劉選明 彭玉沖 楊遠(yuǎn)柱 李懿星++夏妙林 王文文++林建中

摘要：水稻Os11g39000 為非典型的bHLH家族成員，其功能尚不清楚.酵母雙雜交實驗表明，轉(zhuǎn)錄因子Os11g39000可以形成同源蛋白聚合體.隨機(jī)結(jié)合位點篩選實驗表明，轉(zhuǎn)錄因子Os11g39000可以與DNA結(jié)合，并且其結(jié)合位點初步確定為TT/CG/CACC/GT/C.Os11g39000基因的組織表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，Os11g39000基因主要在葉片和根中表達(dá)，推測該基因可能在葉和根的發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮作用.水培實驗發(fā)現(xiàn)，該基因功能缺陷型轉(zhuǎn)基因株系的根長顯著短于野生型，表現(xiàn)出明顯的根部發(fā)育缺陷，表明Os11g39000在水稻根的發(fā)育中起調(diào)控作用.QPCR分析進(jìn)一步證明，功能缺陷型轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)生長素合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)量顯著上升，表明轉(zhuǎn)錄因子Os11g39000參與了水稻生長素的合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控.

關(guān)鍵詞：水稻；bHLH轉(zhuǎn)錄因子；Os11g39000；生長素

中圖分類號：S601 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

轉(zhuǎn)錄因子（tarnscription factor， TF）是能夠與目的基因上游特定DNA序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，又被稱為反式作用因子，通過與順式作用元件相互作用，從而保證目的基因以特定強(qiáng)度在特定時間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子[1].bHLH（basic HelixLoopHelix， 堿性螺旋環(huán)螺旋）轉(zhuǎn)錄因子是真核生物蛋白質(zhì)中的一個大家族，其成員在動植物界行使著多種重要的功能.例如，一個bHLH蛋白BPEp可以通過與生長素應(yīng)答因子ARF8相互作用調(diào)控擬南芥花蕊的早期發(fā)育[2].研究發(fā)現(xiàn)bHLH在光敏色素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞分化，應(yīng)答油菜素內(nèi)酯的基因表達(dá)等過程中都起著重要作用[3-5].

典型的bHLH結(jié)構(gòu)域包含大約60個氨基酸，由位于bHLH結(jié)構(gòu)域N端能夠結(jié)合DNA的basic區(qū)域和HLH區(qū)域組成[6].HLH區(qū)域包含兩個α螺旋，通過它們bHLH蛋白可以相互作用，形成同源或者異源蛋白聚合體[1， 7-8].一類以人類Id蛋白為代表缺少basic區(qū)域的HLH蛋白雖然不能夠與DNA直接相互作用，但是可以通過與其它bHLH蛋白的HLH區(qū)域形成特異的異源蛋白聚合體來抑制相應(yīng)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的活性[9-10].通過抑制像E這樣的bHLH蛋白，從而在細(xì)胞分化和發(fā)育過程中起到關(guān)鍵作用[11].在擬南芥中，發(fā)現(xiàn)一個HLH蛋白KIDARI，通過與一個在光調(diào)控過程中起作用的bHLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用來抑制該轉(zhuǎn)錄因子活性，從而調(diào)控植物生長發(fā)育[12].

隨著水稻全基因組測序的完成，利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，水稻中包含有167個bHLH轉(zhuǎn)錄因子，絕大多數(shù)成員功能未知.有研究表明，bHLH家族在水稻生長發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用，如Zhang[13]等發(fā)現(xiàn)一對參與BR下游的bHLH基因ILI1和PRE1可以通過形成異源二聚體的形式參與調(diào)控與BR相關(guān)的基因的表達(dá).ili1的水稻突變體表現(xiàn)出與使用BR處理時相同的葉片傾角的表型，過表達(dá)和RNA干擾的ILI1轉(zhuǎn)基因水稻株系都分別表現(xiàn)出了葉片傾角增加和減小的相反表型.ILI1和PRE1的相互作用導(dǎo)致了水稻葉片的直立.因此該家族蛋白功能的揭示將有助于豐富和完善水稻基因功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò).

本研究選取了一個水稻非典型的bHLH基因家族成員Os11g39000 基因進(jìn)行了初步的功能研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Os11g39000可以以同源蛋白聚合體的形式結(jié)合DNA，從而實現(xiàn)生長素（IAA）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，最終實現(xiàn)對水稻根部生長發(fā)育的調(diào)控.

