王守棟，房國鋒，曾勇慶*，陳　偉，李川皓，王延?xùn)|

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安 271000； 2.山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室，泰安 271000)

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F1代轉(zhuǎn)CuZnSOD基因豬的制備與研究

王守棟1，2，房國鋒1，2，曾勇慶1，2*，陳偉1，2，李川皓1，2，王延?xùn)|1，2

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安 271000； 2.山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室，泰安 271000)

摘要：為進一步研究CuZnSOD基因?qū)θ赓|(zhì)表達調(diào)控的作用機理，探究通過磁性納米顆粒介導(dǎo)精子載體法制備轉(zhuǎn)基因豬的可行性。本試驗在重組質(zhì)粒先后與磁性納米顆粒和精液共孵育的基礎(chǔ)上，再通過人工授精獲得F1代仔豬。對繁殖得到的F1代個體進行PCR、熒光定量PCR及Western blot檢測，對屠宰的4頭陽性豬采用絕對定量PCR進行轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)鑒定，F(xiàn)1代個體達100 kg左右時抽樣屠宰進行肉質(zhì)及抗氧化性能測定。結(jié)果表明，F(xiàn)1代陽性率為30.23%。陽性組CuZnSOD在5種組織中的RNA和蛋白水平上的表達量較陰性組均上調(diào)。本試驗得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線：ΔCt=-3.121 6 lgN+17.281(R2=0.992 1，P<0.001)，4頭陽性豬中外源基因拷貝數(shù)分別為25.89、80.61、106.69、83.03。肉質(zhì)及抗氧化性能測定結(jié)果顯示，陽性組肌肉滴水損失顯著低于陰性組(P<0.05)；陽性組肌肉T-SOD1d、T-SOD2d活性顯著高于陰性組，MDA1d、MDA2d含量顯著低于陰性組(P<0.05)。研究結(jié)果表明：CuZnSOD基因的過表達可以提高肌肉的抗氧化性能，降低滴水損失，進而改善肉質(zhì)，同時，證明磁性納米顆粒介導(dǎo)的精子載體法可以用于制備轉(zhuǎn)基因動物。

關(guān)鍵詞：CuZnSOD；磁性納米顆粒；轉(zhuǎn)基因豬；肉質(zhì)；抗氧化性能

近年來，豬的遺傳改良在提高生長速度、增加胴體瘦肉率等方面取得了很大的進步，但肉質(zhì)特性卻停滯不前甚至隨之變劣，而消費者對豬肉肉質(zhì)的要求卻在逐漸提高，所以，肉質(zhì)性狀在豬的育種目標(biāo)中也越來越受到研究者的重視[1]。

CuZnSOD 是一種金屬酶，屬于超氧化物歧化酶(SODs)家族，能夠轉(zhuǎn)移性地清除超氧陰離子自由基，維持氧自由基平衡，幫助機體防御氧化損傷[2]。肉品在貨架期酸敗的主要原因是脂質(zhì)氧化，SOD可以阻止脂質(zhì)氧化反應(yīng)的進行，改善肉質(zhì)，延長肉品的貨架期[3-4]。杜金芳等[5]利用RACE的方法克隆得到了豬CuZnSOD基因的cDNA全長序列。石元[6]利用精子載體法成功制備了轉(zhuǎn)基因肉兔模型并驗證了CuZnSOD對抗氧化性能等肉質(zhì)性狀的重要影響。

精子載體法是利用精子頭部可捕獲外源DNA的特性，將外源目的基因與精子共孵育，使其在受精過程中導(dǎo)入受精卵，并穩(wěn)定整合到子代基因組中的一種制備轉(zhuǎn)基因動物的方法[7-8]。磁性納米基因載體技術(shù)是以磁性納米顆粒作為基因載體，利用磁性納米顆粒能被細胞有效內(nèi)吞，實現(xiàn)核酸向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運和釋放，并在磁場的作用下實現(xiàn)靶向性基因治療[9-11]。莊乾元等[12]用磁性納米顆粒作為基因載體攜帶質(zhì)粒pEGFP-C1，轉(zhuǎn)染人的細胞，結(jié)果表明磁性納米顆粒轉(zhuǎn)染后的細胞增殖活性及功能略優(yōu)于脂質(zhì)體對照組。同時S.W.Gersting等[13]將質(zhì)粒與磁性納米顆粒形成復(fù)合物轉(zhuǎn)染豬的細胞，發(fā)現(xiàn)磁性納米顆粒的轉(zhuǎn)化效率比dendrimer、PEI和Lipofectamine介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率都高。本研究通過磁性納米顆粒介導(dǎo)精子載體法成功制備了CuZnSOD轉(zhuǎn)基因豬并對外源基因拷貝數(shù)進行了鑒定，旨在研究CuZnSOD基因?qū)寡趸阅艿热赓|(zhì)特性的影響機理，對培育具有高抗氧化性的豬種資源具有重要意義。

