郝俊芳，黃　凱，王月影，杜麗麗，鐘　凱*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002)

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炎癥相關(guān)miRNAs在LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)中的表達(dá)及miR-223真核表達(dá)載體的構(gòu)建

郝俊芳1，2，黃凱2，王月影1，2，杜麗麗1，2，鐘凱1，2*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002)

摘要：小分子RNA (miRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性、非編碼單鏈小RNA，其在乳腺組織免疫防御過(guò)程中發(fā)揮的調(diào)控作用逐漸引起了人們的關(guān)注。作者擬用qRT-PCR檢測(cè)炎癥相關(guān)miRNAs在LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的表達(dá)變化；構(gòu)建3種miR-223真核表達(dá)載體并檢驗(yàn)重組載體的轉(zhuǎn)染效率。用不同濃度 LPS處理小鼠乳腺上皮細(xì)胞(EpH4-Ev)48 h，qRT-PCR檢測(cè)miR-223、miR-146a、miR-181a和miR-155的表達(dá)變化。以EpH4-Ev細(xì)胞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增pre-miR-223序列，以質(zhì)粒Minicircle、pcDNA3.1(+)和轉(zhuǎn)座子piggyBac為母本構(gòu)建3種miR-223真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染EpH4-Ev細(xì)胞，通過(guò)觀察熒光、qRT-PCR檢測(cè)miR-223的表達(dá)，評(píng)價(jià)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果：qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)EpH4-Ev細(xì)胞炎癥反應(yīng)時(shí)，4種炎癥相關(guān)miRNAs的表達(dá)均顯著 (P<0.05或P<0.01) 增加，并呈現(xiàn)不同程度的劑量依賴性；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 EpH4-Ev細(xì)胞后，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Mini-miR-223質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的miR-223表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；PB-miR-223和pcDNA-miR-223轉(zhuǎn)染EpH4-Ev細(xì)胞后，miR-223的表達(dá)均極顯著(P<0.001)增加。本研究表明炎癥相關(guān)miRNAs參與LPS誘導(dǎo)小鼠EpH4-Ev細(xì)胞的炎性反應(yīng)過(guò)程。成功構(gòu)建3種miR-223真核表達(dá)載體，為后續(xù)miRNAs在乳腺炎癥反應(yīng)中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：炎癥相關(guān)miRNAs；乳腺上皮細(xì)胞；LPS；真核表達(dá)載體；乳腺炎

小分子RNA (microRNA，miRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小RNA，其大小為20～25個(gè)堿基，通過(guò)直接結(jié)合到靶mRNA分子的3′非翻譯區(qū)(3′ untranslated regions，UTRs)，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)靶mRNAs進(jìn)行降解或翻譯抑制來(lái)參與基因表達(dá)的調(diào)控[1-2]。研究表明miRNA參與眾多生理疾病過(guò)程的調(diào)控，包括炎癥反應(yīng)[3]。奶牛乳房炎(bovine mastitis)是迄今為止世界范圍內(nèi)仍未得到有效解決的頑疾，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)和乳業(yè)的發(fā)展[4]。miRNAs在奶牛乳房炎癥反應(yīng)過(guò)程中的調(diào)控作用已逐漸引起了研究者的關(guān)注。

2014年，多位研究者[5-7]利用下一代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)對(duì)病原菌入侵乳腺組織時(shí)，動(dòng)物機(jī)體miRNA表達(dá)譜的變化進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，在病原菌引起乳腺組織炎癥反應(yīng)時(shí)，miRNAs的表達(dá)均發(fā)生了顯著變化。F.Dilda等[8]對(duì)LPS和S.aureus內(nèi)毒素B誘導(dǎo)的牛單核細(xì)胞中5種炎癥相關(guān)miRNA(inflammation related miRNAs)——miR-9、miR-125b、miR-155、miR-146a、miR-223的表達(dá)變化進(jìn)行了研究。A.Naeem等[9]利用qRT-PCR對(duì)乳房鏈球菌感染的奶牛乳腺組織中幾種miRNAs(miR-16、miR-146a/b、miR-155、miR-181a、miR-223)的表達(dá)進(jìn)行了研究，并用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)和分析了miRNA的靶基因。上述研究結(jié)果均表明，一些miRNAs在乳腺炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[10]，但更加深入的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