1材料與方法

1.1生物信息學(xué)分析

利用TIGR（http：//tigrblast.tigr.org/tgi， Rice Genome Annotation Project）和NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov， National Center for Biotechnology information）數(shù)據(jù)庫獲得Os11g39000全長CDS序列、氨基酸序列及啟動子序列.通過基于隱馬科夫模型的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析數(shù)據(jù)庫SMART（http：//smart.emblheidelberg.de， Simple Modular Architecture Research Tool）對Os11g39000氨基酸序列比對分析，獲得Os11g39000蛋白的結(jié)構(gòu)域類型.同時，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）數(shù)據(jù)庫對Os11g39000起始密碼子ATG上游1 500 bp的啟動子序列進(jìn)行分析，預(yù)測該基因啟動子區(qū)域所存在的調(diào)控元件，根據(jù)調(diào)控元件推測其可能的調(diào)控途徑.

1.2載體構(gòu)建與功能缺陷型轉(zhuǎn)基因株系的獲得

以粳稻品種日本晴的cDNA為模板，利用Gateway方法，設(shè)計含有attB接頭的引物（F：5'CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGTCGAGCCGGCG3'； R： 5'CAAGAAAGCTGGGTCTTACATGAGTAGGCTACGGATGAGG3'），PCR克隆目的片段.PCR反應(yīng)程序為：98 ℃， 5 min；98 ℃，10 s；58 ℃，15 s；72 ℃，20 s；共35個循環(huán).利用BP ClonaseII （Invitrogen）經(jīng)BP重組反應(yīng)將PCR產(chǎn)物克隆到入門載體pDONR/Zeo，測序正確后，利用LR ClonaseII （Invitrogen）將Os11g39000克隆到玉米Ubiquitin啟動子驅(qū)動表達(dá)的pCAMBIA1301GWEAR表達(dá)載體中，得到N端添加轉(zhuǎn)錄抑制基序EAR的合成型轉(zhuǎn)錄因子[14]，并抑制目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性.

根據(jù)林建中等的水稻轉(zhuǎn)化方法[15]，將重組的pCAMBIA1301GWEAROs11g39000質(zhì)粒經(jīng)過電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，通過農(nóng)桿菌侵染水稻粳稻品種Kitaake的愈傷組織，獲得功能缺陷型轉(zhuǎn)基因株系Ubi：：EAROs11g39000.

1.3酵母雙雜交

pGADT7Os11g39000重組質(zhì)粒能夠編碼融合Os11g39000和GAL4激活域的蛋白，pGBKT7Os11g39000重組質(zhì)粒能夠編碼融合Os11g39000和GAL4結(jié)合域的蛋白，將兩個重組質(zhì)粒按照酵母手冊進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化，涂布于SD/Leu/Try平板上培養(yǎng).28 ℃培養(yǎng)2～3 d，挑選4～5個單克隆用無菌水混勻后涂布于SD/Leu/Try/His平板上，分析結(jié)果.為了進(jìn)一步檢測相互作用的真實性，同時參照COLONTECH說明書進(jìn)行濾紙顯色實驗.

1.4蛋白表達(dá)和隨機(jī)結(jié)合位點篩選

根據(jù)Liu等[14]的蛋白誘導(dǎo)純化方法，分別將pGEX4T1Os11g39000和pGEX4T1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），誘導(dǎo)表達(dá).離心收集菌體，超聲破碎，離心，谷胱甘肽瓊脂糖珠（Ferments）親合純化蛋白，SDSPAGE檢測.將已純化的重組蛋白保存，用于后續(xù)隨機(jī)結(jié)合片段篩選實驗.

根據(jù)Blackwell的方法[16]，使用引物RBSS4和CPDF4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到雙鏈隨機(jī)DNA片段并與結(jié)合目的蛋白的谷胱甘肽瓊脂糖珠室溫孵育10 min.使用DNA結(jié)合緩沖液洗滌離心，重復(fù)5次，最后加入30 μL蛋白洗脫緩沖液，洗脫后離心取上清為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，正向引物為RBSS3，反向引物為CPDF4，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果.重復(fù)6～8次，直到擴(kuò)增出目的條帶，然后將擴(kuò)增片段克隆至pMD18T載體（TaKaRa），測序.測序結(jié)果使用在線分析工具分析（http：//weblogo.berkeley.edu/）.引物見表1.

