華南地區(qū)低有機質污泥堿性厭氧產酸（VFAs）性能機理與菌群分析

姚創(chuàng)，劉暉，羅曉棟，岳建雄，李詩瑤，陳大志（廣東省工程技術研究所，廣東省水環(huán)境污染控制重點實驗室，廣東 廣州50440；仲愷農業(yè)工程學院環(huán)境科學與工程學院，廣東 廣州505）

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華南地區(qū)低有機質污泥堿性厭氧產酸（VFAs）性能機理與菌群分析

姚創(chuàng)1，劉暉2，羅曉棟1，岳建雄1，李詩瑤1，陳大志1
（1廣東省工程技術研究所，廣東省水環(huán)境污染控制重點實驗室，廣東 廣州510440；2仲愷農業(yè)工程學院環(huán)境科學與工程學院，廣東 廣州510225）

摘要：目前，我國利用剩余污泥產揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）的碳源化研究主要集中在對華東和北方地區(qū)污水廠污泥的利用，而采用華南地區(qū)污水廠剩余污泥進行產酸的研究較少，且對其開展實際現場產酸特性的研究更是少見報道。采用半連續(xù)式厭氧產酸反應器，對廣東省肇慶市鼎湖區(qū)污水處理廠剩余污泥產揮發(fā)性脂肪酸的系統(tǒng)特性進行了試驗研究。研究結果表明，系統(tǒng)在堿性條件下（pH=10.0）具有良好的水解產酸性能。VFAs對應的COD （VFAs-COD）占SCOD的比重較大，平均占比73.89%，高于現有同類研究結果2%～15%。同時僅伴隨著少量的多糖和蛋白質積累（對應的COD占SCOD的比重為5%～15%）。乙酸為主要的VFAs組成成分，平均占比51.43%，系統(tǒng)優(yōu)勢菌幾乎全部為產酸菌，包括Acetoanaerobium sp.、Clostridiales bacterium Z-810、Proteinivorax tanatarense strain Z-910、Tissierella sp.，其中Acetoanaerobium sp.、Clostridiales bacterium Z-810在同類研究中暫無報道。系統(tǒng)產酸過程中可實現33.5%的污泥減量率。

關鍵詞：剩余污泥；堿性產酸；溶解性有機物；揮發(fā)性脂肪酸；污泥減量；菌群

2015-07-31收到初稿，2015-10-06收到修改稿。

聯系人：陳大志。第一作者：姚創(chuàng)（1984—），男，博士研究生，工程師。

Received date: 2015-07-31.

Foundation item: supported by the Special Scientific Research of Guangzhou Science and Technology Plan Projects (Common Project) (201510010283).

引　言

已有研究表明，乙酸等短鏈揮發(fā)性脂肪酸是提高城市污水處理系統(tǒng)中營養(yǎng)物去除效果（尤其是除磷）的優(yōu)異碳源[1-2]。因此，將剩余污泥厭氧發(fā)酵過程控制在水解酸化階段，以獲得VFAs作為低碳源污水處理系統(tǒng)氮、磷去除所需補充碳源的研究（碳源化利用），于近年來逐漸興起成為熱點[3-5]。目前，實現污泥發(fā)酵產VFAs的方法包括酸堿處理[6]、熱堿處理[7-8]、超聲波處理[9]、堿加微波預處理[10]等，其中，熱、超聲和微波等存在操作能耗較高，且工程放大應用較困難等問題，因而采用單獨強堿來控制厭氧系統(tǒng)產VFAs被認為是一種簡單高效的方式。科研人員亦針對其影響因素[溫度[11]、停留時間（HRT/SRT[12]）、污泥類型[13]等]開展了一系列的研究，取得了積極的成果。

但是，我國關于污泥堿性厭氧產VFAs的研究主要集中在對華東和北方地區(qū)的剩余污泥利用，而針對華南地區(qū)污水廠剩余污泥產酸的研究很少，尤其是實際現場產酸特性研究暫未見報道。與上述地區(qū)的污水廠相比，華南地區(qū)污水處理廠的進水含碳量、剩余污泥有機質含量均更低，這些差異均會對污泥堿性產酸的碳源化利用性能產生顯著影響。

