL-1；c.P<0.05vs. 50 ng·mL-1;d.P<0.05vs. 100 ng·mL-1;e.P<0.05vs. 200 ng·mL-1；★-▼.indicate the data in the same line differ significantly，★.P<0.05vs. 0 h；☆.P<0.05vs. 1 h；◆.P<0.05vs. 3 h；■.P<0.05vs. 6 h；▼.P<0.05vs. 12 h

2.3綿羊輸卵管上皮細胞中LPS受體TLR4基因的表達檢測

為了探明TLR4在輸卵管上皮細胞中的表達情況，本試驗通過RT-PCR方法檢測輸卵管上皮細胞中TLR4的表達情況。如圖3所示，不同批次收集的綿羊輸卵管上皮細胞中均檢測到TLR4表達，TLR4 PCR產(chǎn)物電泳條帶大小與引物預期條帶大小相符，為197 bp，β-actinPCR產(chǎn)物電泳條帶大小為208 bp。

2.4LPS對綿羊輸卵管上皮細胞中TLR4表達的影響

在輸卵管上皮細胞培養(yǎng)中添加100 ng·mL-1LPS，在不同時間點(0、6、12和24 h)收樣，通過qRT-PCR綿羊輸卵管上皮細胞SBD-1表達水平(圖4)。結果表明，添加100 ng·mL-1LPS后，TLR4表達量在6 h起逐漸增加，但增加不顯著，24 h后達到最高峰，且顯著高于0 h的表達水平(P<0.05)。

2.5TLR4阻斷試驗

為證實LPS影響SBD-1表達過程中TLR4的介導作用，通過添加TLR4特異抗體，阻斷TLR4活性。經(jīng)qRT-PCR方法檢測各組細胞中SBD-1 mRNA表達水平(圖5)。結果表明，單獨添加TLR4抗體組，SBD-1表達無顯著差異；單獨添加LPS可以顯著上調(diào)SBD-1表達(P<0.01)；而共孵育LPS和TLR4抗體組可明顯阻斷LPS對SBD-1的上調(diào)作用(P<0.01)。結果表明，TLR4介導了LPS對SBD-1表達的上調(diào)作用。

3討論

β-防御素作為一種內(nèi)源性的抗菌肽分子，以其重要的抗感染功能，成為替代抗生素的新型藥物[2]。因此研究β-防御素的調(diào)控機制為進一步探索輸卵管炎發(fā)病機理、合理開發(fā)及運用輸卵管炎相關藥物奠定了理論基礎。本研究對SBD-1蛋白在綿羊輸卵管組織中的定位進行檢測，結果表明，SBD-1特異表達于輸卵管的上皮細胞中，固有層細胞有較少量表達，推測在輸卵管中上皮細胞主要負責分泌防御素來抵抗細菌感染，證明綿羊輸卵管上皮細胞中防御素可以在LPS的刺激下表達。

由于TLR在免疫反應早期階段可以識別外源病原微生物而引起人們的極大興趣，其對許多感染性疾病的發(fā)生和病理過程產(chǎn)生影響。LPS對TLR4的作用因細胞而異，T.Matsuguchi等[16]證明LPS刺激小鼠外周血巨噬細胞導致TLR4 mRNA水平下降。在小鼠胸腺T淋巴細胞和脾巨噬細胞中，LPS不影響TLR4的表達[17-18]。盛金良等[19]研究表明，LPS的刺激可促進綿羊肺泡巨噬細胞中TLR4水平上升，這與本研究結果一致。本研究結果表明，100 ng·mL-1LPS處理綿羊輸卵管上皮細胞24 h可顯著促進TLR4 mRNA水平表達。另外，本研究通過在細胞培養(yǎng)過程中添加TLR4中和抗體阻斷TLR4活性，檢測SBD-1 mRNA表達情況，表明阻斷TLR4可以顯著降低LPS對SBD-1的刺激作用。S.Y.Yu等[20]在口腔鱗狀癌細胞中添加TLR4中和抗體，顯著阻斷由LPS-EGFR對hBD-3的促進作用，與本研究結果一致。TLR4同樣還介導LPS對其他炎癥因子的刺激作用，K.Tabeta等[21]證明，添加TLR4抗體可以明顯阻斷LPS對人牙齦成纖維細胞中IL-6的促進作用。上述結果表明，在綿羊輸卵管上皮細胞中LPS通過TLR4膜表面受體影響防御素SBD-1的表達。由于缺乏商品化的TLR4抑制劑，對于TLR4的功能研究只能通過中和抗體進行，但是中和抗體的阻斷效率有限，上述研究結果還需要更多的試驗來佐證，比如TLR4 siRNA干擾試驗。