由革蘭陰性菌——大腸桿菌引起的奶牛乳房炎較為常見(jiàn)[11]，而脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌的主要致病因子[12]，其誘發(fā)的炎癥反應(yīng)和革蘭陰性菌感染引起的炎癥變化相似。乳腺上皮細(xì)胞是研究乳腺功能的重要體外模型，是病原菌穿越乳導(dǎo)管進(jìn)入乳腺后首先接觸的細(xì)胞，因此充當(dāng)了防御乳腺感染的第一道防線。研究發(fā)現(xiàn)乳腺上皮細(xì)胞除了合成乳中的主要營(yíng)養(yǎng)成分外，能產(chǎn)生多種免疫活性因子，例如細(xì)胞因子、趨化因子和宿主防御肽等[13-15]，因此其在乳腺感染的過(guò)程中發(fā)揮著免疫防御的功能。

本研究以不同濃度的LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺上皮細(xì)胞(EpH4-Ev)發(fā)生炎癥反應(yīng)，qRT-PCR檢測(cè)幾種炎癥相關(guān)miRNAs的表達(dá)變化，驗(yàn)證炎癥相關(guān)miRNAs是否參與乳腺上皮細(xì)胞免疫防御反應(yīng)的調(diào)控；構(gòu)建包含miR-223前體序列的3個(gè)類型真核表達(dá)載體，對(duì)比其過(guò)表達(dá)的效率，篩選出理想的miRNA真核過(guò)表達(dá)載體，為進(jìn)一步深入研究miRNAs在乳腺炎癥發(fā)生和發(fā)展中的作用提供有力工具。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

小鼠乳腺上皮細(xì)胞系EpH4-Ev (ATCC，美國(guó))； LPS(Sigma-Aldrich，美國(guó))；SYBR?PrimeScript miRNA RT-PCR Kit (寶生物，大連)；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA連接酶和DL2000、15000 marker(NEB，美國(guó))；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒及PCR純化試劑盒(上海生工)；Plasmid Midi Kit (25) (QIAGENE，德國(guó))； Minicircle DNA 和piggyBac Transposon 質(zhì)粒載體(SBI，美國(guó))；pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和LipofectamineTM2000(Invitrogen，美國(guó))；嘌呤霉素(puromycin，Sigma，美國(guó))；細(xì)胞熒光成像分析儀(Smart fluorescent Cell analyzer Digital Bio，韓國(guó))；E.coliTop10和ZYCY10P3S2T感受態(tài)細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

EpH4-Ev細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、4.0 mmol·L-1L-谷氨酰胺、4 500 mg·L-1葡糖糖、不含丙酮酸鈉的HyClone完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁后，體積明顯增大，待細(xì)胞密度達(dá)95%時(shí)，呈鋪路石樣生長(zhǎng)。

1.3細(xì)胞處理及分組

按1×106·孔-1將EpH4-Ev細(xì)胞，接種于六孔板，過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，以1、5、10 μg·mL-13個(gè)水平的LPS處理EpH4-Ev細(xì)胞，未經(jīng)處理的EpH4-Ev細(xì)胞作為對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，48 h后收集細(xì)胞。

1.4總RNA提取及qRT-PCR檢測(cè)炎癥相關(guān)miRNAs的表達(dá)變化

利用1 mL的RNAiso Plus裂解細(xì)胞，提取總RNA。miRNAs反轉(zhuǎn)錄采用poly(A)加尾法，按照TaKaRa公司試劑盒說(shuō)明書將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR反應(yīng)體系：5 μL 2xSYBR Premix Ex TaqⅡ；上下游引物各 0.1 μL(20 μmol·L-1)；1.25 μL cDNA，DEPC水補(bǔ)齊10 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)，U6作為內(nèi)參檢測(cè)miRNA的表達(dá)水平，所有操作均在冰上完成。qRT-PCR的下游引物是miRNA通用引物，上游引物，見(jiàn)表1。