因此，本文在廣東省肇慶市鼎湖區(qū)污水處理廠建立了一套厭氧產酸系統(tǒng)，利用污水廠實際的剩余污泥開展堿性產酸的碳源轉化系統(tǒng)特性研究，探討低有機質污泥的產酸特點、穩(wěn)定性與機制，以求為該技術在華南地區(qū)的工程化應用打下理論與數據基礎。

1　試驗材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1剩余污泥試驗用剩余污泥取自廣東省肇慶市鼎湖區(qū)污水處理廠的污泥回流泵房，污水廠的處理工藝為A2/O微曝氧化溝。剩余污泥經泵提升，經過預濃縮后進入厭氧產酸反應器，作為試驗用泥。進泥的主要性質如表1所示。

表1　剩余污泥主要性質Table 1　Characteristics of excess sludge

1.1.2試驗裝置采用半連續(xù)式運行方式進行污泥厭氧產酸系統(tǒng)現場試驗。試驗裝置如圖1所示。厭氧罐內壁為不銹鋼材質，內徑為0.9 m，總體積為0.9 m3。厭氧罐內壁外有一注水夾層，通過外接加熱循環(huán)系統(tǒng)對厭氧罐進行控溫。為使產酸過程中泥水充分混合，厭氧罐中間設置有不銹鋼攪拌槳，采用變頻器（VFD-EL）調節(jié)轉速，控制頂端的三相電機驅動。厭氧罐上端設置有進泥口，內部設置有超聲波液位計、溫度電極（PT100）和pH電極（PH6308PT），以監(jiān)控系統(tǒng)的進出泥量、溫度和pH。厭氧罐下端設置有電磁閥和不銹鋼污泥泵，用以控制厭氧罐的排泥。

圖1　試驗裝置Fig.1　Experimental apparatus

1.2試驗方法

1.2.1反應器運行厭氧產酸系統(tǒng)日常運行采用PLC（三菱FX1S-20MR-001）自動控制，污泥停留時間（SRT）為8 d。系統(tǒng)每日定時開啟出泥電磁閥和排泥泵，從厭氧罐排出混合液至指定液位。之后順序開啟進泥泵，將預濃縮后的污泥泵入罐體內至指定液位。進、出泥過程中，攪拌器一直開啟（轉速50 r·min-1），以使系統(tǒng)混合均勻，并保持穩(wěn)定的污泥停留時間。進泥完畢后，系統(tǒng)根據監(jiān)測到的pH自動開啟加堿泵（氫氧化鈉），保持系統(tǒng)pH為10.0左右，進入正常的產酸過程。同時，根據實際環(huán)境溫度情況開啟自動控溫功能（系統(tǒng)啟動時間為10月下旬）。

1.2.2檢測方法進、出系統(tǒng)的污泥樣品均先經離心機（轉速為8000 r·min-1）離心分離，上清液過孔徑為0.45 μm的濾膜，取濾液檢測溶解性物質含量，包括：COD（SCOD）、揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）、多糖、蛋白質。

其中，總懸浮固體（TSS）、揮發(fā)性懸浮固體（VSS）、SCOD測定采用標準方法[14]。多糖測定采用苯酚-硫酸法[15]，蛋白質測定采用考馬斯亮藍法[16]。VFAs測定采用氣相色譜法[17]。

1.2.3DNA提取、擴增與DGGE分析

（1） 總DNA提取

進泥、系統(tǒng)穩(wěn)定后的出泥樣品經0.22 μm的濾膜過濾后，采用CTAB法提取濾膜上樣品的總DNA。向樣品中加入5 ml CTAB提取液（100 mmol·L-1Tris·Cl，100 mmol·L-1EDTA-Na2，200 mmol·L-1NaCl， 2% CTAB，pH 8.0）中，37℃振蕩45 min。加入20%的SDS至終濃度為2%，65℃水浴2 h。12000 r·min-1，10 min離心，收集上清。上清用等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）抽提2次，加入終濃度1/10體積的醋酸鈉（pH 5.2）及0.6倍體積異丙醇，4℃沉淀1 h。12000 r·min-1冷凍離心20 min，收集沉淀，用70%乙醇洗滌2次，晾干后溶于50 μl TE（pH 8.0）。測定提取的總DNA濃度，用TE將其稀釋至100 ng·ml-1。