1.5植物材料種植、激素處理及取材設(shè)置

參照Lin等[17]水稻種子催芽及種植方法，用3%次氯酸鈉溶液對水稻種子表面消毒，37 ℃下種子吸脹處理48 h，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱催芽48 h.待種子露白后，用1∶1 000濃度的潮霉素（Hyg）溶液對種子進(jìn)行初篩，然后將陽性植株轉(zhuǎn)入1/2 MS培養(yǎng)液置于恒溫培養(yǎng)箱中（28 ℃，光照16 h/黑暗8 h）.

參照Song等[18]檢測基因時空表達(dá)的取材方法，分別對營養(yǎng)生長期和生殖生長期的水稻材料進(jìn)行取材.營養(yǎng)生長期的水稻材料取自溫室生長20 d的野生型水稻日本晴，分別取根、莖和葉3部分；生殖生長期的水稻材料取自大田內(nèi)灌漿時期的野生型水稻日本晴，分別取根、莖、葉、節(jié)間、葉鞘和幼穗等組織材料.液氮速凍，-80 ℃低溫保存.

參照Li等[19]植物生長素誘導(dǎo)基因表達(dá)檢測的方法， 將正常條件生長10 d的日本晴幼苗，轉(zhuǎn)入含有10 μmol/L生長素的水培溶液中，分別處理0，1，3，6和12 h并取材，-80 ℃保存.設(shè)置生長素濃度梯度為0，10-8，10-7，10-6和10-5 mol/L分別處理野生型材料Kitaake和功能缺陷型轉(zhuǎn)基因材料，處理7 d后觀察表型并統(tǒng)計分析.

1.6實時熒光定量PCR分析

按照RNAeasy Mini Kit （TaKaRa）試劑盒說明提取總RNA，然后利用Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit （TaKaRa）合成cDNA，用于實時定量PCR分析.利用Ferments 定量試劑盒（Ferments），Mx3000P儀器 （Stratagene）進(jìn)行PCR分析.實時熒光定量PCR反應(yīng)程序為：95 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；45個循環(huán).實驗重復(fù)3次，以持家基因OsACTIN1為內(nèi)參，Mx3000P軟件分析檢測基因的相對表達(dá)水平.定量PCR引物見表2.

2結(jié)果

2.1生物信息學(xué)分析與基因克隆

根據(jù)TIGR和NCBI數(shù)據(jù)庫的序列信息，設(shè)計引物，以水稻cDNA為模板克隆出和預(yù)測分子量大小相似的DNA片段（圖1（a））.測序發(fā)現(xiàn)該片段的序列和數(shù)據(jù)庫中預(yù)測相同，命名為Os11g39000.該基因的編碼序列含有306個核苷酸，編碼含102個氨基酸序列的蛋白質(zhì).利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析數(shù)據(jù)庫SMART對Os11g39000蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Os11g39000蛋白在第19～63個氨基酸區(qū)域包含一個HLH保守結(jié)構(gòu)域（圖1（b）），但是并沒有結(jié)合DNA的basic區(qū)域，因此Os11g39000是一個非典型的bHLH蛋白，單個的Os11g39000蛋白不能夠直接結(jié)合DNA片段.有研究表明bHLH蛋白可以通過HLH結(jié)構(gòu)域形成同源或異源聚合體行使功能[7-8].因此推測該蛋白可能是以蛋白聚合體的形式行使功能.

2.2Os11g39000蛋白與自身的相互作用

為了探究該編碼蛋白能夠形成同源蛋白聚合體，進(jìn)行了酵母雙雜交實驗.首先構(gòu)建了pGADT7Os11g39000重組質(zhì)粒和pGBKT7Os11g39000重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入AH109酵母中，同時用共轉(zhuǎn)pGADT7Os11g39000/pGBKT7，pGADT7/ pGBKT7Os11g39000和pGADT7/pGBKT7載體的酵母作為陰性對照，涂布于含有10 mmol/L 3AT的SD/Leu/Try固體平板，以及于含有10 mM 3AT的SD/Leu/Try/His固體平板.結(jié)果顯示只有共轉(zhuǎn)入pGADT7Os11g39000/ pGBKT7Os11g39000的酵母在含有10 mmol/L 3AT的SD/Leu/Try/His固體平板上繼續(xù)生長.濾紙顯色實驗也發(fā)現(xiàn)只有共轉(zhuǎn)入pGADT7Os11g39000和pGBKT7Os11g39000重組質(zhì)粒的酵母可以顯色（圖2（a）），說明Os11g39000蛋白可以形成同源蛋白聚合體.