1材料與方法

1.1試驗材料和試驗動物

磁性納米顆粒polyMAG購自Chemicell；PCR引物由上海生工合成；Anti-SOD1購自Santa Cruz、Ⅱ抗HRP購自EarthOX；Anti-GAPDH、Ⅱ抗HRP購自碧云天；促排卵素3號購自寧波第二激素廠；SOD、MDA試劑盒購自南京建成；其他試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

選取3頭繁殖性能良好、胎次相同并且同期發(fā)情的大白母豬和1頭精液質(zhì)量良好的大白公豬作為試驗動物，經(jīng)相應(yīng)處理并配種。F1代仔豬出生后采集耳組織并迅速投入70%乙醇中，用于PCR檢測。仔豬在同樣的飼養(yǎng)管理條件下飼喂至100 kg左右時抽樣空腹屠宰，其中陽性豬4頭，陰性豬2頭。屠宰后取背最長肌肌肉、肝、背膘、腎、肺組織樣并迅速投入液氮，用于熒光定量PCR和Western blot檢測。取背最長肌放入帶有冰袋的泡沫箱中帶回實驗室用于肉質(zhì)測定。

1.2試驗方法1.2.1無內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取及線性化處理用實驗室前期構(gòu)建的質(zhì)粒[6]轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α菌株，并接種于卡那霉素抗性(50 μg·mL-1)的瓊脂糖平板上，挑取陽性菌落經(jīng)擴大培養(yǎng)后，利用QIAGEN的無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶VspⅠ酶切提取的重組質(zhì)粒，酶切反應(yīng)液經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后進行回收純化。

1.2.2CuZnSOD轉(zhuǎn)基因豬的制備將400 μg按1∶3比例混合的線性質(zhì)粒和環(huán)狀質(zhì)粒與500 μL 磁性納米顆粒polyMAG混勻，室溫孵育10 min后，將質(zhì)粒-納米混合物逐滴加入到稀釋好的精液中，上下翻轉(zhuǎn)混勻，室溫孵育30 min后進行人工授精，同時每頭母豬注射2 mL促排卵素3號；第2天重復(fù)以上操作步驟。

1.2.3F1代仔豬PCR檢測與測序本研究中轉(zhuǎn)入的重組質(zhì)粒pIRES2-AcGFP1-CuZnSOD上的CuZnSOD序列是豬本身CuZnSOD基因的CDS區(qū)，因此，在設(shè)計引物對該序列檢測時采用跨越內(nèi)含子的方法進行設(shè)計。根據(jù)重組質(zhì)粒的序列，用Primer5設(shè)計針對3個序列的引物來檢測F1代豬的陽性率，引物信息如表1。用基因組提取試劑盒提取試驗所需的基因組，用3對特異性引物分別進行PCR擴增，將產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，對目的條帶進行回收測序。

表1特異性引物信息

Table 1The information of specific primers

1.2.4熒光定量PCR檢測不同組織CuZnSOD基因的表達用Trizol試劑法提取5種組織的總RNA，然后用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存。熒光定量采用SYBR Green染料法，在Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀上進行反應(yīng)。以GAPDH基因作為內(nèi)參[14]，用Primer5.0設(shè)計針對CuZnSOD基因的1對特異性引物，引物名稱為F1、R1和FGAPDH、RGAPDH，引物序列信息見表2。