（2）16S rDNA的V3區(qū)PCR擴增

用16S rDNA通用引物27F/1492R進行第一輪擴增（27F：5′AGAGTTTGATCCTGG CTCAG3′; 1492R:5′TACGACTTAACCCCA ATCGC3′），后將PCR產物稀釋50倍后作為模板進行第二輪擴增，擴增引物為F357-GC/518R（F357-GC: 5′CGCCCGCCG CGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG CCTACGGGAGGCAGCAG3′; R518: 5′ATTACC GCGGCTGCTGG3′）。50 ml PCR反應體系包括1× Buffer（含2.0 mmol·L-1MgCl2），dNTP 200 mmol·L-1，引物各0.2 mmol·L-1，Taq酶2.5 U，模板DNA 1 ml。反應程序為：94℃預變性5 min； 30次循環(huán)[94℃ 30 s ；56℃ 30 s；72℃ 1.5 min (27F/1492R)/30 s (F357-GC/518R)]；72℃ 10 min。取PCR產物各3 ml，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜。

（3）變性梯度凝膠電泳DGGE

采用Bio-Rad公司的D-Code突變檢測系統(tǒng)對樣品進行DGGE分析。所用的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%（丙烯酰胺:雙丙烯酰胺=37.5:1），變性劑濃度為35%～70%（100%的變性劑為7 mol·L-1尿素，40%去離子甲酰胺）。在70 V電壓下，60℃恒溫，1×TAE中電泳14 h。電泳完畢后，用超純水沖洗膠，然后將膠放進含1%Goldview的染液中，置于搖床上染色30 min后，凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖譜。

（4）條帶回收與測序

選取較有代表性的條帶，用潔凈的手術刀片將目標DGGE條帶完整地切下并裝入1.5 ml離心管中，備用。用ddH2O漂洗切膠條帶1次，后加入50 μl ddH2O，用槍頭將凝膠壓碎，于4 ℃存放過夜，以浸泡液為模板進行PCR擴增。取1 ml浸泡液為模板，采用引物F338/518R進行16S rRNA V3區(qū)擴增（F338: 5′CCTACGGGAGGCAGCAG3′），1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產物送Invitrogen上海分公司以引物F338進行測序。

2　結果與討論

2.1SCOD的變化

圖2　SCOD變化曲線Fig.2　Variation curve of SCOD

剩余污泥在堿性條件和水解酶的作用下，會釋放胞內外有機物質進入液相，使系統(tǒng)內的SCOD值增加（SCOD組成包括VFAs、多糖、蛋白質、腐殖酸等）。如圖2所示，厭氧系統(tǒng)經過7 d左右，SCOD開始進入一個較高的水平，并在前25 d（未開啟溫控）內基本穩(wěn)定，保持在2500 mg·L-1左右。之后，第26～47天（未開啟控溫），SCOD快速下降，最低降至745 mg·L-1（第47天），此時段，對應SCOD比產生速率從511.4 mg COD·(g VSS)-1迅速降低到150～200 mg COD·(g VSS)-1左右。從第47天開始（溫度控制在25℃），系統(tǒng)的SCOD逐步恢復正常，保持在2507～3000 mg·L-1左右。

由上可知，在前25 d與48～77 d這兩個時段里，系統(tǒng)穩(wěn)定運行后的SCOD值差別不大，均可以實現有效的污泥水解。但是在中期的26～47 d，SCOD值顯示出一個先下降后上升的U形谷底。分析發(fā)現，該時段主要運行參數（SRT、pH）與其他兩個時段一致，唯一不同的是由于季節(jié)變化導致的天氣變冷（該時段未開啟溫控系統(tǒng)，溫度最低降至13℃），且圖2中亦顯示SCOD降低與溫度下降基本保持同步。而已有研究表明，在15～55℃的范圍內，溫度降低不利于污泥破解后胞內外物質釋放[11]，溫度降低亦會導致污泥水解酶的活性降低[18]，從而使SCOD下降。因此，可以推知，本試驗中，季節(jié)變化帶來的溫度下降（低于20℃）是造成中期SCOD值顯著降低的主要原因，當溫度處于20～25℃范圍，系統(tǒng)可以取得較穩(wěn)定的污泥水解效果。