表1miRNAs定量PCR引物序列

Table 1Primer sequence of miRNAs used for qRT-PCR

1.5pre-miR-223引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)的小鼠miR-223前體序列，插入序列不僅包含pre-miR-223，而且，同時(shí)向其上下游兩端的側(cè)翼幅跨100～200 bp序列，以保證高水平的表達(dá)pre-miR-223，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為432 bp。引物序列如下：上游5′-tctagaGCCACCCACCCAGGATCCCCGTTTTT-3′(劃線部分依次為XbaⅠ酶切位點(diǎn)、Kozak序列)，下游5′-gaattcTGTAGACCCCAGAGCTGCAT-3′(劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))。

1.6miR-223真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

以小鼠EpH4-Ev細(xì)胞基因組DNA為模板，擴(kuò)增目的基因，將帶有酶切位點(diǎn)的miR-223片段和3個(gè)質(zhì)粒分別用XbaⅠ、EcoRⅠ雙酶切，并用 T4 DNA連接酶連接。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliTop10，Minicircle質(zhì)粒用卡那霉素篩選，piggyBac和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒用氨芐霉素篩選。挑單克隆菌落，做菌液PCR，電泳鑒定的陽(yáng)性菌送上海生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果和pre-miR-223的序列用BiXM2.6軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。構(gòu)建成功的miR-223表達(dá)質(zhì)粒命名為Mini-miR-223、PB-miR-223和pcDNA-miR-223。

1.7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EpH4-Ev細(xì)胞

106·孔-1的EpH4-EV細(xì)胞接種于六孔板，細(xì)胞融合度需達(dá)80%，在轉(zhuǎn)染前2 h更換成無(wú)血清物無(wú)雙抗的DMEM?？蛰d質(zhì)粒為陰性對(duì)照組，重組質(zhì)粒為試驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染試劑用LipofectamineTM2000，具體操作步驟如下：用100 μL·孔-1預(yù)冷的無(wú)血清無(wú)雙抗的培養(yǎng)液分別進(jìn)行稀釋2 μg DNA和5 μL的LipofectamineTM2000，室溫靜置5 min后，將兩者混合，室溫靜置20 min，緩慢均勻滴入孔內(nèi)，6 h更換培養(yǎng)液。PB-miR-223質(zhì)粒需按1∶0.8的比例添加PBase酶。轉(zhuǎn)染24 h后將各組細(xì)胞在Smart fluorescent Cell analyzer儀上觀察miRNAs重組質(zhì)粒的GFP表達(dá)[pcDNA3.1(+)表達(dá)載體不含綠色熒光蛋白基因]，并采集圖像。同時(shí)，用12孔板測(cè)定嘌呤霉素對(duì)EpH4-Ev細(xì)胞的篩選濃度為8 μg·mL-1，轉(zhuǎn)染PB-miR-223質(zhì)粒的EpH4-Ev細(xì)胞經(jīng)篩選12 d，傳代3～4次，形成穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-223基因細(xì)胞系。反轉(zhuǎn)錄如前所述，qRT-PCR檢測(cè)成熟miR-223表達(dá)。

1.8數(shù)據(jù)處理

2結(jié)果

2.1LPS誘導(dǎo)EpH4-Ev細(xì)胞炎癥反應(yīng)時(shí)炎性相關(guān)miRNAs的表達(dá)變化

與對(duì)照組相比，LPS刺激后EpH4-Ev細(xì)胞的4種炎癥相關(guān)miRNAs的表達(dá)均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)(圖1)。5 μg·mL-1LPS處理組的4種炎癥miRNAs的表達(dá)顯著升高(P<0.05或P<0.01)，而10 μg·mL-1LPS處理組的4種miRNAs的表達(dá)極顯著升高(P<0.01)，結(jié)果表明，4種炎癥相關(guān)miRNAs在LPS刺激后表達(dá)均顯著增加，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。