表2定量PCR引物序列

Table 2Primers sequence of qPCR

用Primer5.0設(shè)計2對特異性引物，以ACTB作為內(nèi)參標(biāo)化基因組DNA的量。用CMV-F和CMV-R擴增轉(zhuǎn)基因片段，用ACTB-F和ACTB-R擴增持家基因ACTB的片段，引物序列信息見表2。

反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃復(fù)性10 s，72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)；最后再72 ℃延伸5 min。每個待測樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。將外源基因片段檢測引物擴增CtCMV減去相應(yīng)的ACTB基因的擴增CtACTB，得到ΔCt，再對樣品的拷貝數(shù)的對數(shù)值lgN作圖得到絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。待反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)相應(yīng)的Ct值及標(biāo)準(zhǔn)曲線計算外源基因的拷貝數(shù)。

1.2.7F1代試驗豬肉質(zhì)與抗氧化性能測定[16-18]肉色及大理石花紋采用美國標(biāo)準(zhǔn)5級評分圖對照評定；pH采用PHB-4型便攜式pH計進行測定；滴水損失、烹飪損失、失水率分別用吊掛處理法、蒸煮法、壓力法進行測定；肌肉嫩度采用C-LM3型肌肉嫩度計進行測定。肉樣0～4 ℃保存5 d內(nèi)的抗氧化性能指標(biāo)T-SOD及MDA按照南京建成試劑盒說明書進行測定。

1.2.8統(tǒng)計分析本試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，所得的數(shù)值均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05為差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1F1代轉(zhuǎn)基因豬PCR檢測及陽性率統(tǒng)計

3對特異性引物都能擴增出目的條帶的為陽性豬，部分檢測結(jié)果如圖1。3頭試驗?zāi)肛i均順利受孕并產(chǎn)仔43頭，其中陽性豬13頭，陰性豬30頭，陽性率為30.23%。

2.2F1代豬不同組織CuZnSOD基因的表達分析

F1代豬陽性組與陰性組5種組織CuZnSOD基因mRNA相對表達量見圖2。結(jié)果表明，陽性組5種組織中CuZnSOD基因mRNA表達量高于陰性組，在肌肉和肺組織中達到差異顯著水平(P<0.05)。

2.3F1代豬不同組織CuZnSOD蛋白的表達分析

F1代豬陽性組與陰性組5種組織CuZnSOD蛋白相對表達量見圖3。結(jié)果表明，陽性組5種組織中CuZnSOD蛋白的表達量都高于陰性組，在肌肉和肝組織中達到差異顯著水平(P<0.05)。

2.4轉(zhuǎn)CuZnSOD基因陽性豬外源基因拷貝數(shù)的鑒定

本試驗精確度高，同一標(biāo)準(zhǔn)品的3次重復(fù)Ct值變化很小，得到的絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)，決定系數(shù)R2=0.992 1，計算公式為：ΔCt=-3.121 6 lgN+17.281(R2=0.992 1，P<0.001)。CMV和ACTB基因擴增產(chǎn)物的熔解曲線見圖5。每個樣品進行3次獨立重復(fù)試驗，各樣品關(guān)于CMV和ACTB基因的3次定量檢測的Ct值標(biāo)準(zhǔn)誤小，重復(fù)性好，外源基因拷貝數(shù)鑒定結(jié)果如表3。

2.5試驗豬肉質(zhì)與抗氧化性能測定結(jié)果

對F1代陽性豬與陰性豬進行常規(guī)肉質(zhì)測定，結(jié)果表明，陽性組肌肉滴水損失顯著小于陰性組(P<0.05)，其他指標(biāo)較陰性組均有所改善但差異不顯著(表4)。

對屠宰后0～4 ℃保存5 d內(nèi)的肌肉組織的抗氧化性能指標(biāo)T-SOD及MDA進行測定，結(jié)果表明，陽性組T-SOD活性始終高于陰性組，并且陽性組T-SOD1d、T-SOD2d活性顯著高于陰性組(P<0.05)。陽性組MDA含量始終低于陰性組，并且陽性組MDA1d、MDA2d含量顯著低于陰性組(P<0.05，圖6)。

表3轉(zhuǎn)基因陽性豬中外源基因拷貝數(shù)的估算

Table 3Estimate of the exogenous gene copy number in transgenic positive pigs

表4F1代陽性組與陰性組的肉質(zhì)測定結(jié)果

Table 4Results of meat quality in positive group and negative groups of F1generation