2.2VFAs的變化

剩余污泥堿性產酸系統(tǒng)內，存在著能耐受強堿條件的產酸菌，可以將液相中的溶解性有機物質（如多糖、蛋白質等）轉化成各類脂肪酸，此時產甲烷作用被抑制，從而實現VFAs積累。圖3(a)結果表明，在厭氧系統(tǒng)啟動的前兩個星期，產酸發(fā)酵液中VFAs對應的濃度（VFAs-COD）就達到了1500～2000 mg COD·L-1，同時僅伴隨著少量的多糖和蛋白質積累（僅占比5%～15%），這表明該時段整個系統(tǒng)的產酸性能較好，污泥水解過程中釋放的多糖與蛋白質等有機物很快就被產酸菌利用產生VFAs[19]。與SCOD變化趨勢一致，在26～47 d，產酸量亦出現了明顯的降低（最低為629.39 mg COD·L-1），這是由于SCOD降低使液相中用于產酸的有機基質減少，同時產酸菌活性亦受到低溫的不利影響[20]。當開啟控溫至25℃左右時，系統(tǒng)的產酸作用很快恢復，VFAs最高上升至2252.28 mg COD·L-1?？傮w來說，系統(tǒng)的VFAs占SCOD比重較大，平均占比73.89%，是SCOD主要組成成分。

圖3(b)為系統(tǒng)中各單獨VFA組分含量占VFAs含量的比值，結果表明，試驗過程中各酸類物質在VFAs中的占比隨著溫度的變化，出現了一定程度的波動。但是，乙酸(HAc)始終為厭氧產酸系統(tǒng)中VFAs的主要組成成分，占VFAs總量的30.97%～68.04%，平均占比51.43%。丙酸則為僅次于乙酸的主要成分（平均占比為20.98%）。這一結果與Chen 等[21-22]采用污泥堿性產酸研究的結論是一致的。

上述結果表明，在本試驗中，采用強堿性條件抑制厭氧系統(tǒng)的產甲烷過程并強化水解酸化作用，可以實現良好的短鏈脂肪酸積累效果（尤其是乙酸、丙酸）。

圖3　VFAs變化Fig.3　Variation of VFAs

圖4　進、出泥VSS變化Fig.4　VSS variations of inlet/outlet sludge

2.3VSS變化

污泥水解酸化過程中，強堿作用可以使污泥破碎以及胞外聚合物結構破壞，從而在釋放胞內外物質的同時實現污泥減量。圖4結果表明，系統(tǒng)運行過程中污泥減量效果明顯，平均污泥減量率為33.5%，這表明，污泥水解作用在強堿性條件下得到了強化，從而實現了良好的污泥減量[23]。這點與Yuan等[24]對污泥水解產酸過程中的污泥減量效果類似，其研究中實現了23%～40%的污泥減量。而Gao等[25]采用兩步堿性發(fā)酵產酸，最終實現了42.1%的污泥減量率，這是由于其采用兩級堿處理強化污泥的破解，從而達到了較本試驗更好的污泥減量率。盡管如此，本研究依然取得了可觀的污泥減量效果。

2.4系統(tǒng)菌群分析

圖5中的樣品分別為進泥（樣品A）和系統(tǒng)穩(wěn)定后的污泥（樣品B，第65天）。從圖中可知，樣品B的DGGE圖譜條帶數量減少，這表明在強堿（pH=10.0）條件下，一些無法耐受強堿的菌類被淘汰，從而使系統(tǒng)菌群的多樣性有所下降。

