王心倩，孫　妍，占衛(wèi)紅，雷　航，陳高瞻，余曉麗

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢430023)

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結(jié)核分枝桿菌 Rv3607c T細胞表位分布情況預(yù)測及分析

王心倩，孫妍，占衛(wèi)紅，雷航，陳高瞻，余曉麗

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢430023)

摘要：為了預(yù)測和分析結(jié)核分枝桿菌( MTB) Rv3607c抗原的 CD4+T以及CD8+T 細胞表位的分布狀況，首先在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取抗原的氨基酸序列，然后使用BLAST并與人類蛋白進行同源比對；之后使用NetMHC數(shù)據(jù)庫預(yù)測并分析MTB的Rv3607c抗原的CD4+T細胞表位的分布狀況；再使用SYFPEITHI、NETCTL、BIMAS和NetMHC 在線預(yù)測分析MTB的Rv3607c抗原CD8+T細胞表位的分布狀況。結(jié)合兩個表位預(yù)測結(jié)果，篩選出最終表位肽段，為后續(xù)驗證試驗做準(zhǔn)備。其結(jié)果為：首先預(yù)測出MTB的Rv3607c抗原有4個CD8+T細胞候選表位；而CD4+T細胞表位的初步結(jié)果為強結(jié)合表位29個，弱結(jié)合表位183個。結(jié)合兩個表位預(yù)測并分析，最終篩選出2個優(yōu)勢表位肽段。最后預(yù)測出的T 細胞候選表位將作為結(jié)核病特異性診斷和抗結(jié)核多表位疫苗的研究根基。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；Rv3607c；T細胞表位分析

1引言

結(jié)核病是影響我國人民健康的最主要的重大傳染性疾病，是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的。據(jù)2015年WHO報[1]，2014年估算全球有960萬新發(fā)結(jié)核病病例，其中包括約540萬男性、320萬女性以及100萬的兒童，其中150萬人死于結(jié)核病，更不幸的是，HIV 共感染的不斷擴散、MDR-TB患者的不斷增多，愈加加劇了結(jié)核病的危害性。

目前，卡介苗( BCG)是唯一廣泛使用的疫苗，BCG對兒童具有較強的保護作用[2]，尤其是防止兒童重癥結(jié)核病的發(fā)生，如結(jié)核性腦膜炎。但是卡介苗對成年人的保護作用在降低[3]，并且有些人接種卡介苗后不能保證不感染結(jié)核病。隨著耐藥結(jié)核病的高發(fā)，以及各種抗結(jié)核藥物的較大毒副作用，使得結(jié)核病的發(fā)病率以及死亡率不斷攀升。理想的抗結(jié)核藥物應(yīng)當(dāng)具有抗病高效性以及快速殺菌活性，并且價格低廉。

1998年，結(jié)核病的全基因序列被Cole等[4]破譯，分子病理學(xué)檢測技術(shù)也逐漸被應(yīng)用于結(jié)核病的檢查當(dāng)中，基因檢查技術(shù)也在結(jié)核分枝桿菌應(yīng)用非常廣泛，結(jié)核病研究也進入了基因組學(xué)新時代?？乖砦回撠?zé)與抗體或者細胞表面的抗原受體結(jié)合而發(fā)揮免疫效應(yīng)，即一個抗原分子的免疫活性區(qū)域。就目前所知，一個蛋白質(zhì)抗原的表位，包含B細胞表位、輔助性T細胞表位和細胞毒性T細胞表位、自然殺傷細胞表位等一些與免疫識別密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)，并且也包含了一些不利于保護性免疫作用的結(jié)構(gòu)。因此篩選和鑒定MTB蛋白抗原優(yōu)勢抗原表位對于通曉結(jié)合分支桿菌抗原引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)、深入了解結(jié)核分枝桿菌的致病機制、改進免疫學(xué)診斷方法以及新型疫苗開發(fā)具有相當(dāng)重要的意義[5]。

2材料與方法

2.1材料

在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得MTB的Rv3607c蛋白序列(Gene ID: 885345、133 aa)。