本研究結果表明，細菌細胞壁主要成分LPS可以顯著誘導綿羊輸卵管上皮細胞表達SBD-1，而TLR4膜表面受體參與調(diào)控過程。本研究對于細菌感染所引起的輸卵管炎有進一步的認識，并深入了解LPS引發(fā)炎癥反應的機制，有助于根據(jù)其生理生化特性研發(fā)出相應的對抗微生物感染的藥物。

參考文獻(References)：

[1]ANDRW B.Mastitis-making the right desion[J].DairyFarmer，2003，50(1)：30-31.

[2]YARUS S，ROSEN J M，COLE A M，et al.Production of active bovine tracheal antimicrobial peptide in milk of transgenic mice[J].ProcNatlAcadSciUSA，1996，93(24)：14118-14121.

[3]GANZ T，SELSTED M E，LEHRER R I.Defensins[J].EurJHaematol，1990，44(1)：1-8.

[4]GANZ T.Defensins：antimicrobial peptides of vertebrates[J].CRBiol，2004，327(6)：539-549.

[5]孫巖，王路，溫俊歌，等.β-防御素在天然免疫中的作用[J].動物醫(yī)學進展，2011，32(5)：120-123.

SUN Y，WANG L，WEN J G，et al.β-defensins function in innate immunity[J].ProgressinVeterinaryMedicine，2011，32(5)：120-123.(in Chinese)

[6]KIRSCHNING C J，WESCHE H，MERRILL AYRES T，et al.Human toll-like receptor 2 confers responsiveness to bacterial lipopolysaccharide[J].JExpMed，1998，188(11)：2091-2097.

[7]BECKER M N，DIAMOND G，VERGHESE M W，et al.CD14-dependent lipopolysaccharide-induced beta-defensin-2 expression in human tracheobronchial epithelium[J].JBiolChem，2000，275(38)：29731-29736.

[8]RYAN L K，DIAMOND G，AMRUTE S，et al.Detection of HBD1 peptide in peripheral blood mononuclear cell subpopulations by intracellular flow cytometry[J].Peptides，2003，24(11)：1785-1794.

[9]RYU S J，CHOI H S，YOON K Y，et al.Oleuropein suppresses LPS-induced inflammatory responses in RAW 264.7 cell and zebrafish[J].JAgricFoodChem，2015，63(7)：2098-2105.

[10]SHINOMIYA T，KAWAGUCHI M，OKUBO M，et al.mRNA expression and localization of LPS-induced β-defensin isoforms in rat salivary glands[J].BullTokyoDentColl， 2014，55(3)：139-147.

[11]SONODA Y，ABDEL MAGEED A M，ISOBE N，et al.Induction of avian β-defensins by CpG oligodeoxynucleotides and proinflammatory cytokines in hen vaginal cellsinvitro[J].Reproduction，2013，145(6)：621-631.

[12]FU Y，LIU B，F(xiàn)ENG X，et al.Lipopolysaccharide increases Toll-like receptor 4 and downstream Toll-like receptor signaling molecules expression in bovine endometrial epithelial cells[J].VetImmunolImmunopathol， 2013，151(1-2)：20-27.

[13]ALVA-MURILLO N，TéLLEZ-PéREZ A D，SAGRERO-CISNEROS E，et al.Expression of antimicrobial peptides by bovine endothelial cells[J].CellImmunol，2012，280(1)：108-112.