2.3Os11g39000蛋白的DNA隨機(jī)結(jié)合位點篩選

酵母雙雜交實驗證明Os11g39000蛋白可以形成同源蛋白聚合體，為了進(jìn)一步驗證Os11g39000蛋白形成的同源蛋白聚合體是否可以與DNA直接相互作用，構(gòu)建了pGEX4T1Os11g39000重組質(zhì)粒.將重組質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）并成功誘導(dǎo)純化了GSTOs11g39000重組蛋白（圖2（b））.DNA隨機(jī)結(jié)合位點篩選實驗.結(jié)果顯示，該蛋白可以通過形成同源蛋白聚合體與DNA片段直接相互作用，且直接結(jié)合的DNA片段為TT/CG/CACC/GT/C（圖2（c））.表明該蛋白可以通過HLH區(qū)域相互作用形成同源蛋白聚合體結(jié)合特定DNA片段，從而行使調(diào)控下游基因表達(dá)的功能.

2.4Os11g39000在水稻不同組織器官中的表達(dá)

基因的時空表達(dá)模式可以為預(yù)測和研究其生物學(xué)功能提供參考依據(jù).實時定量PCR分析Os11g39000基因在水稻不同組織器官中的相對表達(dá)量，表明該基因在苗期和抽穗期都主要在葉和根表達(dá)，其它的組織器官表達(dá)量極少（圖3（a），（b）），推測該基因可能參與植物根和葉的生長發(fā)育調(diào)控.

2.5轉(zhuǎn)基因植物鑒定與表型分析

利用嵌合抑制因子基因沉默技術(shù)[14，20]（chimeric repressor genesilencing technology CREST）及Gateway技術(shù)獲得了pCAMBIA1301GWEAROs11g39000重組質(zhì)粒（圖4（a））.通過農(nóng)桿菌侵染水稻Kitaake愈傷組織的方法，得到Os11g39000轉(zhuǎn)錄抑制型的轉(zhuǎn)基因株系，即該轉(zhuǎn)錄因子的功能缺陷型轉(zhuǎn)基因株系.通過DNA和RNA水平上的分子鑒定（圖4（b），（c）），篩選出2個陽性功能缺陷型轉(zhuǎn)基因株系Ubi：：EAROs11g3900010和Ubi：：EAROs11g3900011.水培實驗表明，轉(zhuǎn)基因株系Ubi：：EAROs11g3900010和Ubi：：EAROs11g3900011的根長比野生型的短，表現(xiàn)為明顯的根部發(fā)育缺陷（圖4（c），（d））.該結(jié)果表明，當(dāng)抑制Os11g39000的轉(zhuǎn)錄活性時嚴(yán)重干擾了水稻根部的正常生長發(fā)育，說明Os11g39000基因參與了水稻根部發(fā)育的調(diào)控.

2.6生長素對Os11g39000的表達(dá)調(diào)控

研究表明，生長素對植物根部發(fā)育具有顯著影響[21].利用Plant CARE數(shù)據(jù)庫對Os11g39000基因起始密碼子ATG上游1 500 bp的啟動子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因啟動子-792 bp處含有一個生長素應(yīng)答元件（圖5（a）），推測該基因功能可能與生長素有關(guān).實時熒光定量PCR分析表明，隨著生長素處理時間的延長，該基因表達(dá)量持續(xù)升高（圖5（b）），表明該基因表達(dá)受到生長素誘導(dǎo).同時，不同濃度生長素對野生型Kitaake和轉(zhuǎn)基因株系Ubi：：EAROs11g3900010和Ubi：：EAROs11g3900011處理7 d發(fā)現(xiàn)，隨著生長素濃度的升高，野生型根長受到明顯抑制，而轉(zhuǎn)基因株系根長沒有明顯變化（圖5（c），（d）），表現(xiàn)為對生長素不敏感，即抑制轉(zhuǎn)錄因子Os11g39000的轉(zhuǎn)錄活性干擾了植物對生長素的響應(yīng)，暗示該基因參與了生長素的相關(guān)途徑.

