西門塔爾牛HDAC1基因SNP檢測及其與屠宰性狀的相關(guān)性分析

楊 穎，施巧婷，陸 江，石德順，徐照學(xué)，李湘萍

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.河南省農(nóng)科院畜牧研究所，河南 鄭州 476800；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院麻醉學(xué)研究所/湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

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西門塔爾牛HDAC1基因SNP檢測及其與屠宰性狀的相關(guān)性分析

楊 穎1，施巧婷2，陸 江3，石德順1，徐照學(xué)2，李湘萍1

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.河南省農(nóng)科院畜牧研究所，河南 鄭州 476800；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院麻醉學(xué)研究所/湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

摘 要：通過對37頭西門塔爾牛第2條染色體上的組蛋白去乙?；?基因（HDAC1）的Intron 4-Intron 5、Intron 10-Intron 11和3′非翻譯區(qū)進(jìn)行克隆和序列分析，采用SSCP分析方法和PCR產(chǎn)物直接測序的方法，判定SNP基因型，并分析SNP基因型與屠宰性狀的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，西門塔爾牛的HDAC1基因Intron 4-Intron 5以及3′端非翻譯區(qū)沒有突變位點；在HDAC1基因Intron 10-Intron 11區(qū)存在1個突變位點，該突變位點位于測序結(jié)果的110 bp處，為A/G突變，其中AG雜合子頻率（48.6%）與純合子GG/AA頻率（51.4%）大致相當(dāng)，但G等位基因頻率（62%）遠(yuǎn)大于A等位基因出現(xiàn)的頻率（38%）。經(jīng)在37頭西門塔爾牛屠宰樣品中的背膘厚屠宰性狀比較，AA基因型個體的背膘厚顯著低于GG和AG型個體，提示G等位基因?qū)ιL具有正效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：西門塔爾牛；組蛋白去乙酰化酶1；單核苷酸多態(tài)性；屠宰性狀

在肉牛新品系的培育及品種改良試驗過程中，合理改善生長環(huán)境、飼養(yǎng)條件，可以改善肉牛胴體和肉質(zhì)性狀，提高養(yǎng)牛業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。但肉牛本身的遺傳基因特性同樣會對肉牛的生長狀況、屠宰性狀等產(chǎn)生顯著影響，例如基因突變、遺傳變異等［1］。組蛋白去乙?；福℉DAC）與基因的轉(zhuǎn)錄活性有著密切關(guān)系，轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)的核小體組蛋白呈高度乙?；?，而不活躍的染色質(zhì)呈去乙酰化狀態(tài)。組蛋白去乙酰化在基因轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、個體發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化中至關(guān)重要［2-6］。因此，我們試驗分析了西門塔爾牛HDAC1基因的核苷酸堿基多態(tài)性與屠宰特性之間的相關(guān)性，以期為西門塔爾牛的新品系的培育及品種改良等提供遺傳參考［7-11］。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品 37頭西門塔爾牛（北京金維畜牧有限公司提供），頸靜脈采血，加入抗凝劑抗凝，低溫運(yùn)回實驗室，-80℃保存。

1.1.2 常用試劑 DNA 抽提液：0.1 mol/L EDTA （pH8.0），10 mmol/L Tris·HCl（pH8.0），0.5%SDS，20 μg/mL 胰 RNA 酶，室溫保存。聚丙烯酰胺凝膠（30%，N，N′-甲叉雙丙烯酰胺∶丙烯酰胺=1∶29）：在1 L水中加入N，N′-甲叉雙丙烯酰胺20 g、丙烯酰胺580 g，定容至2 L。變性緩沖液：取二甲苯氰2.5 mg、0.01 mol/L EDTA 200 μL、溴酚蘭2.5 mg加入到9.8 mL去離子甲酰胺溶液中，最后加入甘油200 μL，4℃保存。實驗所用其他試劑盒緩沖液例如ACD抗凝劑、磷酸鹽緩沖溶液、Tris·HCl、TBE緩沖液、70%乙醇、TAE緩沖液等均根據(jù)分子克隆實驗指南配制。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR儀與冷凍高速離心機(jī)（Eppendorf，德國），凝膠成像儀（Syiglhr/1439，英國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 血液基因組DNA的提取 基因組提取具體操作步驟見《分子克隆試驗指南（第3版）》。提取的基因組DNA用分光光度計測定濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測后-20℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計 試驗所用的PCR引物（表1）使用Oligo6.0根據(jù)牛的HDAC1基因組序列（GenBank：AC_000159.1）設(shè)計，由上海生工公司合成。

表1 引物序列

1.2.3 SSCP-PCR PCR擴(kuò)增體系（12.75 μL）：ddH2O 5.50 μL、上游引物（10 pmol/μL）0.25 μL、下游引物（10 pmol/μL）0.25 μL、DNA 模板（500 ng/μL）0.50 μL、2×Taq Master Mix 6.25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，退火溫度（表1）下退火30 s，72℃延伸30 s，30～45個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物加入變性緩沖液，經(jīng)高溫變性后，于10%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，結(jié)果使用0.2%硝酸銀染色法染色觀察。