[14]TAKEDA K，KAISHO T，AKIRA S.Toll-like receptors[J].AnnuRevImmunol，2003，21：335-376.

[15]POLTORAK A，HE X，SMIRNOVA I，et al.Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice：mutations in TLR4 gene[J].Science，1998，282(5396)：2085-2088.

[16]MATSUGUCHI T，MUSIKACHAROEN T，OGAWA T，et al.Gene expressions of toll-like receptors 2，but not toll-like receptor 4，is induced by LPS and inflammatory cytokines in mouse macrophages[J].JImmunol，2000，165(10)：5767-5772.

[17]AKIRA S.Toll-like receptors and innate immunity[J].AdvImmunol，2001，78：1-56.

[18]MEDVEDEV A E，KOPYDLOWSKI K M，VOGEL S N.Inhibition of lipopolysaccharide-induced signal transduction in endotoxin-tolerized mouse macrophages：dysregulation of cytokine，chemokine，and toll-like receptor 2 and 4 gene expression[J].JImmunol，2000，164(11)：5564-5574.

[19]盛金良，陳創(chuàng)夫，楊霞，等.綿羊Toll樣受體家族在肺泡巨噬細胞的分布及脂多糖(LPS)刺激對TLR2、TLR4表達的影響[J].華北農(nóng)學報，2010，25(1)：30-35.SHENG J L，CHEN C F，YANG X，et al.Distribution of toll-like receptors (TLRs) and TLR2，TLR4 expression during LPS stimulus sheep alveolar macrophage[J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica，2010，25(1)：30-35.(in Chinese)

[20]YU S Y，WANG F，YANG H Y，et al.Human beta-defensin-3 (hBD-3) upregulated by LPS via epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling pathways to enhance lymphatic invasion of oral squamous cell carcinoma[J].OralSurgOralMedOralPatholOralRadiolEndod，2011，112(5)：616-625.

[21]TABETA K，YAMAZAKI K，AKASHI S，et al.Toll-like recceptors confer responsiveness to lipopolysaccharide fromPorphyromonasgingivalisin human gingival fibroblasts[J].InfectImmun，2000，68(6)：3731-3735.

(編輯程金華)

LPS Induces SBD-1 Expression via TLR4 in Ovine Oviduct Epithelial Cells

LI Qi，ZHI Da-fu，YAN Qin，LIU Mo-ning，ZHENG Xin-xin，CAO Gui-fang*

(1.CenterofHistologyandDevelopmentalBiology，CollegeofVeterinaryMedicine，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Huhhot010018，China)

Key words:oviduct；lipopolyscharride；sheep β-defensin-1 (SBD-1)；toll-like receptor 4 (TLR4)

Abstract:The aim of this study was to explore the effect of lipopolyscharride (LPS) on induction of sheep beta defensin-1 (SBD-1) in ovine oviduct epithelial cells (OOECs).In this study，OOECs were cultured and then exposed to LPS for up to 24 hours，with a range of concentrations (10 ng·mL-1-1 mg·mL-1).qRT-PCR was performed to detect SBD-1 mRNA.The results showed that LPS stimulated the expression of SBD-1 in a time-(maximal at 12 hours) and concentration-(maximal at 100 ng·mL-1) dependent manner.Moreover，IHC staining showed that SBD-1 was mainly expressed in epithelial cells.Importantly，TLR4 was detected in OOECs and stimulated by LPS.LPS induced SBD-1 mRNA expression was markedly inhibited by blockage of TLR4 activity using anti-TLR4 antibody.In conclusion，these results suggest that LPS might induce the expression of SBD-1 in the ovine oviduct epithelial cells,and the expression are mediated by TLR4.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.011

收稿日期：2015-06-02

基金項目：國家自然科學基金項目(31360593；31060328)；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計劃項目(20130317)

作者簡介：李琦(1987-)，女，呼和浩特人，博士生，主要從事組織胚胎學與分子生物學研究,E-mail:liqi253762@163.com *通信作者：曹貴方，教授，博士生導師，E-mail:guifangcao@126.com

中圖分類號：S826.2

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0079-06