為了進(jìn)一步探究該基因?qū)ιL素生物合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和極性運(yùn)輸途徑的影響，選取這些途徑中的相關(guān)基因，檢測其表達(dá)量.結(jié)果表明，在功能缺陷型轉(zhuǎn)基因株系中，生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因OsARF23，OsARF24和生長素合成相關(guān)基因OsYUCCA1，OsYUCCA4的表達(dá)量顯著提高（圖6（a），（b））；生長素極性運(yùn)輸相關(guān)基因OsPIN1b和OsPIN2表達(dá)量沒有明顯變化（圖6（c））.該結(jié)果說明，Os11g39000基因的功能缺陷主要影響了生長素的信號傳導(dǎo)和生物合成途徑，而對于生長素的極性運(yùn)輸并沒有顯著影響，推測Os11g39000參與了生長素合成與顯著信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控.

3討論

bHLH蛋白通常通過HLH區(qū)域相互作用形成同源或異源蛋白聚合體行使對下游基因的調(diào)控[8].本研究發(fā)現(xiàn)，Os11g39000蛋白不能直接結(jié)合DNA的basic區(qū)域（圖1（b）），但Os11g39000蛋白可以通過形成同源蛋白聚合體來直接結(jié)合DNA片段，從而調(diào)控下游基因表達(dá)（圖2（a）～（c））.同時通過DNA隨機(jī)結(jié)合位點篩選實驗分析了該基因的直接DNA結(jié)合位點TT/CG/CACC/GT/C（圖2（c）），為深入研究Os11g39000蛋白的生理功能提供了重要線索.

分析基因在植物不同組織器官中的表達(dá)可以對該基因行使的功能進(jìn)行預(yù)測[22].通過QPCR分析發(fā)現(xiàn)Os11g39000基因主要在水稻葉和根中表達(dá)（圖3（a），（b）），暗示該基因可能參與植物葉和根的發(fā)育.水培實驗發(fā)現(xiàn)，功能缺陷型轉(zhuǎn)基因株系的根相對于野生型明顯變短（圖4（d），（e）），證實了該基因在根發(fā)育過程中起作用.但葉片中我們沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異，對于該結(jié)果還有待進(jìn)一步研究.

bHLH基因家族在動植物界廣泛存在且行使多種多樣的功能，已知 PIF3，PIF4，HFR1在光敏色素信號傳導(dǎo)中起作用，SPT和ALC與雌蕊發(fā)育有關(guān)，AMS在花粉粒發(fā)育中起作用，AtMYC2與脫落酸誘導(dǎo)的基因表達(dá)有關(guān)[23].植物激素是調(diào)控植物生長發(fā)育的重要因子.生長素影響植物生長發(fā)育的各個方面，包括細(xì)胞分裂與生長，細(xì)胞分化，頂端優(yōu)勢，根的向地性等[24].本研究通過Plant CARE對Os11g39000基因的啟動子順式元件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該基因啟動子區(qū)域存在生長素響應(yīng)元件（圖5（a））.Os11g39000基因的表達(dá)受到生長素誘導(dǎo)并且隨著生長素處理時間的延長，該基因的表達(dá)量顯著提高（圖5（b））.不同濃度的生長素對轉(zhuǎn)基因株系處理發(fā)現(xiàn)其根長對生長素不敏感（圖5（c），（d）），說明該基因的表達(dá)受到生長素的調(diào)控.為了進(jìn)一步研究該基因?qū)ιL素途徑的影響，對功能缺陷型轉(zhuǎn)基因株系中生長素的相關(guān)基因進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和合成相關(guān)的基因表達(dá)量顯著提高（圖6（a），（b）），表明抑制轉(zhuǎn)錄因子Os11g39000的轉(zhuǎn)錄活性主要影響了生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和合成途徑.這些結(jié)果表明，Os11g39000是生長素對植物調(diào)節(jié)途徑中的相關(guān)基因，為進(jìn)一步闡明Os11g39000的作用機(jī)理奠定了良好的基礎(chǔ).

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