2.2pre-miR-223基因的PCR擴(kuò)增

以EpH4-Ev細(xì)胞基因組DNA為模板，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物片段大小約為432 bp，與預(yù)期大小相符(圖2)。

2.3單酶切鑒定誘導(dǎo)的Mini-miR-223微環(huán)

用EcoRⅠ單酶切誘導(dǎo)前的MP-miR-223質(zhì)粒和誘導(dǎo)后Mini-miR-223質(zhì)粒，電泳結(jié)果顯示：在7 487 bp和 3 432 bp左右各有1條特異性條帶(圖3)，與預(yù)期值一致，證實(shí)微環(huán)DNA誘導(dǎo)成功。

2.4Mini-miR-223、PB-miR-223轉(zhuǎn)染EpH4-Ev細(xì)胞后EGFP的表達(dá)

EpH4-Ev細(xì)胞中Mini-miR-223質(zhì)粒瞬時(shí)表達(dá)和PB-miR-223質(zhì)粒的穩(wěn)定表達(dá)見(jiàn)圖4。

2.5qRT-PCR檢測(cè)3種真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染EpH4-Ev細(xì)胞后miR-223的表達(dá)

如圖5所示，與對(duì)照組相比，Mini-miR-223、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EpH4-Ev細(xì)胞后，miR-223的表達(dá)無(wú)顯著變化(P>0.05)；轉(zhuǎn)染PB-miR-223質(zhì)粒的細(xì)胞，經(jīng)8 μg·mL-1Puro篩選形成的穩(wěn)定細(xì)胞系可以有效過(guò)表達(dá)miR-223，與對(duì)照組相比，miR-223的表達(dá)極顯著增加(P<0.001)；pcDNA-miR-223質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，miR-223的表達(dá)極顯著增加(P<0.001)。以上結(jié)果表明PB-miR-223和pcDNA-miR-223重組質(zhì)粒能夠在EpH4-Ev細(xì)胞中高效特異性的過(guò)表達(dá)成熟的miR-223。

3討論

奶牛乳房炎一直是困擾奶牛養(yǎng)殖業(yè)的常見(jiàn)病和多發(fā)病，人們對(duì)其發(fā)病機(jī)制已進(jìn)行了多年的研究仍未有大的突破，因此，研究者需要尋找參與乳房炎病理過(guò)程中新的靶分子及其適當(dāng)?shù)恼{(diào)控途徑。MicroRNAs作為一類新的基因表達(dá)調(diào)控分子參與機(jī)體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，其參與了眾多疾病的病理過(guò)程，可作為疾病診斷標(biāo)志物或干預(yù)治療的靶標(biāo)。miRNAs在奶牛乳房炎發(fā)生發(fā)展中作用的研究尚處于起步階段，仍有許多未知領(lǐng)域需要更加深入的研究。前人的許多研究多關(guān)注于miRNAs在免疫細(xì)胞炎癥反應(yīng)中所發(fā)揮的作用，而本研究以乳腺上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，利用qRT-PCR檢測(cè)幾種炎癥相關(guān)miRNAs在LPS人工誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的表達(dá)變化。