圖5　DGGE圖譜Fig.5　Profile of DGGE

樣品A的圖譜中，大多為生物脫氮除磷工藝的污泥中常見菌類，如動膠菌（條帶6，Zoogloea remigera）、硝化菌（條帶8，Candidatus nitrospira）、反硝化菌（條帶11，Azoarcus denitrificians）等。樣品B的圖譜中，條帶12、14、16、18、19亮度較高，代表了厭氧產酸反應器的主要微生物菌群。測序結果表明，條帶12、14分別為Clostridiales bacterium Z-810、Proteinivorax tanatarense strain Z-910，這兩種微生物均可在堿性厭氧條件下，利用蛋白質、二糖、丙酮等基質作為碳、氮和能量來源，用于產生直鏈或支鏈有機酸類物質[26]。條帶16、19均為Tissierella sp.，該類菌可以利用有機物代謝產生乙酸、丁酸、氨氮、CO2等物質[27]。條帶18為 Acetoanaerobium sp.，厭氧條件下可以利用H2和CO2產乙酸[28]。

DGGE結果亦表明，本研究中的厭氧堿性產酸系統(tǒng)優(yōu)勢菌類（條帶12、14、16、18、19代表微生物）均屬于Firmicutes（門），該菌門的許多微生物被認為是產酸作用的主要來源，這一結果在以往研究中已得到證實[11,21]。盡管如此，關于產酸系統(tǒng)菌群研究結果還是存在一定的差異，主要體現在產酸菌的種屬不同，如Chen等[21]研究系統(tǒng)中Clostridium spp.的存在為主要的產有機酸來源，而Jie等[29]則發(fā)現Pseudomonas sp.可能在VFAs積累過程中發(fā)揮重要作用。本研究中Clostridiales bacterium Z-810 sp.、Acetoanaerobium sp.則是系統(tǒng)產酸作用的主要功能菌，但該菌種在現有類似污泥產酸系統(tǒng)中未見報道，即本文的產酸菌類型與其他類似系統(tǒng)相比具有特異性。

上述結果證實了在pH=10.0條件下，厭氧產酸反應器內產酸菌占據了優(yōu)勢，該類菌可以充分利用剩余污泥堿性破碎、水解產生的溶解性有機物產揮發(fā)性有機酸，從而保證了系統(tǒng)良好的產酸性能。其中，Acetoanaerobium sp.的大量存在實現了發(fā)酵液中較高的HAc占比。

3　污泥堿性厭氧產酸性能對比

表2中列出了江蘇、哈爾濱兩個地方的污泥堿性厭氧產酸研究結果，以此分別作為華東和北方地區(qū)的代表。從表中可以發(fā)現，肇慶污水處理廠的污泥VSS/TSS值明顯低于上述其他兩地，更低的VSS含量使其厭氧水解產酸性能顯示出明顯差異。

眾所周知，在強堿抑制產甲烷菌活性的條件下，作為厭氧產酸的限制性步驟，系統(tǒng)SCOD主要來源于污泥破解釋放的胞內物質、污泥吸附的有機物和胞外聚合物（EPS）的解離，產生的SCOD隨即被產酸菌利用，從而轉化成揮發(fā)性脂肪酸。Li等[5]的研究中，進泥TSS和VSS濃度均高于本試驗，SCOD比產生速率（0.426）亦明顯高于本試驗結果（0.319）。分析認為，該差異主要是由于VSS更高，污泥中水解酸化菌數量更多，同時，污泥自身、胞外及吸附的可利用有機物（如EPS中有機物含量等）更多[11,30]。在強堿破解和水解酶作用下，胞內外結構破壞后可釋放更多的有機物進入液相中，并迅速被更多的水解酸化菌利用。因此，本試驗更低的VSS含量使SCOD比產生速率較低，對應的VFAs比產生速率亦更低（0.214）。盡管如此，本試驗的VFAs/SCOD、HAc/VFAs比值均更高。

與Li等[11]的研究相比，兩者進泥TSS差別不大，但本試驗中污泥VSS/TSS更低，即有機質含量更低，因此，對應的SCOD、VFAs比產生速率更小，發(fā)酵液中多糖、蛋白質濃度亦明顯更低。兩者的VFAs/SCOD比值相差不大，但是本文中HAc/VFAs明顯更高。