同一行標(biāo)注不同字母的數(shù)值間差異顯著(P<0.05)

Values with the different letters within the same row differ significantly(P<0.05)

3討論

目前傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動物制備方法有顯微注射法[19]、胚胎干細胞法[20]和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法[21]等。精子載體法的優(yōu)點主要是利用生殖細胞受精的自然過程，操作簡單，提高了轉(zhuǎn)基因效率。M.Lavitrano等[7]用小鼠精子作為載體，體外受精獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，證實了精子載體法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的可行性；J.H.Kim等[22]利用精子載體法獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠和豬。徐正剛等[23]通過精子介導(dǎo)法制備了RNA干擾PID1轉(zhuǎn)基因肉兔模型。納米顆粒作為基因載體具有裝載容量大，濃縮并保護外源DNA分子，提高轉(zhuǎn)染效率等優(yōu)點。2011年，V.F.Campos等[24]將納米聚合物和HCNs應(yīng)用于精子載體法中，結(jié)果表明，納米載體結(jié)合外源DNA再與精子共孵育后，能夠獲得更高的基因結(jié)合內(nèi)化效率。這為磁性納米顆粒介導(dǎo)精子載體法制備轉(zhuǎn)基因動物提供了參考。

需氧生物在代謝過程中會產(chǎn)生大量的自由基，過多的自由基若不能及時被清除，會攻擊各種生物大分子，引起DNA損傷、酶失活、脂質(zhì)過氧化等一系列氧化損傷，進而引起生物體各種生理病變[25]。肌肉在貨架期的氧化以脂質(zhì)氧化為主，自由基對肌肉中的PUFA具有很高的親和力，可引發(fā)脂質(zhì)氧化，形成不穩(wěn)定的ROOH，并迅速降解成MDA等物質(zhì)[3]。SOD能將超氧陰離子自由基快速歧化為H2O2和O2，然后H2O2在CAT和GPX的作用下被轉(zhuǎn)化為H2O和O2，從而解除超氧陰離子自由基所造成的危害[26]。李華等[17]研究結(jié)果表明，SOD活性越高、MDA含量越低的肌肉，其系水力越高、肉色越鮮艷，并且肉質(zhì)越細嫩。

本研究獲得轉(zhuǎn)基因陽性率為30.23%，陽性率檢測參照R.Drews等[27]在試驗中采用的設(shè)計2條引物來檢測體系的可靠性的方法，針對3段不同基因的序列設(shè)計3對特異性引物來進行PCR檢測，3對引物都跑出目的條帶的個體為陽性個體，以此來提高陽性率檢測的準(zhǔn)確性。本研究從RNA和蛋白質(zhì)水平上檢測了陽性組與陰性組的相對表達量，試驗結(jié)果表明，陽性組CuZnSOD基因在RNA和蛋白質(zhì)水平上的表達量均上調(diào)，這些結(jié)果進一步說明我們通過磁性納米顆粒介導(dǎo)精子載體法成功制備了轉(zhuǎn)CuZnSOD豬。盡管陽性組CuZnSOD基因在RNA和蛋白質(zhì)水平上的表達量均上調(diào)，但是不同組織陽性組與陰性組在RNA或蛋白質(zhì)水平上卻存在著表達差異，這可能與轉(zhuǎn)入質(zhì)粒上的CMV啟動子有關(guān)，相關(guān)研究表明，CMV啟動子可以在不同組織中引起不同水平的表達[28-29]。轉(zhuǎn)基因的整合位點與拷貝數(shù)是影響外源基因表達的主要因素，鑒定轉(zhuǎn)基因陽性豬外源基因拷貝數(shù)是后續(xù)表型研究的基礎(chǔ)。絕對定量PCR技術(shù)與傳統(tǒng)的定量技術(shù)如Southern blot相比，具有高特異性、高安全性、高效率、高通量、低成本等優(yōu)點[30]。本研究建立了實時定量PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因豬中外源基因拷貝數(shù)的方法。由于染料 SYBR GreenⅠ對所有DNA雙鏈具有高選擇性，為保證擴增片段的特異性，引物的選擇至關(guān)重要[31]。本試驗所設(shè)計的兩對檢測引物的擴增片段大小相近，Tm值基本相等，擴增效率基本一致，并且PCR擴增產(chǎn)物電泳和熔解曲線很好的驗證了引物擴增的特異性。本試驗肌肉抗氧化性能及肉質(zhì)測定結(jié)果表明，陽性組的肉質(zhì)較陰性組有所改善，0～4 ℃保存5 d內(nèi)的肌肉組織中，陽性組T-SOD活性始終高于陰性組，MDA含量始終低于陰性組，這與李華等[17]研究結(jié)果基本一致。滴水損失、烹飪損失、壓力損失等是能夠反映豬肉持水能力(WHC)的指標(biāo)[32]。本試驗陰性組的滴水損失顯著高于陽性組，可能是由于陰性豬SOD表達量低于陽性豬，陰性豬屠宰后，機體氧化還原系統(tǒng)失衡，產(chǎn)生過量的ROS。這些自由基未能被及時清除，攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，使之發(fā)生過氧化反應(yīng)，細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，細胞內(nèi)液釋出，導(dǎo)致滴水損失增多，持水能力減弱[33]。因此，本研究通過磁性納米顆粒介導(dǎo)精子載體法制備轉(zhuǎn)CuZnSOD豬證明是可行的，并由此進一步驗證了CuZnSOD基因?qū)θ赓|(zhì)表達調(diào)控的作用機理。