前人的研究已證明miR-223在粒細(xì)胞的增殖與分化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。L.M.Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與健康的對(duì)照組乳腺組織相比，S.aureus感染的乳腺組織中miR-223的表達(dá)上調(diào)了1.95倍(P<0.05)，該研究還證實(shí)高遷移率族蛋白1(high-mobility group box protein 1，HMGB1)是miR-223的靶基因之一，HMGB1的3′-UTR的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與奶牛乳房炎的易感性有關(guān)。A.Naeem等[9]研究發(fā)現(xiàn)，用鏈球菌感染動(dòng)物健康乳腺組織后，miR-223明顯上調(diào)2.5倍。本研究結(jié)果表明，不同濃度LPS刺激EpH4-Ev細(xì)胞48 h 后，miR-223的表達(dá)呈劑量依賴性增高。這表明，大腸桿菌(LPS)導(dǎo)致的乳腺炎癥反應(yīng)與S.aureus、S.ubiris引發(fā)的乳房炎一樣，miR-223的表達(dá)顯著升高。這也與其他研究[18-19]的結(jié)果相似。miR-181a主要表達(dá)于B淋巴細(xì)胞，在乳腺癌[20]、胃癌[21]高表達(dá)，發(fā)揮著類似抑癌基因的功能，這個(gè)研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-181a對(duì)早期乳腺炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用。miR-146a[22-23]作為與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的重要分子，也是研究其功能最多的miRNA之一。K.D.Taganov等[22]用 LPS刺激THP-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-146a表達(dá)較對(duì)照組顯著增高，其通過(guò)靶基因的翻譯抑制，參與炎癥反應(yīng)。miR-155 參與多種炎癥過(guò)程，人單核細(xì)胞受LPS刺激后，miR-155的表達(dá)增高[22]，同樣，正常人纖維細(xì)胞的炎癥介質(zhì)可以誘導(dǎo)miR-155的表達(dá)升高[24]。該試驗(yàn)結(jié)果與上述miRNA在LPS等誘導(dǎo)的乳腺組織炎癥反應(yīng)中上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)一致。

目前miR-223在奶牛乳房炎癥作用及其機(jī)制仍缺乏報(bào)道，構(gòu)建能夠過(guò)表達(dá)miR-223的真核載體，是研究其對(duì)靶基因的調(diào)控作用和進(jìn)行miRNA作用機(jī)制研究的基礎(chǔ)。因此，本研究構(gòu)建3個(gè)miR-223真核表達(dá)載體，對(duì)比其過(guò)表達(dá)miR-223的效率。Mini-miR-223微環(huán)的成功誘導(dǎo)是采用傳統(tǒng)的L-阿拉伯糖介導(dǎo)的重組酶表達(dá)，得到一種含目的基因表達(dá)的微環(huán) DNA[25-27]。Mini-miR-223質(zhì)粒過(guò)表達(dá)效率低，原因之一，可能是由于其不含真核篩選基因，細(xì)胞在整合外源基因的過(guò)程中未加壓傳代[28]，使目的蛋白表達(dá)不斷降低。當(dāng)然不同細(xì)胞系本身的性質(zhì)決定了轉(zhuǎn)染效率。相比之下，piggyBac真核表達(dá)載體不僅含有哺乳動(dòng)物的強(qiáng)啟動(dòng)子CMV，而且在EGFP間接反映重組質(zhì)粒表達(dá)的同時(shí)，puro的真核篩選基因有助于篩選到穩(wěn)定高效表達(dá)miR-223的EpH4-Ev細(xì)胞系。本試驗(yàn)PcDNA-miR-223質(zhì)粒在EpH4-Ev細(xì)胞中的產(chǎn)物也具有生物活性。

本研究成功構(gòu)建miRNA的真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究miRNA在奶牛乳房炎癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]HUANG Y，SHEN X J，ZOU Q，et al.Biological functions of microRNAs：a review[J].JPhysiolBiochem，2011，67(1)：129-139.

[2]HE L，HANNON G J.MicroRNAs：small RNAs with a big role in gene regulation[J].NatRevGenet，2004，5(7)：522-531.

[3]BARTEL D P.MicroRNAs：Target recognition and regulatory functions[J].Cell， 2009，136(2)：215-233.

[4]HOGEVEEN H，HUIJPS K，LAM T J.Economic aspects of mastitis：new developments[J].NZVetJ，2011，59(1)：16-23.

[5]LAWLESS N，REINHARDT A T，BRYAN K，et al.MicroRNA regulation of bovine monocyte inflammatory and metabolic networks in aninvivoinfection model[J].G3(Bethesda)， 2014，4(6)：957-971.

[6]CHEN L，LIU X L，LI Z X，et al.Expression differences of miRNAs and genes on NF-κB pathway between the healthy and the mastitis Chinese Holstein cows[J].Gene，2014，545(1)：117-125.