2.2同源性分析比對

在 NCBI中的 Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi )將Rv3607c的蛋白序列以及核酸序列與其他序列進行同源比對分析。登錄NCBI選擇protein Blast，然后選擇非重復(fù)蛋白序列Non-redundant protein sequences ( nr) 數(shù)據(jù)庫，并提交Rv3607c抗原序列，分析抗原序列與MTB復(fù)合群、非結(jié)核分支桿菌以及其他細菌的同源性；然后選擇人類Human，進行分析比對Rv3607c抗原序列與人蛋白序列的同源性。

2.3Rv3607c抗原的CD4+T細胞表位進行預(yù)測

登錄NetMHCⅡpan 3.1 Server ( http://www.cbs.dtu.dk/service/NetMHCⅡpan/)，該軟件可預(yù)測MHCⅡ中的三類分子HLA-DR、HLA-DR以及HLA-DR。預(yù)測分析時的限定條件選定為15個氨基酸殘基長度的多肽，HLA-DR亞型，對MTB Rv3607c抗原進行在線預(yù)測。NetMHCⅡpan 3.1 Server預(yù)測結(jié)果輸出依據(jù)親和力的強弱判定，認定親和值小于50 nm為強結(jié)合，親和值大于50 nm小于500 nm為弱結(jié)合。

2.4Rv3607c抗原的CD8+T細胞表位預(yù)測

2.4.1NetMHC表位預(yù)測

登錄NetMHC ( http://www.cbs.dtu.dk/service/NetMHC/)，該軟件可預(yù)測分析HLA-A、HLA-B、HLA-C以及HLA-E類別的MHC分子。由于絕大多數(shù)HLA分子偏向于與九個氨基酸長度的多肽有強結(jié)合，所以選擇氨基酸長度為9個，并選擇可能性最大的HLA-A 02 :01(A2 )以及HLA-A0301(A3 )兩類HLA分子作為限定條件[6]。其預(yù)測結(jié)果評定方法同NetMHCⅡpan 3.1 Server 。

2.4.2SYFPEITHI表位預(yù)測

SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/#userconsent#)是一個主要組織相容性復(fù)合體的數(shù)據(jù)庫，可以進行針對MHC等位基因的產(chǎn)物的配體進行預(yù)測。進入網(wǎng)站“http://www.syfpeithi.de/#userconse nt#”，選擇HLA- A* 02: 01、HLA- A* 03: 01兩類，多肽長度選為9 個氨基酸，提交抗原序列，記錄分析得分在前2%的多肽序列。

2.4.3BIMAS表位預(yù)測

進入BIMAS網(wǎng)站“http :// www - bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bin d/”，BIMAS是依據(jù)多肽分子與HLAⅠ類分子解離所用時間的一半進行排序，其分析結(jié)果是依據(jù)系數(shù)表推導(dǎo)的。選擇 A_0201、A3兩類HLA分子，多肽長度選為9 個氨基酸，而后輸入Rv3607c的氨基酸序列并提交，進行預(yù)測分析[7]。

2.4.4NetCTL表位預(yù)測

登錄NetCTL網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)，從Supertype網(wǎng)頁選擇類別中，選定A2和A3兩個超類型，Weight on C terminal cleavage值填寫為“0.15”，以及Weight on TAP transport efficiency填寫為“0.05”，Threshold for epitope identification填寫為“0.75”，而后輸入Rv3607c的氨基酸序列，進行在線預(yù)測。NetCTL 預(yù)測是通過人工網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)操作的，結(jié)果是以得分高低來分別顯示敏感度和特異度的高低。最后，對預(yù)測出的九個氨基酸的肽段，并且得分超過0.75的進行記錄分析[8]。

3結(jié)果

3.1Rv3607c抗原同源性比對結(jié)果

Rv3607c抗原與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(包括非洲分枝桿菌、減毒牛分枝桿菌、人型結(jié)核分枝桿菌、牛型結(jié)核分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)的同源性都達到100%；與非結(jié)核分枝桿菌的同源性為65%—83%，其平均值為74%，與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群相比，二者之間的同源性不如前者的高；與其他細菌平均值為65%。Rv3607c抗原序列與人類蛋白同源性比對結(jié)果匯總可見表1。從表1中可以看得出，Rv3607c抗原與人類蛋白相似性較低，并且同源性僅為46%。

表1人類蛋白同源性與抗原Rv3607c比較結(jié)果

蛋白最高評分期望值同源性/%Rv3607c29.65.146

從以上結(jié)果可以得出Rv3607c抗原與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的同源性相當(dāng)高，另一方面Rv3607c抗原與人類蛋白的同源性卻較低。因此認為，Rv3607c抗原有作為免疫性結(jié)核病疫苗的潛能，并且也有繼續(xù)進行預(yù)測分析實驗的必要性。