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(編輯郭云雁)

Preparation and Study ofCuZnSODGene Transgenic Pigs in F1Generation

WANG Shou-dong1，2，F(xiàn)ANG Guo-feng1，2，ZENG Yong-qing1，2*，CHEN Wei1，2，LI Chuan-hao1，2，WANG Yan-dong1，2

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Taian271000，China；2.ShandongProvincialKeyLaboratoryofAnimalBiotechnologyandDiseaseControlandPrevention，Taian271000，China)

Key words:CuZnSOD；magnetic nanoparticles；transgenic pigs；meat quality；antioxidant properties

Abstract:The aim of this study was to further research the mechanism of howCuZnSODgene effect the meat quality by expression and regulation，and explore the possibility to generate transgenic pigs by sperm carrier method mediated by magnetic nanoparticles.F1generation individuals were obtained by artificial insemination on the basis of the recombinant vector incubated with magnetic nanoparticles and semen，respectively.F1individuals were detected by PCR，qRT-PCR and Western blot.Exogenous gene copy number in the 4 slaughtered transgenic positive pigs were estimated by absolute qPCR.Individuals from positive and negative groups were selected at the weight of about 100 kg and slaughtered to determine the meat quality and the antioxidant properties.The results showed that：The positive rate was 30.23% in F1individuals.Compared with the negative group，theCuZnSODexpression at RNA and protein levels in 5 tissues were up-regulated in positive group.The standard curve in this study was：ΔCt=-3.121 6 lgN+17.281(R2=0.992 1，P<0.001).The exogenous gene copy number in the 4 positive pigs was 25.89，80.61，106.69 and 83.03，respectively.The results also showed that：Compared with the negative group，the positive group was significantly increased in muscle T-SOD1dand T-SOD2dactivity(P<0.05)，but decreased in muscle drip loss，the content of MDA1dand MDA2d(P<0.05)，respectively.The results indicated that the overexpression ofCuZnSODgene could elevate the antioxidant properties，reduce the drip loss and further improve the meat quality.Meanwhile，our results proved that transgenic animals could be generated by sperm carrier method mediated by magnetic nanoparticles.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.003

收稿日期：2015-01-12

基金項目：國家轉(zhuǎn)基因重大專項(2013ZX08006-002；2011ZX08006-002)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(生豬)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(SDAIT-06-022-03)；山東省農(nóng)業(yè)良種工程重大課題(2013LZ02-015)

作者簡介：王守棟(1989-)，男，山東新泰人，碩士生，主要從事動物遺傳育種學(xué)研究，E-mail：wangshoudong.8@163.com *通信作者：曾勇慶，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動物遺傳育種學(xué)研究，E-mail：yqzeng@sdau.edu.cn

中圖分類號：S828；S813.3

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0016-09