[7]JIN W，IBEAGHA-AWEMU E M，LIANG G，et al.Transcriptome microRNA profiling of bovine mammary epithelial cells challenged withEscherichiacoliorStaphylococcusaureusbacteria reveals pathogen directed microRNA expression profiles[J].BMCGenomics，2014，15：181.

[8]DILDA F，GIOIA G，PISANI L，et al.Escherichiacolilipopolysaccharides andStaphylococcusaureusenterotoxin B differentially modulate inflammatory microRNAs in bovine monocytes[J].VetJ，2012，192(3)：514-516.

[9]NAEEM A，ZHONG K，MOISS J，et al.Bioinformatics analysis of microRNA and putative target genes in bovine mammary tissue infected withStreptococcusuberis[J].JDairySci，2012，95(11)：6397-6408.[10]IZUMl H，KOSAKA N，SHIMIZU T，et al.Bovine milk contains microRNA and messenger RNA that are stable under degradative conditions[J].JDairySci，2012，95(9)：4831-4841.

[11]ZADOKS R N，MIDDLETON J R，McDOUGALL S，et al.Molecular epidemiology of mastitis pathogens of dairy cattle and comparative relevance to humans[J].JMammaryGlandBiolNeoplasia，2011，16(4)：357-372.[12]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].4版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007.

LU C P.Veterinary microbiology[M].4ed.Beijing：China Agriculture Press，2007.(in Chinese)

[13]WELLNITZ O，KERR D E.Cryopreserved bovine mammary cells to model epithelial response to infection[J].VetImmunolImmunopathol， 2004，101(3-4)：191-202．

[14]PAAPE M，MEHRZAD J，ZHAO X，et al.Defense of the bovine mammary gland by polymorphonuclear neutrophil leukocytes[J].JMammaryGlandBiolNeoplasia，2002，7(2)：109-121.

[15]GOLDAMMER T，ZERBE H，MOLENAAR A，et al.Mastitis increases mammary mRNA abundance of beta-defensin 5，toll-like-receptor 2 (TLR2)，and TLR4 but not TLR9 in cattle[J].ClinDiagnLabImmunol，2004，11(1)：174-185．

[16]李金明.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2007：92-93.

LI J M.Real time fluorescent PCR technique[M].Beijing：People’s Military Medical Press，2007：92-93.(in Chinese)

[17]LI L M，HUANG J，ZHANG X，et al.One SNP in the 3′-UTR of HMGB1 gene affects the binding of target bta-miR-223 and is involved in mastitis in dairy cattle[J].Immunogenetics，2012，64(11)：817-824.

[18]JOHNNIDIS J B，HARRIS M H，WHEELER R T，et al.Regulation of progenitor cell proliferation and granulocyte function by microRNA-223[J].Nature，2008，451(7182)：1125-1129.

[19]LENA A M，SHALOM-FEUERSTEIN R，RIVETTI DI VAL CERVO P，et al.miR-203 represses ‘stemness’ by repressing DeltaNp63[J].CellDeathDiffer， 2008，15(7)：1187-1195.

[20]MAILLOT G，LACROIX-TRIKI M，PIERREDON S，et al.Widespread estrogen-dependent repression of micrornas involved in breast tumor cell growth[J].CancerRes，2009，69(21)：8332-8340.

[21]YAO Y，SUO A L，LI Z F，et al.MicroRNA profiling of human gastric cancer[J].MolMedRep，2009，2(6)：963-970.

[22]TAGANOV K D，BOLDIN M P，CHANG K J，et al.NF-kappaB-dependent induction of microRNA miR-146，an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses[J].ProcNatlAcadSciUSA，2006，103(33)：12481-12486.

[23]BOLDIN M P，TAGANOV K D，RAO D S，et al.miR-146a is a significant brake on autoimmunity，myeloproliferation，and cancer in mice[J].JExpMed，2011，208(6)：1189-1201.