3.2Rv3607c抗原 T細胞表位結(jié)合預(yù)測結(jié)果

3.2.1Rv3607c抗原表位預(yù)測結(jié)果

使用NetMHCⅡ pan 3.1 Server對Rv3607c抗原的CD4+T細胞表位進行預(yù)測分析，過程中選擇在中國HLAⅡ分子中分布頻率較高的分子DRB1_0101、DRB1_0301、DRB1_0401、DRB1_0701、DRB1_0802、DRB1_0901、DRB1_1101、DRB1_1302、DRB1_1501作為限定條件，預(yù)測結(jié)果見表2。從預(yù)測結(jié)果可知，不同HLA分子結(jié)合數(shù)目大相徑庭，具體來說Rv3607c抗原與DRB1_0101強結(jié)合的數(shù)目明顯較多；與DRB1_1302結(jié)合的短肽數(shù)目最少。與不同HLA分子強弱結(jié)合的數(shù)目可見表2。

表2NetMHCⅡpan對Rv3607c抗原的CD4+T細胞表位分布的預(yù)測結(jié)果

HLAⅡ分子Rv3607c總肽段數(shù)118強結(jié)合肽段數(shù)弱結(jié)合肽段數(shù)DRB1_01011440DRB1_0301022DRB1_0401017DRB1_0701028DRB1_0802212DRB1_0901315DRB1_11011020DRB1_1302010DRB1_1501019

3.2.2Rv3607c CD8+T細胞表位預(yù)測結(jié)果

選擇在中國分布較廣的HLAⅠ分子， HLA-0201 和 HLA-0301作為限定條件，對Rv3607c抗原使用 NETCTL、SYFPEITH、NetMHC和BIMAS這4種不同在線預(yù)測軟件進行預(yù)測，并且綜合HLA-0201和HLA-0301的預(yù)測結(jié)果，匯總結(jié)果見表3。最后，綜合各種在線工具預(yù)測結(jié)果，Rv3607c抗原預(yù)測出4條抗原表位多肽。

表3不同在線預(yù)測工具對 Rv3607c抗原CD8+T 細胞表位的綜合分析

蛋白位置序列NETCTL親和值得分SYFPEITHI得分NetMHC親和值得分BIMAS得分29-37FVIDVTVWI0.82941.4115206.91強結(jié)合94.69247-55DLADTYDYV0.39870.724422453.57弱結(jié)合86.45856-64RLASRAAEI0.20680.548624214.31弱結(jié)合10.433106-114QTFDDVAVV0.52030.932322190.15弱結(jié)合13.819

3.2.3Rv3607c CD4+T和CD8+T細胞表位綜合分析預(yù)測結(jié)果

通過五種在線預(yù)測工具分別預(yù)測，得出Rv3607c抗原的CD4+與CD8+T細肽段。最后依據(jù)CD4+T細胞表位的肽段包含CD8+T 細胞表位的肽段的原則，預(yù)測篩選出抗原 Rv3607c有2 條肽段，結(jié)果見表4 。

表4Rv3607c抗原的CD4+T和CD8+T細胞表位綜合分析

蛋白序列CD8表位肽段CD4表位肽段47-61DLADTYDYVDLADTYDYVRLASRA106-120QTFDDVAVVQTFDDVAVVIRRSRR

4討論

在近幾年的研究中，許多特異性結(jié)核抗原被研究人員發(fā)現(xiàn)[9]，這一結(jié)果為結(jié)核病疫苗的研制提供了有價值的研究基礎(chǔ)。許多新的疫苗也在動物實驗中取得了較好的實驗結(jié)果，但是仍然存在許多T細胞所識別的MTB蛋白抗原有待開發(fā)，這些抗原表位對于T細胞的激活和應(yīng)答，包括參與抗MTB感染的免疫起到的重要作用是不容忽視的。在未來的研究中，我們還應(yīng)當(dāng)加大對其他MTB蛋白抗原的研究力度，并研制出更具有治療效用、簡單便捷的疫苗。