1.2.4 PCR產(chǎn)物回收、克隆、測序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收按照瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）說明書進(jìn)行操作。將回收PCR片段直接送往測序公司進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

DNA序列處理采用軟件Primer5、DNAstar、Clustalx1.83、Chromas以及在線軟件http：//www. ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/。參照文獻(xiàn)［1-2］所述方法，通過SAS統(tǒng)計軟件（Version 8.0）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。具體模型為：

式中，Y為性狀表型值，μ為平均值，G為基因型效應(yīng)（包括基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)），b為屠宰體重的回歸系數(shù)，X為屠宰體重，e為殘差。

2 結(jié)果與分析

2.1 西門塔爾牛HDAC1 Intron 4-Intron 5多態(tài)性

西門塔爾牛HDAC1基因Intron 4-Intron 5經(jīng)過PCR-SSCP分析后未檢測到核苷酸多態(tài)性（圖1）。PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序，采用Ebi在線軟件比對分析，結(jié)果證實在該西門塔爾牛群體中HDAC1 Intron 4-Intron 5沒有核苷酸多態(tài)位點（圖2）。

圖1 西門塔爾牛HDAC1 Intron 4-Intron 5 PCR-SSCP結(jié)果

圖2 混合DNA西門塔爾牛HDAC1 Intron 4-Intron 5測序峰

2.2 西門塔爾牛HDAC1基因3′非翻譯區(qū)多態(tài)性

通過PCR產(chǎn)物直接測序分析西門塔爾牛HDAC1 3′非翻譯區(qū)368 bp片段，經(jīng)測序結(jié)果的多重比較，未發(fā)現(xiàn)該片段具有單核苷酸多態(tài)性。部分測序峰見圖3。

圖3 混合DNA西門塔爾牛HDAC1 3′非翻譯區(qū)測序結(jié)果

2.3 西門塔爾牛HDAC1 Intron 10-Intron 11多態(tài)性

西門塔爾牛HDAC1 Intron 10-Intron 11經(jīng)PCR擴(kuò)增，276 bp產(chǎn)物回收后直接測序檢測該片段的核苷酸多態(tài)性。測序結(jié)果經(jīng)多重比較發(fā)現(xiàn)，在這個西門塔爾牛群體中，HDAC1基因Intron 10-Intron 11 第110核苷處有1個多態(tài)性位點，為A/G突變。結(jié)合測序峰圖判斷基因型分別為GG純合子、AA純合子和AG雜合子3種基因型 （圖4）。

2.4 西門塔爾牛HDAC1 Intron 10-Intron 11 A/G突變基因型頻率與基因頻率

圖4 西門塔爾牛HDAC1 Intron10-Intron11多態(tài)位點基因型測序結(jié)果

檢測該西門塔爾牛群體樣本HDAC1 Intron 10-Intron 11的第110 bp處的A/G多態(tài)性位點的基因型頻率和基因頻率發(fā)現(xiàn)，該群體中GG基因型占37.8%（14/37），AG基因型占48.6%（18/37），AA基因型占13.5%（5/37），AG雜合子頻率大于純合子頻率；G等位基因頻率為62%，大于A等位基因頻率38%。

2.5 西門塔爾牛HDAC1 Intron 10-Intron 11多態(tài)性位點與屠宰性狀關(guān)聯(lián)性分析

應(yīng)用SAS軟件，對西門塔爾牛HDAC1 Intron 10-Intron 11 A/G多態(tài)性位點的不同基因型與胴體重、大理石花紋等屠宰性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析和遺傳效應(yīng)估計。結(jié)果表明，AA基因型個體的背膘厚顯著低于GG和AG型個體，A基因加性效應(yīng)對西門塔爾牛背膘厚屠宰指標(biāo)影響顯著（表2）。

表2 西門塔爾牛HDAC1 Intron 10-Intron 11與屠宰性狀的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果

3 討論

西門塔爾牛是我國引進(jìn)的乳肉兼用型的典型品種，兼具奶牛和肉牛特點。本試驗在西門塔爾牛的HDAC1基因Intron 4-Intron 5、3′UTR片段中未發(fā)現(xiàn)SNP突變位點，在Intron 10-Intron 11的110 bp處發(fā)現(xiàn)存在A/G突變位點，為A/G突變，其中AG雜合子基因型頻率（48.6%）與純合子GG/AA基因型頻率（51.4%）大致相當(dāng)，但是G核苷等位基因頻率（62%）較A核苷等位基因頻率（38%）明顯占優(yōu)勢。將該核苷多態(tài)性與屠宰經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，具有G核苷等位基因（即AG基因型或GG基因型）的西門塔爾牛其屠宰性狀中的背膘厚指數(shù)要顯著優(yōu)于AA基因型純合的個體，可能HDAC1基因該位點的G等位基因為候選的優(yōu)良核苷基因［2-4］。這也可能是西門塔爾牛群體的背膘厚屠宰性狀存在差異的原因之一［7-10］。