表2　污泥厭氧產酸性能對比Table 2　Comparison of anaerobic VFAs production

值得一提的是，盡管本研究中的SCOD、VFAs比產生速率較其他兩研究更低，但是VFAs/SCOD、HAc/VFAs比值卻更高，這可能跟系統(tǒng)菌群結構有關。即由于各研究的試驗地點不一樣，不同地區(qū)的污泥物化性質、有機質含量及組分構成等必然存在差別，即使控制相同的運行條件（如SRT、pH等），系統(tǒng)的產酸菌數量、產酸菌類型等依然可能存在差別（如本研究中的產酸菌類型就與其他研究不同），而不同產酸菌的生理特性（如比生長速率、底物利用能力等）會存在差異，最終使各研究結果（VFAs含量、VFAs組分占比）不一樣。這方面需要該領域研究人員進行進一步的研究，揭示不同污泥堿性產酸菌的特性差異。

4　結　論

（1）采用半連續(xù)式反應器進行污泥堿性產酸（pH=10.0，SRT=8 d），系統(tǒng)發(fā)酵液中VFAs-COD 占SCOD的比重較大，平均占比73.89%，該結果高于其他同類研究2%～15%，可以實現良好的產酸效果。發(fā)酵液VFAs組成成分中，乙酸和丙酸為主要成分，分別占VFAs的比重為51.43%、20.98%，高于現有同類研究結果。

（2）剩余污泥產酸過程中，系統(tǒng)取得明顯的污泥減量效果，減量率達到33.5%。

（3）剩余污泥產酸體系中優(yōu)勢菌群為Acetoanaerobium sp.、Clostridiales bacterium Z-810、Proteinivorax tanatarense strain Z-910、Tissierella sp.，該菌群結構保證了系統(tǒng)具有良好的產酸性能。其中Acetoanaerobium sp.、Clostridiales bacterium Z-810在同類研究中暫無報道。

（4）盡管南方地區(qū)冬季溫度較華東和北方地區(qū)更高，但是溫度對系統(tǒng)性能影響依然明顯，在實際應用過程中，應充分考慮控溫系統(tǒng)的設計，以保持在冬季低溫時（＜20℃）穩(wěn)定的水解產酸效果。

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Mechanism and microbial community analysis of anaerobic acid production (VFAs) by low carbon sludge in South China at alkaline condition

YAO Chuang1，LIU Hui2，LUO Xiaodong1，YUE Jianxiong1，LI Shiyao1，CHEN Dazhi1
(1Guangdong Research Institute of Engineering and Technology，Guangdong Provincial Key Laboratory of Water Environment Pollution Control，Guangzhou 510440，Guangdong，China;2School of Environmental Science and Engineering，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，Guangdong，China)

Abstract:Nowadays，the researches of VFAs production by excess sludge focused mainly on the utilization of the excess sludge from wastewater treatment plant (WWTP) in east and north areas of China，and few on the sludge in south China. Meanwhile，the related on-site experimental research for VFAs production property by sludge from WWTP in south China was rarely reported. Research on VFAs production by excess sludge was conducted at alkaline condition by semi-continuous anaerobic reactor，which was located at Dinghu wastewater treatment plant in Zhaoqing，Guangdong Province. The results showed that great hydrolysis and acidification properties of the system could be achieved at alkaline condition (pH=10.0). The percentage of VFAs-COD/SCOD was 73.89% in average，which was about 2%—15% higher than that of existing similar researches. Meanwhile，only small amount of polysaccharide and protein were accumulated (5%—15% of SCOD). Acetic acid was the maincomponent of VFAs with the proportion of 51.43%. And the dominant microbial species in the system were all nearly acid production microorganisms including Acetoanaerobium sp.，Clostridiales bacterium Z-810，Proteinivorax tanatarense strain Z-910 and Tissierella sp.，among which Acetoanaerobium sp. and Clostridiales bacterium Z-810 were not reported in other similar researches. The excess sludge reduction rate of 33.5% could be achieved.

Key words:excess sludge; alkaline fermentation; SCOD; VFA; sludge reduction; microbial community

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151230

中圖分類號：X 703

文獻標志碼：A

文章編號：0438—1157（2016）04—1565—07

基金項目：廣州市科技計劃項目科學研究專項（一般項目）（201510010283）。

Corresponding author:CHEN Dazhi，gyshuanjing@163.com