[24]HE M，XU Z，DING T，et al.MicroRNA-155 Regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta[J].CellMolImmunol，2009，6(5)：343-352.

[25]BIGGER B W，TOLMACHOV O，COLLOMBET J M，et al.An araC-controlled bacterial cre expression system to produce DNA minicircle vectors for nuclear and mitochondrial gene therapy[J].JBiolChem，2001，276(25)：23018-23027.

[26]CHEN Z Y，HE C Y，EHRHARDT A，et al.Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expressioninvivo[J].MolTher，2003，8(3)：495-500.

[27]JECHLINGER W，AZIMPOUR TABRIZI C，LUBITZ W，et al.Minicircle DNA immobilized in bacterial ghosts：invivoproduction of safe non-viral DNA delivery vehicles[J].JMolMicrobiolBiotechnol，2004，8(4)：222-231.

[28]ROBERTS P E，MATHER J P.Introduction to cell and tissue culture[M].New York：Plenum Press，1998：77-78.

(編輯白永平)

Expression of Inflammation-related miRNAs in the LPS-induced Inflammation in Murine Mammary Epithelial Cells and Construction of miR-223 Eukaryotic Expression Vector

HAO Jun-fang1，2，HUANG Kai2，WANG Yue-ying1，2，DU Li-li1，2，ZHONG Kai1，2*

(1.KeyLabofRegulationonAnimalGrowthandDevelopmentofAgriculturalMinistryofChina，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

Key words:inflammation-related miRNAs；mammary epithelial cells；LPS；eukaryotic expression vector；mammary inflammation

Abstract:Small RNA (miRNA) is a class of endogenous，single strand，small non-coding RNAs，which is recently discovered.Its regulation in the process of immune defense in mammary tissue gradually attracted people’s attention.Expression changes of inflammation-related miRNAs have been detected in mouse mammary epithelial cells when inflammation reaction induced with LPS occurred with qRT-PCR；we have also constructed 3 kinds of miR-223 eukaryotic expression vectors and tested recombinant vectors transfection efficiency.Mouse mammary epithelial cells (EpH4-Ev cells) have been incubated with different dose of LPS for 48 h，then，expressions of miR-223，miR-146a，miR-181a and miR-155 have been detected with qRT-PCR.Genomic DNA of EpH4-Ev cells were used as a template and pre-miR-223 cDNA sequence was amplificated with PCR.PCR product was combined with Minicircle，pcDNA3.1(+) and piggyBac transposon，separately，to construct three kinds of miR-223 eukaryotic expression vectors.Three kinds of recombined vectors were transfected into EpH4-Ev cells，respectively.Expression of miR-223 was measured and green fluorescence was observed in order to evaluate transfection efficiency of recombinant plasmid.qRT-PCR results showed that expression of 4 kinds of inflammation-related in EpH4-Ev cells significantly increased when inflammation induced by LPS (P<0.05 orP<0.01)，and the expression change was in a dose-dependent manner.qRT-PCR results showed that the expression level of miR-223 had no significant change (P>0.05) when Mini-miR-223 plasmid transfected into the EpH4-Ev cells，while the expression of miR-223 significantly increased when PB-miR-223 and pcDNA-miR-223 transfected EpH4-Ev cells (P<0.001).Inflammation-related miRNAs have been showed involved in the process of inflammation induced by LPS in mouse EpH4-Ev cells.Three kinds of miR-223 eukaryotic expression vectors have been constructed successfully，and may contribute to further research of the modulation significance of miRNAs in the mammary gland immune reaction.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.025

收稿日期：2015-05-23

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31470120)

作者簡(jiǎn)介：郝俊芳(1989-)，女，河南林州人，碩士生，主要從事泌乳生物化學(xué)研究，E-mail：haojunfang163@163.com *通信作者：鐘凱(1974-)，女，河南鄭州人，博士，副教授，主要從事泌乳生物化學(xué)研究，E-mail：zhongkai@henau.edu.cn

中圖分類號(hào)：S857.26

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)01-0183-07