屠宰性狀數(shù)據(jù)一般通過屠宰后測定獲得，用總體重、胴體重、大理石花紋、眼?。▽崪y）、眼肌（機(jī)測）、背膘厚（實測）、背膘厚（機(jī)測）、肌間脂肪（機(jī)測）等指標(biāo)作為后備牛選擇的重要依據(jù)［12-14］。據(jù)報道，HDAC1與豬的主要分割性狀（頰重、后腿重、肩部脂肪重）有顯著性聯(lián)系。HDAC1基因的多態(tài)性影響了豬的生長速度和生長性能指數(shù)、背膘厚和瘦肉率等性狀［15］。

本試驗在西門塔爾牛的屠宰性狀中，HDAC1基因Intron10-Intron11處，背膘厚（實測）性狀A(yù)A基因型個體均值分別與GG和AG基因型個體均值存在顯著差異；對加性效應(yīng)而言，背膘厚AA型均值低于GG和AG型，等位基因G對生長具有正效應(yīng)［2，16-17］。

在西門塔爾牛群體中，AG或GG基因型個體可以作為背膘厚（實測）的一個主要候選基因或分子標(biāo)記，選擇AG或GG基因型個體可使群體向背膘加厚、肉質(zhì)性狀良好的方向進(jìn)展。同時，本試驗從基因突變水平證實了HDAC1基因?qū)ξ鏖T塔爾牛的背膘厚等屠宰性狀的顯著影響，為西門塔爾牛育種工作中良好經(jīng)濟(jì)性狀的選擇增加了一個候選參考。

肉牛分子育種研究群體不穩(wěn)定，沒有固定的試驗群體，個體流動性較大，很多是農(nóng)民飼養(yǎng)的個體資料，追蹤驗證困難。為了充分說明候選基因SNP多態(tài)性與生長性狀、屠宰性狀等的相關(guān)性，必須加大樣本量進(jìn)一步研究［7-11］。我國沒有較大的、規(guī)?；娜馀ＳN場，樣本量的獲取很受限制，建議建立穩(wěn)定的育種核心群體。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Detection of gene HDAC1 SNP and its relationship with slaughtering traits in Simmental cattle

YANG Ying1，SHI Qiao-ting2，LU Jiang3，SHI De-shun1，XU Zhao-xue2，LI Xiang-ping1
（1. College of Animal Science and Techonlogy，Guangxi University，Nanning 530004，China；2. Livestock Breeding Research Institute，Henan Academy of Agricultural Science，Zhengzhou 476800，China；3.Anesthesia Research Institute，Hubei University of Medicine / Taihe Hospital of Affiliated of Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China）

Abstract：In this study，we cloned，sequenced and analyzed the regions of Intron 4-Intron 5，Intron 10-Intron 11 and 3'-non of gene Histone deacetylase 1 （HDAC1） on the second chromosomes in 37 Simmental cattles. By the methods of PCR-SSCP and sequencing analysis，we tried to judge and determine their SNP genotypes，and explore the relationship between SNP genotypes and slaughter traits in Simmental cattle. The results indicated that，there was no mutation on the regions of Intron 4-Intron 5 and 3'-non-translation of gene HDAC1 in Simmental cattle，but there was one mutation in the region of Intron 10-Intron 11 of gene HDAC1，and it located on the 110 bp polymorphism site of PCR sequencing result，it was a A/G mutation，the frequency of allele G （62%） was more than allele A（38%）. By comparison and analysis，it might be co-related between different allele A/G genotype on region of Intron 10-Intron 11 and backfat thickness （measured） of slaughtering traits of Simmental cattle. There was significantly lower backfat thickness （measured） of slaughtering traits in genotype of AA than that in genotype of GA or GG. According to the results，in this 110 bp location of region Intron 10-Intron 11 of gene HDAC1，allele G may perform a positive effect on the backfat thickness （measured） of Slaughtering traits in simmental cattle.

Key words：Simmental cattle；histone deacetylase 1；single nucleotide polymorphism；slaughtering traits

中圖分類號：S813.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1004-874X（2016）02-0128-05

收稿日期：2015-06-11

基金項目：國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-38）；教育部國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201210929004）；湖北醫(yī)藥學(xué)院自然科學(xué)研究基金（2011QDZR-2）；湖北醫(yī)藥學(xué)院2015年學(xué)科建設(shè)項目（學(xué)科英才）；十堰市科學(xué)技術(shù)研究與開發(fā)項目（14Y13）

作者簡介：楊穎（1983-），女，碩士，實驗師，E-mail：YangYing_1983@126.com

通訊作者：李湘萍（1966-），女，博士，教授，E-mail：190139129@qq.com