結(jié)核特異性免疫反應(yīng)極其需要有效的T細胞免疫應(yīng)答[10-11]。有研究表明，CD4+T細胞能夠產(chǎn)生細胞因子IFN-γ，并且該細胞因子對于實驗結(jié)核小鼠模型有極強的保護作用[12]。此外，通過對結(jié)核小鼠模型進行研究，實驗人員也證實了CD8+T細胞對特異性免疫應(yīng)答過程具有保護作用[13]。同時在艾滋病患者中，出現(xiàn)了代謝阻礙的CD4+T細胞會更容易感染結(jié)核病[14]，即結(jié)核病合并感染艾滋病[15]。有部分研究報道，實驗過程中發(fā)現(xiàn)受到結(jié)核分枝桿菌感染的患者體內(nèi)存在MTB特異性CD8+T細胞[16-17]，包括細胞毒性T細胞[18]以及自然殺傷性細胞[19]。到目前為止，還沒有研究人員對結(jié)核分枝桿菌Rv3607c所編碼的蛋白是否影響結(jié)核病的發(fā)病做出相關(guān)判斷。本研究由于材料的局限性以及其他各方因素的限制，無法做出更加精準(zhǔn)的判斷，只有通過進一步實驗，對Rv3607c的表位在結(jié)核病診斷所發(fā)揮的作用進行驗證包括測定其免疫保護作用的強弱，才能給出更加讓人信服的結(jié)論。

筆者預(yù)測分析是通過生物信息學(xué)的方法，并使用 SYFPEITH和INETCTL等在線預(yù)測軟件對 MTB的Rv3607c的CD8+T以及CD4+T細胞表位進行預(yù)測，最終分析預(yù)測結(jié)果得出優(yōu)勢抗原表位肽段，并且為之后驗證該抗原多肽段的特異性和敏感性做預(yù)備。預(yù)測過程中，使用NetMHC pan 2.1 Server 在線預(yù)測工具對CD4+T 細胞表位進行預(yù)測，再使用SYFPEITH對比其他3種在線預(yù)測工具預(yù)測結(jié)果得出Rv3607c抗原的CD8+T細胞表位有4個。最后，綜合CD8+T細胞表位和CD4+T細胞表位預(yù)測分析的結(jié)果，選取出2條多肽段(DLADTYDYVRLASRA、QTFDDVAVVIRRSRR)進行人工合成，為進一步的驗證實驗做準(zhǔn)備。

綜合以上實驗結(jié)果，筆者使用五種在線預(yù)測工具對MTB的Rv3607c抗原T細胞表位進行預(yù)測分析。這五種在線預(yù)測工具是根據(jù)Rv3607c的抗原表位多肽與不同等位基因結(jié)合能力強弱以及最終得分高低選取出最終優(yōu)勢抗原肽段。最終的實驗結(jié)果將作為后階段實驗的理論依據(jù)以及實驗基礎(chǔ)，確定了該抗原的實驗價值，為進一步的驗證實驗打下了良好的基礎(chǔ)。

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Prediction and analysis of T cell epitopes’s distribution of theMycobacteriumtuberculosisRv3607c

WANGXin-qian，SUNYan，ZHANWei-hong，LEIHang，CHENGao-zhan，YUXiao-li

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytecnic University,Wuhan 430023,China)

Abstract：To predict and analyze the distribution of CD4+T cell and CD8+T cell epitopes encoded by the Rv3607c ofMycobacteriumtuberculosis,We obtain the amino acid sequences by online NCBI database and analyze the homology between MTB complex and human proteins by BLAST,and predicting the distribution of CD8 T cell epitopes by SYFPEITHI、NETCTL、BIMASand NetMHC databases．After the predictiction，we can select the superior epitopes . For the results，there are 4 CD8+T cell epitopes candidates，29 strong and 138 weak candidate CD4+T cell epitopes candidates. In the end，two superior epitopes can be selected. Prediction of T cell epitopes will be the basis diagnosis of tuberculosis and the study of new tuberculosis vaccine.

Key words：Mycobacteriumtuberculosis;Rv3607c;T cell epitope analyze

收稿日期：2015-01-05.

作者簡介：王心倩(1993-)，女，碩士研究生，E-mail: wawawayyy@qq.com.

文章編號：2095-7386(2016)02-0036-04

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2016.02.006

中圖分類號：Q 93

文獻標(biāo)識碼：A